李 鵬 陳凡帆 謝 偉 張 昊 鐘文軍 涂蘭波 曹志愷 全 偉

廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科（廣州 510180）

·論著·

海馬可溶性因子體外誘導分化大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞為膠質(zhì)樣細胞

李 鵬 陳凡帆 謝 偉 張 昊 鐘文軍 涂蘭波 曹志愷 全 偉

廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科（廣州 510180）

目的 探索內(nèi)源性神經(jīng)干細胞在大鼠海馬可溶性因子中的體外發(fā)育歸宿及分化鑒定。方法 顯微鏡下分離Wistar大鼠海馬組織放置于低溫DMEM/12培養(yǎng)基，低溫振蕩2小時后高速離心（15000 g），獲取實驗所用海馬組織可溶性因子。取材出生1天的Wistar乳鼠海馬中的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（endogenous neural stem cells，ENSCs），將ENSCs分別于含海馬可溶性因子終濃度為0（對照組）、50、100、200、400μl/mL的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天并每日觀察，使用免疫細胞化學、Western Blot印記技術(shù)比較各組ENSCs中Nestin、CD133的表達量；同時計量并比較各組ENSCs成球個數(shù)，以探索在模擬顱內(nèi)微環(huán)境情況下，ENSCs發(fā)育、歸宿及分化。進一步于最適宜的海馬可溶性因子終濃度中分化神經(jīng)球，對分化的細胞行神經(jīng)元特異性蛋白入（如：β-tubullin III、MAP2）及膠質(zhì)細胞特異性蛋白（如：GFAP、S100及p75 NGFR）免疫細胞化學檢測。結(jié)果 大鼠ENSCs在培養(yǎng)基中呈單細胞漂浮生長，球形；ENSCs于海馬可溶性因子各實驗分組中培養(yǎng)第2天呈細胞球狀態(tài)，對照組中無細胞球形成（與100μl/mL組比較，P1=0.00），100μl/mL組與對照組比較有統(tǒng)計學意義（P1=0.00＜0.05）；至第6天，在100μl/mL組中的細胞球數(shù)量明顯多于其余各組（P1’=P2’=P3’=P4’=0.00）。在免疫細胞化學檢測中，100μl/mL組中細胞球表達干細胞高親和蛋白Nestin、CD133陽性，Western Blot免疫印跡檢測其中Nestin、CD133蛋白高于對照組。進一步分化試驗中，細胞球呈貼壁生長的單細胞狀態(tài)、有突起伸出、長梭形，免疫細胞化學檢測分化的細胞表達膠質(zhì)細胞特異性蛋白GFAP、S100、p75NGFR陽性，但不表達神經(jīng)元特異性蛋白β-tubullin III與MAP2。結(jié)論 大鼠ENSCs在終濃度為100μl/mL的HSF作用下，可促進ENSCs的增殖分裂；ENSCs在同樣濃度下的HSF中可進一步分化為表達GFAP、S100、p75NGFR陽性的膠質(zhì)樣細胞；100μl/mL的HSFS是ENSCs的一種生理性誘導劑或參與促進ENSCs增殖、分化及通過細胞替代或因子分泌等機制修復神經(jīng)損傷。

海馬 可溶性因子 微環(huán)境 干細胞 膠質(zhì)樣細胞

內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（endogenous neural stem cells，ENSCs）是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中保留的具有自我更新、多向分化潛能的原始細胞，可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等［1］。因其免疫原性低、無致瘤性等生物學特性，給中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療點燃了無限希望。處于干細胞巢（stem cells niche）中的ENSCs在顱內(nèi)微環(huán)境（intrcranial microenviroment）的調(diào)節(jié)，在顱內(nèi)微環(huán)境中的增殖、分化及遷移等細胞行為學特點一直是神經(jīng)醫(yī)學領(lǐng)域研究的熱點及難點［2］。本研究分離大鼠腦組織海馬結(jié)構(gòu)，通過低溫振蕩、高速離心、滅菌等方法提取海馬可溶性因子（hippocampus soluble factors，HSF）。將ENSCs接種于含HSF不同終濃度的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基中，觀察在不同濃度的HSF中，ENSCs的形態(tài)學發(fā)育，并使用免疫細胞化學、western blot免疫印跡技術(shù)對發(fā)育的細胞進行鑒定，為模擬顱內(nèi)微環(huán)境探索ENSCs于宿主中的發(fā)育歸宿提供實驗基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 實驗所需動物均購買于南方醫(yī)科大學實驗動物中心。分別為:體重250 g的Wistar大鼠；出生3天以內(nèi)的Wistar乳鼠（動物合格證號:NO.44002100005375）。

