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(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科,湖南 衡陽(yáng) 421001)

·臨床醫(yī)學(xué)·

Toll樣受體4信號(hào)通路分子與慢性心力衰竭嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系分析

陳勁松，劉運(yùn)陽(yáng)，曾高峰，劉訪遙，黃冰，袁慧英

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科,湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的探討Toll樣受體4(TLR-4)信號(hào)通路分子變化與慢性心力衰竭(CHF)嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系。方法選擇本院收治的117例CHF患者(病例組)和同期109例健康對(duì)照者(對(duì)照組)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其外周血單核細(xì)胞中TLR-4、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)和髓樣分化因子(MyD88)的表達(dá)情況，分析它們與CHF的心功能分級(jí)、漿膜腔積液、再次入院和全因死亡的關(guān)系。結(jié)果病例組的外周血單核細(xì)胞的TLR-4、NF-κB和MyD88水平均顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)；不同NYHA分級(jí)CHF患者的TLR-4(F=4.026,P=0.032)、NF-κB(F=5.152,P=0.025)和MyD88(F=7.323,P=0.019)水平具有顯著差異；隨訪期間發(fā)生全因死亡患者的TLR-4(t=-2.149,P=0.033)和MyD88(t=-2.506,P=0.014)水平顯著高于未死亡者；TLR-4作為預(yù)測(cè)發(fā)生全因死亡的靈敏度和特異度分別為83%和77%，而MyD88分別為77%和71%。結(jié)論TLR-4信號(hào)通路分子與CHF的心功能密切相關(guān)，TLR-4和MyD88是潛在的全因死亡預(yù)測(cè)分子。

Toll樣受體4； 慢性心力衰竭； 心功能； 預(yù)后

心力衰竭(Heart failure)是由于心臟的收縮功能和(或)舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導(dǎo)致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動(dòng)脈系統(tǒng)血液灌注不足，從而引起心臟循環(huán)障礙癥候群，是心臟疾病發(fā)展的終末階段[1]。慢性心力衰竭(Chronic heart failure,CHF)則為持續(xù)存在的心力衰竭狀態(tài)，此時(shí)心肌的病理特征主要表現(xiàn)為神經(jīng)內(nèi)分泌的過(guò)度激活和心室肌的重塑[2]。研究表明，眾多炎癥因子和免疫因子在CHF的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，其中Toll樣受體信號(hào)通路相關(guān)分子就被證實(shí)與CHF的病理特征密切相關(guān)[3]。

Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR-4)分子是近些年發(fā)現(xiàn)與多種疾病發(fā)生相關(guān)的固有免疫系統(tǒng)識(shí)別病原相關(guān)分子模式的主要受體之一，而且其啟動(dòng)的信號(hào)通路還可調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[4]。在CHF的研究中，TLR-4被認(rèn)為參與了該疾病的發(fā)生，并且在患者受損的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，其信號(hào)通路上的其它重要分子核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)和髓樣分化因子(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)也同樣存在改變[5]，但TLR-4、NF-κB和MyD88分子的這種變化是否與CHF患者的病變狀態(tài)相關(guān)尚不明確，本文旨在探討TLR-4信號(hào)通路分子的變化與CHF嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系，以明確TLR-4信號(hào)通路分子用作判斷CHF患者病情的可能性。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇2014年6月～2015年5月期間本院心血管內(nèi)科和老年科住院病房收治的CHF患者作為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合慢性左心室心力衰竭的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②心功能分級(jí)明確；③自愿加入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并右心室功能受損；②合并感染、免疫系統(tǒng)疾病、肝腎功能不全、惡性腫瘤或精神障礙；③入組4周內(nèi)服用過(guò)非甾體類抗炎藥或類固醇激素。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)共計(jì)納入117例CHF患者，年齡46～83歲，平均67.6±12.4歲，其中男性68例，女性49例。入院時(shí)根據(jù)紐約心臟協(xié)會(huì)(NYHA)心功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]，I級(jí)19例、II級(jí)27例、III級(jí)34例、IV級(jí)37例。入院超聲心動(dòng)圖檢測(cè)合并漿膜腔積液者54例、未有積液者63例?；A(chǔ)疾病包括冠心病33例、心臟瓣膜病23例、擴(kuò)張型心肌病24例、高血壓性心臟病17例、其它類型20例，上述病歷均采用多種藥物聯(lián)合治療，包括利尿劑100例、ACEI類藥物67例、β受體阻滯劑55例、洋地黃類藥物49例。不同心功能分級(jí)患者組的年齡、性別、漿膜腔積液和基礎(chǔ)疾病類型上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。同時(shí)選擇109例健康體檢者作為對(duì)照組，年齡47～84歲，平均66.9±11.8歲，其中男性61例，女性48例。病例組和對(duì)照組在性別、年齡方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 TLR-4、NF-κB和MyD88檢測(cè)患者于入院時(shí)、健康體檢者入組時(shí)次日清晨空腹采集肘靜脈血20 mL，經(jīng)相應(yīng)處理后，應(yīng)用本院檢驗(yàn)科NAVIOS流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson Co.,Ltd.,US)檢測(cè)外周血單核細(xì)胞中TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白的表達(dá)情況。主要試劑為藻紅蛋白標(biāo)記的TLR-4單克隆抗體(eBioscience,12991742)、別藻青蛋白標(biāo)記的NF-κB單克隆抗體(BD Pharmingen,558422)、MyD88多克隆抗體(Abcam,119048)及其相應(yīng)的同型對(duì)照抗體。實(shí)驗(yàn)具體操作流程按照標(biāo)準(zhǔn)的試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3患者隨訪采用門診隨診和電話采訪等方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間3～10個(gè)月，中位隨訪期6個(gè)月，終點(diǎn)事件包括心力衰竭再次入院和全因死亡。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)管理和處理均在SPSS 18.0軟件中進(jìn)行。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白預(yù)測(cè)全因死亡的效果采用受試者工作特征曲線(ROC)進(jìn)行。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CHF患者的TLR-4、NF-κB和MyD88水平變化

