葉志東黃 迪黃 宇張 強(qiáng)麥振豪趙 俐古維立

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院 普通外科（廣州 510180）2 廣州消化疾病中心（廣州 510180）

B超彈性成像監(jiān)測(cè)下應(yīng)用吉西他濱耐藥乳腺癌細(xì)胞4T1構(gòu)建裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型

葉志東1，2黃 迪1，2黃 宇1張 強(qiáng)1麥振豪1趙 俐1，2古維立1，2

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院 普通外科（廣州 510180）2 廣州消化疾病中心（廣州 510180）

目的 構(gòu)建吉西他濱耐藥乳腺癌細(xì)胞4T1耐藥株并建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型。方法 采用低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)法，誘導(dǎo)吉西他濱耐藥乳腺癌細(xì)胞4T1耐藥株，命名為4T1/Gem；CCK-8法測(cè)定4T1與4T1/Gem細(xì)胞的增殖抑制率，計(jì)算耐藥指數(shù)；Western blot法檢測(cè)細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)；B超引導(dǎo)下注射4T1/Gem細(xì)胞懸液誘導(dǎo)裸鼠肝臟成瘤；HE染色觀察腫瘤組織病理情況，免疫組化法檢測(cè)瘤組織ER、PR、HER2、Ki-67和P-gp蛋白的表達(dá)。結(jié)果 經(jīng)過(guò)14個(gè)月的誘導(dǎo)成功建立4T1/Gem細(xì)胞株，可在含40μg/mL的Gem培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)。4T1/Gem細(xì)胞耐藥指數(shù)為4T1細(xì)胞的788.547倍。與親代相比，4T1/Gem處于G1期和G2期的細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少；上調(diào)P-gp蛋白的表達(dá)。4T1/Gem細(xì)胞成功建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，瘤組織中ER、PR、HER2蛋白陰性表達(dá)，Ki-67陽(yáng)性10%和P-gp蛋白陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論 成功構(gòu)建吉西他濱耐藥乳腺癌細(xì)胞4T1耐藥株并建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，為開(kāi)發(fā)治療乳腺癌肝轉(zhuǎn)移化療耐藥的藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

乳腺癌 吉西他濱 耐藥 P-gp蛋白 裸鼠成瘤

肝臟是晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌的重要靶器官。乳腺癌肝轉(zhuǎn)移預(yù)后極差，生存兩年以上的患者非常少。轉(zhuǎn)移性及復(fù)發(fā)性乳腺癌對(duì)化療的效果十分不理想［1］，化療耐藥問(wèn)題一直是乳腺癌治療的瓶頸。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型的研究不多，尤其是耐藥株引起的肝轉(zhuǎn)移模型。因此，為研究乳腺癌轉(zhuǎn)移合并耐藥機(jī)制，如何在裸鼠體內(nèi)建立耐藥的乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型是乳腺癌耐藥的研究難點(diǎn)［2］。因此，本文利用B超彈性成像監(jiān)測(cè)下應(yīng)用吉西他濱耐藥乳腺癌細(xì)胞4T1耐藥株并建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，為開(kāi)發(fā)治療乳腺癌肝轉(zhuǎn)移化療耐藥的藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞購(gòu)于中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，BALB/c裸鼠購(gòu)于廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，吉西他濱（禮來(lái)制藥）；CCK-8試劑盒（上海東仁化學(xué)科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基干粉、胎牛血清（美國(guó)Sigma公司）FACS Calibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；兔抗人P糖蛋白（P-gp）多克隆抗體（CST公司），周期試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱CCL-170A8（新加坡ESCO藝思高公司）；多功能酶標(biāo)儀（香港基因有限公司）；IX51倒置相差顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)與DMEM培養(yǎng)液中，內(nèi)含10%胎牛血清，1%雙抗液（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL），于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。細(xì)胞換液時(shí)間為2天，傳代時(shí)間為3～5天，傳代前用2.5 g/L的胰酶消化。

1.2.2 親代細(xì)胞的IC50值的測(cè)定 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的親代細(xì)胞，胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，按104個(gè)/孔接種于96孔板中，每孔加100μl，棄周?chē)蝗Ω募覲BS 100μl保持濕度，每組做5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%滿后，棄掉原培養(yǎng)基，以1×PBS輕輕沖洗一遍，加入不同濃度吉西他濱（0.01、0.1、1、10mg/mL）處理，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組（加培養(yǎng)基100μl）作為調(diào)零用途，24 h后加入CCK-8試劑，與培養(yǎng)基按1∶10的比例加入，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度OD值。細(xì)胞抑制率計(jì)算方法:抑制率=1-（加藥組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。計(jì)算親代細(xì)胞 IC50=0.0126mg/mL。