1.2 實驗試劑 3.6%水合氯醛、Neurobasal培養(yǎng)基、DMEM/F12、EDTA、左旋胞嘧啶、木瓜蛋白酶、胰酶抑制劑、胎牛血清、0.01mol/L PBS、0.3%Triton X-100、山羊血清封閉液、兔抗Nestin（1∶200，sigma）、兔抗GFAP（1∶300，abcam）、兔抗 CD133（1∶200，Santa Cruz）、兔抗P75NGFR（1∶300，abcam）、兔抗 S100（1∶400，abcam）、兔抗MAP2（1∶300，sigma）、兔抗β-tubullin III（1∶400，abcam）、Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG（1∶200），Alexa Fluor 594標記羊抗兔IgG（1∶200）、1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、10%脫脂奶粉封閉液、PBST、DAPI防淬滅的封片劑等等。

1.3 海馬可溶性因子提取 選擇體重為250 g的Wistar大鼠，腹腔注射3.6%水合氯醛（1mL/100 g）后斷頭。低溫環(huán)境下將海馬結(jié)構(gòu)放置在離心管中，實驗過程中按每只大鼠的海馬結(jié)構(gòu)浸泡于2mL的冷DMEM/F12，在搖床中低溫振蕩2小時后，使用高速離心（15000 g，30min，4℃），經(jīng)過濾滅菌，分裝1mL/管，于-20℃保存。該方法已授權(quán)為國家發(fā)明專利（專利號:NO.201210492449.5.）。

1.4 內(nèi)源性神經(jīng)干細胞培養(yǎng) 選取出生1天的Wistar乳鼠1只，在顯微鏡下無菌取出大腦組織，置于含冷DMEM/高糖培養(yǎng)基的無菌皿內(nèi)，于顯微鑷下，切除小腦，盡量去除腦膜及血管，分離海馬，將分離所得海馬置于滅菌青霉素瓶內(nèi)；將含DMEM/F12、EDTA及木瓜蛋白酶的消化液加入青霉素瓶內(nèi)，將海馬組織碎片轉(zhuǎn)移到15mL離心管內(nèi)消化20分鐘后；使用胎牛血清及胰酶抑制劑終止消化，通過適當吹打松解細胞，盡量呈現(xiàn)單細胞狀態(tài)；經(jīng)500目網(wǎng)篩過濾，收取細胞并離心；棄上清液備用。

1.5 模擬顱內(nèi)微環(huán)境誘導干細胞成球?qū)嶒?收集上述取材的細胞接種于含海馬可溶性因子終濃度分別為0，50，100，200，和400μl/mL的DMEM/F12中培養(yǎng)4天。普通光鏡下觀察細胞形態(tài)學并計算在第2、6天各組細胞球數(shù)量。

1.6 神經(jīng)球免疫熒光鑒定 收集100μl/mL組中培養(yǎng)4天的細胞球移入2mLEP管中，依次進行0.01 mol/L PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定30min；0.01 mol/L PBS沖洗3次；0.3%Triton X-100破膜；正常山羊血清封閉1小時。滴加一抗:兔抗Nestin（1∶200，sigma）和兔抗CD133（1∶200，Santa Cruz）后，孵育過夜，經(jīng)PBS沖洗3次后；使用二抗（Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG（1∶200）和Alexa Fluor 594標記羊抗兔IgG（1∶200）孵育2小時，PBS沖洗3次；DAPI復染細胞核后涂片觀察。陰性對照試驗是以抗體稀釋液代替一抗，鏡下不顯色，便為陰性結(jié)果。

1.7 神經(jīng)球western blot鑒定 收集100μl/mL組中神經(jīng)球于2mLEP管內(nèi)，并加入細胞裂解液，提取細胞總蛋白，將處理好的樣品上樣并電泳，依次經(jīng)轉(zhuǎn)膜，封閉，PBST洗膜后，加入兔抗CD133（1∶1000，Santa Cruz）和兔抗Nestin（1∶1000，sigma）孵育2小時，再次同上述洗膜后；加辣根過氧化物酶標記二抗，再一次顯影、定影。

1.8 海馬可溶性因子分化神經(jīng)干細胞 收集100μl/mL組中培養(yǎng)4天的神經(jīng)球，移入含海馬可溶性因子100μl/mL、1%胎牛血清的DMEM/F12的24孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)并觀察神經(jīng)球的形態(tài)改變。