病例組的外周血單核細(xì)胞的TLR-4、NF-κB和MyD88水平均高于對(duì)照組(P均<0.05)，見(jiàn)表1和圖1。

表1兩組病例的TLR-4、NF-κB和MyD88水平比較(%)

組別nTLR-4NF-κBMyD88病例組1176.17±3.066.20±2.9415.21±7.48對(duì)照組1090.91±0.620.33±0.259.76±6.14t17.61020.7725.962P<0.001<0.001<0.001

2.2 TLR-4、NF-κB和MyD88水平與心功能和漿膜腔積液的關(guān)系不同NYHA分級(jí)CHF患者的TLR-4(F=4.026,P=0.032)、NF-κB(F=5.152,P=0.025)和MyD88(F=7.323,P=0.019)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但無(wú)漿膜積液和有漿膜積液患者的上述三分子水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見(jiàn)表2。

圖1 流式細(xì)胞特征圖

表2TLR-4、NF-κB和MyD88水平與心功能和漿膜腔積液的關(guān)系

心功能nTLR-4(%)NF-κB(%)MyD88(%)NYHA分級(jí) Ⅰ級(jí)194.58±1.064.17±1.0912.18±3.29 Ⅱ級(jí)275.66±1.125.42±0.9614.20±4.37 Ⅲ級(jí)346.45±1.546.73±1.3215.34±4.25 Ⅳ級(jí)377.10±1.617.32±1.4417.38±5.02F4.0265.1527.323P0.0320.0250.019漿膜腔積液 無(wú)積液636.01±1.226.21±2.3014.95±4.24 有積液546.36±1.076.19±2.3515.51±5.06t-1.6210.050-0.655P0.1080.9600.514

2.3 TLR-4、NF-κB和MyD88水平與預(yù)后的關(guān)系

非再次入院患者和再次入院患者的TLR-4、NF-κB和MyD88水平比較差異無(wú)顯著性(P均>0.05)，但在隨訪期間發(fā)生全因死亡的患者其TLR-4(t=-2.149,P=0.033)和MyD88(t=-2.506,P=0.014)水平顯著高于未死亡者，見(jiàn)表3。

表3TLR-4、NF-κB和MyD88水平與預(yù)后的關(guān)系

預(yù)后nTLR-4(%)NF-κB(%)MyD88(%)再入院者 否956.06±1.846.11±2.5315.11±6.24 是226.65±0.986.59±1.8215.64±3.00t-1.441-0.837-0.389P0.1520.4040.698全因死亡 存活1126.07±2.426.12±2.5314.87±7.06 死亡58.41±0.787.99±1.0222.83±2.04t-2.149-1.643-2.506P0.0330.1030.014