1.2.3 耐藥株的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)至70%滿時(shí)，加入終質(zhì)量濃度為0.001mg/mL（約1/13 IC50）的藥物培養(yǎng)液連續(xù)作用48 h，棄去上清液；加入不含藥物的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)后，消化傳代，再用含終質(zhì)量濃度為0.002mg/mL的藥物培養(yǎng)液連續(xù)作用細(xì)胞48 h。如此反復(fù)換液、傳代，逐步提高藥物的質(zhì)量濃度（mg/mL）（0.001→0.002→0.005→0.01→0.02→0.04），使細(xì)胞在含0.04mg/mL藥物培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)，最終獲得耐藥細(xì)胞4T1/Gem。

1.2.4 耐藥細(xì)胞IC50的測(cè)定 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的耐藥細(xì)胞，按照第二步方法測(cè)定耐藥細(xì)胞的IC50值，SPSS計(jì)算耐藥細(xì)胞4T1/Gem的IC50=9.9357mg/mL。

1.2.5 Western-blot檢測(cè)P-gp、ABCG2蛋白表達(dá) 分別收集親代和耐藥細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳（分離膠10%，濃縮膠5%），每孔加入50μg蛋白質(zhì)，恒壓100 V電泳至分離膠底部，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBST洗滌3次后，加入1∶1000稀釋的P-gp抗體，4℃孵育過(guò)夜，PBST洗滌3次，每次10min。再加入1∶2000稀釋的羊抗兔IgG HRP，振搖1 h，PBST洗滌3次，ECL試劑顯色、曝光并拍照，掃描后用IPP6.0圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值（Integral of optical density）分析。

1.2.6 B超引導(dǎo)下裸鼠成瘤 收集耐藥細(xì)胞4T1/Gem，用無(wú)菌PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/mL，制成細(xì)胞懸液，取0.1mL細(xì)胞懸液在B超引導(dǎo)下于裸鼠肝臟體外注射，共3只。維持適宜溫度和12 h晝夜交替節(jié)律，保證裸鼠可隨時(shí)進(jìn)食無(wú)菌飼料及飲用水。3周后，待B超鑒定腫瘤生長(zhǎng)位于肝臟后，常規(guī)處死，完整剪下肝臟組織，70%酒精洗凈組織后予以拍照，取同一部位肝臟約5 mm×5 mm×5 mm，以10%多聚甲醛固定石蠟切片，用于病理染色及免疫組化測(cè)定。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》、《廣州市第一人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理?xiàng)l例》及倫理要求。

1.2.7 腫瘤組織特性鑒定 常規(guī)HE染色后于顯微鏡下觀察，拍照保存。SAB免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中ER、PR、HER2、Ki-67及P-gp蛋白的表達(dá)，倒置相差顯微鏡下觀察，拍照保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用秩和t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功誘導(dǎo)4T1/Gem細(xì)胞株 經(jīng)過(guò)14個(gè)月的誘導(dǎo)成功建立4T1/Gem細(xì)胞株（圖1A，B），其可在含40μg/mL的Gem培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)。經(jīng)CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)不同濃度吉西他濱對(duì)細(xì)胞增值抑制情況（圖1C），4T1與4T1/Gem細(xì)胞24h時(shí)的IC50分別為0.0126mg/mL、9.9357mg/mL，耐藥細(xì)胞的耐藥指數(shù)（RI）為親代細(xì)胞的788.547倍。

2.2 P-gp蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示親代4T1細(xì)胞可以少量表達(dá)P-gp蛋白，4T1/Gem細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)明顯增加，為親代細(xì)胞的1.7倍（圖2 A，B）。

2.3 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)3只BALB/c裸鼠，3周后全部經(jīng)B超檢查確認(rèn)，全部裸鼠肝臟中長(zhǎng)出腫瘤（圖3A），B超下測(cè)量直徑為（0.75±0.06）cm。腫瘤大體形態(tài)外觀可見(jiàn)肝臟上有一個(gè)轉(zhuǎn)移瘤，大小約0.8cm×0.8cm。（見(jiàn)圖3B）

2.4 腫瘤組織特性鑒定 腫瘤組織HE染色結(jié)果見(jiàn)圖4A。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示ER（4B）、PR（4C）、HER-2（4D）表達(dá)陰性，Ki-67陽(yáng)性10%（4E），P-gp（4F）蛋白的表達(dá)陽(yáng)性，可在包膜或胞質(zhì)中間見(jiàn)到成棕黃色的陽(yáng)性區(qū)域。