2.4 TLR-4和MyD88預(yù)測(cè)全因死亡的效果發(fā)生全因死亡的患者和未死亡的患者其外周血單核細(xì)胞表達(dá)TLR-4和MyD88水平差異顯著，因此考慮將該分子作為判斷患者是否發(fā)生全因死亡的預(yù)測(cè)分子，由ROC曲線分析可知，TLR-4作為預(yù)測(cè)分子的靈敏度和特異度為83%和77%，而MyD88的靈敏度和特異度分別為77%和71%，見(jiàn)表4、圖2。

表4TLR-4和MyD88預(yù)測(cè)全因死亡的效果

分子曲線下面積95%置信區(qū)間截?cái)嘀奠`敏度特異性TLR-40.7770.671to0.8837.860.830.77MyD880.7900.685to0.89519.260.770.71

圖2 ROC曲線圖

3 討 論

研究表明Toll樣受體同時(shí)表達(dá)與免疫細(xì)胞和心肌細(xì)胞，介導(dǎo)了各種急性心肌損傷和慢性心臟病的發(fā)生發(fā)展，如心肌缺血的再灌裝損傷、心力衰竭的心肌重塑等[8]。本文探討了其家族中的知名分子TLR-4信號(hào)通路與CHF臨床特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TLR-4信號(hào)通路上的分子包括受體本身、NF-κB和MyD88均與患者的心功能分級(jí)密切相關(guān)，心功能越差者，其外周血單核細(xì)胞中的上述信號(hào)分子的表達(dá)率越高，但它的表達(dá)與患者是否存在漿膜腔積液無(wú)關(guān)，此外研究還發(fā)現(xiàn)TLR-4和MyD88與患者隨訪期間是否發(fā)生全因死亡相關(guān)，高比例表達(dá)者，更易發(fā)生死亡，因此研究進(jìn)一步分析了這兩種分子作為預(yù)測(cè)患者是否可能發(fā)生全因死亡的預(yù)測(cè)分子，結(jié)果顯示其靈敏度和特異度均在70%以上，而大于70%是臨床對(duì)于診斷指標(biāo)可接受的范圍。

關(guān)于TLR-4信號(hào)通路與心臟疾病的關(guān)系研究已有一些報(bào)道，關(guān)注的焦點(diǎn)最集中在發(fā)病率較高的心肌缺血性疾病，大多數(shù)研究都認(rèn)為包括冠心病在內(nèi)的心肌缺血性疾病都存在外周血單核細(xì)胞TLR-4及其相關(guān)分子的表達(dá)上調(diào)，而這種增高與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，并且這種升高也與炎性介質(zhì)TNF和IL-6等相關(guān)[9-10]。而動(dòng)物研究表明TLR-4基因敲除的小鼠，其心肌缺血損傷表現(xiàn)更輕，并且使心肌缺血模型小鼠服用TLR-4抑制劑后，病灶會(huì)有所好轉(zhuǎn)[11-12]。這些研究都直接指明TLR-4信號(hào)通路在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中的重要角色。對(duì)于心力衰竭，多項(xiàng)研究都認(rèn)為NF-κB可以客觀反映該疾病的心功能情況，并且可考慮用于評(píng)價(jià)心衰的嚴(yán)重程度[13-14]，該結(jié)果與本研究的結(jié)論一致，但是本研究還分析了TLR-4和MyD88分子，不僅發(fā)現(xiàn)它們與心力衰竭的心功能密切相關(guān)，并且還與全因死亡密切相關(guān)，而目前暫缺乏其它報(bào)道對(duì)該結(jié)論的證實(shí)。

綜上所述，本研究結(jié)果認(rèn)為TLR-4信號(hào)通路分子與CHF的心功能密切相關(guān)，TLR-4和MyD88是潛在的全因死亡預(yù)測(cè)分子，為臨床CHF心功能和預(yù)后的評(píng)價(jià)提供了全新的思路。但研究仍然存在不足，一方面由于醫(yī)院條件有限使得樣本量不夠充足，另一方面未能完全控制藥物使用等混雜因素對(duì)結(jié)果的干擾。此外，由于疾病譜并不單一、隨訪時(shí)間也有較大差異，這些都可能是結(jié)果的潛在影響因素，進(jìn)一步的研究還應(yīng)擴(kuò)大樣本量行分層分析。但即便有這些不足之處，研究結(jié)果也為臨床探討TLR-4信號(hào)通路與CHF的關(guān)系提供了重要數(shù)據(jù)參考。

[1] McMurray JJV,Adamopoulos S,Anker SD,et al.ESC Guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012[J].Eur J Heart Fail,2012,14(8):803-869.