3 討 論

乳腺癌是當(dāng)今危害婦女生命健康的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。隨著新的化療藥物的涌現(xiàn)及規(guī)范化的治療，早期乳腺癌患者的預(yù)后已經(jīng)有了顯著改善，無(wú)病生存期和總生存期已有了顯著提高，70%以上患者可以獲得長(zhǎng)期生存，但仍有30%的患者死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，平均生存期僅為18～30個(gè)月［3-4］。目前對(duì)晚期乳腺癌患者的治療收效甚微，臨床上極大多數(shù)晚期乳腺癌患者是經(jīng)過(guò)一線化療藥物治療的病例，后續(xù)的化療耐藥性明顯，且晚期復(fù)發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移的患者，轉(zhuǎn)移部位以內(nèi)臟或混合為主，化療后容易出現(xiàn)骨髓抑制［4］，因此，患者更愿意接受有效低毒適合長(zhǎng)期治療的方案。轉(zhuǎn)移性及復(fù)發(fā)性乳腺癌對(duì)化療的效果十分不理想，耐藥問(wèn)題一直是根治乳腺癌的瓶頸。

圖1 成功誘導(dǎo)4T1/Gem細(xì)胞株。A:親代4T1細(xì)胞，B:4T1/Gem細(xì)胞（AB均為HE染色20×）C:親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞增值抑制率，IC50（4T1）=0.0126mg/mL、IC50（4T1/Gem）=9.9357mg/mL，RI=788.547

圖2 4T1細(xì)胞和4T1/Gem細(xì)胞DR1基因和P-gp蛋白的表達(dá)。

圖3 裸鼠成瘤B超檢查。A示肝臟腫瘤形成，大小為0.86cm×0.73cm；B為腫瘤大體形態(tài)。

圖4 腫瘤組織特性鑒定.A為HE染色結(jié)果；B-F分別為ER、PR、HER2、Ki-67和P-gp蛋白免疫組化結(jié)果，其中ER、PR、HER2表達(dá)呈陰性，Ki-67的表達(dá)陽(yáng)性10%，P-gp蛋白的表達(dá)陽(yáng)性（箭頭所示）。

腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化學(xué)藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，稱多藥耐藥（Multidrug Resistance，MDR），是造成腫瘤化學(xué)藥物化療失敗的主要原因。耐藥腫瘤細(xì)胞株的建立是研究MDR發(fā)生機(jī)制和逆轉(zhuǎn)策略的重要手段。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者們用藥物遞增誘導(dǎo)法建立了不少耐藥腫瘤細(xì)胞株［5-7］，以深入研究腫瘤耐藥的機(jī)制。吉西他濱是一種核苷類(lèi)似物，對(duì)乳腺癌具有廣譜的抗腫瘤活性。對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期乳腺癌患者，吉西他濱在臨床上常與其他化療藥物相聯(lián)用，如與紫杉醇（GT方案）或順鉑（GP方案）聯(lián)用作為晚期一線用藥并顯示出很好的臨床療效［5-7］。但經(jīng)吉西他濱治療后仍有一大部分患者出現(xiàn)化療耐藥，導(dǎo)致治療失敗。在乳腺癌中吉西他濱耐藥的機(jī)制報(bào)道不多，具體機(jī)制仍待進(jìn)一步闡明。我們通過(guò)建立穩(wěn)定的乳腺癌細(xì)胞4T1吉西他濱耐藥株并建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，是開(kāi)發(fā)逆轉(zhuǎn)乳腺癌肝轉(zhuǎn)移化療耐藥的藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

我們采用低濃度加量持續(xù)誘導(dǎo)法即:使腫瘤細(xì)胞在低于其致死濃度的藥物中持續(xù)培養(yǎng)，然后逐漸增加藥物濃度，直至腫瘤細(xì)胞獲得穩(wěn)定的耐藥性，成功建立了乳腺癌4T1吉西他濱耐藥株（4T1/Gem）。經(jīng)過(guò)14個(gè)月的誘導(dǎo)，其可在含40 ug/mL的Gem培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)，耐藥細(xì)胞的耐藥指數(shù)（RI）為親代細(xì)胞的1088.3倍。經(jīng)過(guò)western blot法測(cè)定其表達(dá)耐藥蛋白P-gp發(fā)現(xiàn)，耐藥細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明產(chǎn)生了一定的耐藥性。我們通過(guò)B超彈性成像監(jiān)測(cè)下應(yīng)用吉西他濱耐藥乳腺癌細(xì)胞4T1構(gòu)建裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型。B超顯示小鼠肝臟中腫瘤形成，大小為0.7cm× 0.69cm（圖3），經(jīng)過(guò)鑒定發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織ER、PR、HER-2表達(dá)成陰性，Ki-67的表達(dá)陽(yáng)性10%，P-gp蛋白的表達(dá)成陽(yáng)性（圖4），結(jié)果說(shuō)明獲得的腫瘤組織具有三陰性乳腺癌的特性，并且具有一定的侵襲性和耐藥性。

我們成功構(gòu)建吉西他濱耐藥乳腺癌細(xì)胞4T1耐藥株并建立裸鼠乳腺癌肝轉(zhuǎn)移模型，為開(kāi)發(fā)治療乳腺癌肝轉(zhuǎn)移化療耐藥的藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。下一步，我們將進(jìn)行乳腺癌耐藥株逆轉(zhuǎn)藥物的篩選，以期開(kāi)發(fā)針對(duì)乳腺癌化療耐藥的靶向藥物。

［1］ZHANG J，WANG Z，HU X，et al.Cisplatin and gemcitabine as the first line therapy in metastatic triple negative breast cancer［J］.Int J Cancer，2015，136（1）: 204-211.

［2］SINGH A，SETTLEMAN J.EMT，cancer stem cells and drug resistance:an emerging axis of evil in the war on cancer［J］.Oncogene，2010，29（34）:4741-4751.

［3］HAGMANN W，JESNOWSKI R，LOHR JM.Interdependence of gemcitabine treatment，transporter expression，and resistance in human pancreatic carcinoma cells［J］.Neoplasia，2010，12（9）:740-747.

［4］MALLINI P，LENNARD T，KIRBY J，et al.Epithelialtomesenchymal transition:what is the impact on breast cancer stem cells and drug resistance［J］.Cancer Treat Rev，2014，40（3）:341-348.

［5］BERGMAN AM，PINEDO HM，PETERS G J.Determinants of resistance to 2＇，2＇-difluorodeoxycytidine（gemcitabine）［J］.Drug Resist Updat，2002，5（1）:19-33.

［6］ANDERSSON R，AHO U，NILSSON BI，et al.Gemcitabine chemoresistance in pancreatic cancer:molecular mechanisms and potential solutions［J］.Scand J Gastroenterol，2009，44（7）:782-786.

［7］KIM MP，GALLICK GE.Gemcitabine resistance in pancreatic cancer:picking the key players［J］.Clin Cancer Res，2008，14（5）:1284-1285.

Application of a gemcitabine-resistant variant of breast cancer cell line（4T1/Gem）to construct nude mouse models of breast cancer with hepatic metastasis under ultrasonic elastography

Objective To construct a gemcitabine-resistant variant of the breast cancer cell line（4T1/Gem）and establish a nude mouse model of breast cancer with hepatic metastatic. Methods A gemcitabine-resistant variant of the breast cancer 4T1 cell line was induced by gradually increasing the concentration of gemcitabine；this variant is referred to in this study as 4T1/Gem.The proliferation suppression rates of 4T1 and 4T1/Gem cells were determined by using the CCK-8 essay to evaluate the drug resistance indices of the cell lines.Western blot analysis was used to detect P-gp protein expression.Under ultrasonography，a 4T1/Gem cell suspension was injected into nude mice to induce liver tumors.H＆E staining was used to observe tumor pathology，and immunohistochemistry was used to detect the expression of ER，PR，HER-2，Ki-67，and P-gp. Results After 14 months of induction，a 4T1/Gem cell line is established successfully.The cell line can grow stably in culture liquid containing 40μg/ml gemcitabine.The drug resistance index of 4T1/Gem is 788.547.Compared with the 4T1 cell line，the 4T1/Gem cell line can upregulate P-gp protein expression and successfully establish a nude mouse model of breast cancer with hepatic metastatic.ER，PR，and HER-2 proteins exhibit negative expression in the tumor tissue.The positive expression of P-gp and 10%of Ki-67 proteins is also observed. Conclusion This study successfully constructs a gemcitabine-resistant variant of the breast cancer cell line（4T1/Gem）and establishes a nude mouse model of breast cancer with hepatic metastatic，thereby providing an experimental basis for developing and treating a drug-resistant variant of breast cancer.

Breast cancer；Gemcitabine；Drug-resistant；P-gp protein；Forming tumor in nude mice

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.01.017

2015-10-15）

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2011B061300024，2013B021800057）；廣東省自然基金項(xiàng)目（10151006001000013）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項(xiàng)目（20131A011029，20141A01003）；廣州市科技和信息化局科普專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（2014KP000086）

黃迪，E-mail：penguinzone＠163.com