[2] B?hm M.Chronic heart failure[M].Springer Science & Business Media,2012.

[3] Ogawa K,Hirooka Y,Kishi T,et al.Partially silencing brain toll-like receptor 4 prevents in part left ventricular remodeling with sympathoinhibition in rats with myocardial infarction-induced heart failure[J].PLoS One,2013,8(7):e69053.

[4] Chow JC,Young DW,Golenbock DT,et al.Toll-like receptor-4 mediates lipopolysaccharide-induced signal transduction[J].J Biol Chem,1999,274(16):10689-10692.

[5] 唐倫先,張華.Toll 樣受體 2/4 在心臟疾病中的作用研究進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版， 2012,6(12):3341-3343.

[6] 黃峻.慢性心力衰竭診斷和治療2012:現(xiàn)狀和進(jìn)步[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2012,33(1):1-5.

[7] Bennett JA,Riegel B,Bittner V,et al.Validity and reliability of the NYHA classes for measuring research outcomes in patients with cardiac disease[J].Heart Lung,2002,31(4):262-270.

[8] Moresco EMY,LaVine D,Beutler B.Toll-like receptors[J].Curr Biol,2011,21(13):R488-R493.

[9] 吳亞希,楊麗霞.Toll 樣受體4與心血管疾病的研究進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2016,37(1):58-61.

[10] Satoh M,Takahashi Y,Tabuchi T,et al.Circulating Toll-like receptor 4-responsive microRNA panel in patients with coronary artery disease:results from prospective and randomized study of treatment with renin-angiotensin system blockade[J].Clin Sci,2015,128(8):483-491.

[11] Liang CF,Liu JTC,Wang Y,et al.Toll-like receptor 4 mutation protects obese mice against endothelial dysfunction by decreasing NADPH oxidase isoforms 1 and 4[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2013,33(4):777-784.

[12] 謝雨君,黃瑋.Toll 樣受體2,4與心肌缺血再灌注損傷研究進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2013,34(2):240-240.

[13] 劉應(yīng)才,劉東華,潘金生.慢性心力衰竭患者外周血單個(gè)核細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子 кB/p65 的表達(dá)及白細(xì)胞介素-10 的影響[J].中國(guó)循環(huán)雜志,2006,21(6):431-434.

[14] 許錦榮,陳玲,曾堅(jiān),等.老年心力衰竭患者核因子-κB與心功能的關(guān)系[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(13):2080-2081.

TheRelationshipBetweentheToll-likeReceptor4SignalingPathwaysandtheSeverityandPrognosisofPatientswithChronicHeartFailure

CHEN Jinsong,LIU Yunyang,ZENG Gaofeng,et al

(DepartmentofCardiology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo explore the relationship between the Toll-like receptor 4 (TLR-4) signaling pathways and the severity and prognosis of patients with chronic heart failure (CHF).MethodTotal 117 patients with CHF treated during June 2014 to May 2015 and 109 healthy controls were recruited;TLR-4,nuclear factor kappa B (NF-κB) and myeloid differentiation factor (MyD88) expression in peripheral blood mononuclear cells were examined by flow cytometry;the associations of these factors with CHF of NYHA,effusion,readmission,and all-cause mortality were analyzed.ResultsTLR-4,NF-κB and MyD88 in patients group were higher than control group (P<0.05);patients with different NYHA have significantly different TLR-4 (F=4.026,P=0.032),NF-κB (F=5.152,P=0.025) and MyD88 (F=7.323,P=0.019) levels;TLR-4 (t=-2.149,P=0.033) and MyD88 (t=-2.506,P=0.014) in patients who died due to the disease during follow-up were significantly higher than those who had not died;TLR-4 as a predictor of all-cause mortality had sensitivity and specificity of 83% and 77%,while MyD88 had 77% and 71%.ConclusionTLR4 signaling pathway molecules closely related to cardiac function of patients with CHF,TLR-4 and MyD88 may be potential all-cause mortality predictions in that disease.

Toll-like receptor 4; chronic heart failure; cardiac function; prognosis

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.06.012

2016-07-13；

2016-09-28

R541.6

A

蔣湘蓮)