1.9 神經(jīng)干細胞分化后細胞鑒定 吸棄上述24孔板中的培養(yǎng)液，分別經(jīng)0.01 mol/L PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30min，破膜，山羊血清封閉1小時后。加入一抗:兔抗GFAP（1∶300，abcam）、兔抗P75NGFR（1∶300，abcam）、兔抗S100（1∶400，abcam）、兔抗 MAP2（1∶300，sigma）和兔抗β-tubullin III（1∶400，abcam），孵育過夜，經(jīng)PBS沖洗3次后；使用二抗（Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG（1∶200）和Alexa Fluor 594標記羊抗兔IgG（1∶200）孵育2小時，PBS沖洗3次；DAPI復染細胞核后涂片觀察。陰性對照試驗是以抗體稀釋液代替一抗，鏡下不顯色，便為陰性結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞于不同濃度海馬可溶性因子成球?qū)嶒灲Y(jié)果的分析采用One Way ANOVAs方法統(tǒng)計，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)干細胞形態(tài) Wistar乳鼠的海馬組織取材后接種于DMEM/F12無血清培養(yǎng)基時，細胞為球形，懸浮單細胞狀態(tài)，胞體透亮且小，邊緣光滑（圖1A，B）。

圖1 原代內(nèi)源性神經(jīng)干細胞單細胞懸浮狀態(tài)倒置相差顯微鏡A:100×，B:200×

2.2 神經(jīng)干細胞成球?qū)嶒?ENSCs在含不同濃度（0、50、100、200、400μl/mL）的 HSF的DMEM/F12中培養(yǎng)2天后，對照組（圖2A）中無細胞球形成［與100μl/mL組（圖2C）比較，P1=0.00（圖3A）］，與對照組比較，100μl/mL實驗組有顯著差異（P1=0.00＜0.05，圖3A）；至第6天，在100μl/mL組（圖2H）中的神經(jīng)球數(shù)量明顯多于其余各組（圖2F，J，I，J；圖 3B，P1′=P2′=P3′=P4′=0.00）。

圖3 內(nèi)源性神經(jīng)干細胞于不同海馬可溶性因子中第2天及第6天的成球?qū)嶒灦織l圖及統(tǒng)計學分析P1=P2=P3=P4=0.00＜0.05，P1′=P2′=P3′=P4′=0.00＜0.05

2.3 神經(jīng)球免疫熒光鑒定 在100μl/mL實驗組中形成的神經(jīng)球經(jīng)免疫細胞化學檢測，可見細胞表達神經(jīng)干細胞高親和蛋白 Nestin（圖4A）及 CD133（圖4B）陽性，而對照組中的細胞表達Nestin蛋白及CD133陰性，同時陰性對照中無Nestin及CD133表達（圖4C）。

2.4 神經(jīng)球western blot鑒定 在100μl/mL實驗組形成的神經(jīng)球與誘導前的ENSCs經(jīng)Western Blot法鑒定，結(jié)果顯示，誘導后的細胞可見神經(jīng)干細胞高親和蛋白CD133及Nestin高表達的條帶，CD133蛋白的分子量為120 kDa，Nestin蛋白的分子量為177 kDa，內(nèi)參為35kD的GAPDH（圖4D）。而未誘導的ENSCs表達的Nestin與CD133蛋白極其微量。

圖4 內(nèi)源性神經(jīng)干細胞于100μl/mL濃度的海馬可溶性因子中成球后熒光鑒定（nestin:A；CD133:B；陰性對照:C，藍色為DAPI核染）及western blot鑒定（D）

2.5 神經(jīng)干細胞于HSF中分化及免疫細胞化學鑒定 100μl/mL組中的神經(jīng)干細胞在終濃度為含100μl/mL的HSF、1%胎牛血清的DMEM/F12中繼續(xù)分化，接種2小時后，神經(jīng)球開始貼壁生長并伸出突起，3天后細胞呈細長梭形，突起變長（圖5A）。經(jīng)免疫細胞化學檢測，分化的細胞為表達GFAP（圖5D）、S100（圖5E）、P75 NGFR（圖5F）陽性的膠質(zhì)樣細胞，不表達神經(jīng)元特異蛋白MAP2（圖5B）和β-tubullin III（圖5C）。

圖5 內(nèi)源性神經(jīng)干細胞于含血清的100μl/mL濃度的海馬可溶性因子中分化為表達GFAP，S100，p75NGFR陽性（紅色）的膠質(zhì)樣細胞，不表達神經(jīng)元特異性抗體MAP2，β-tubullin。藍色為DAPI核染。熒光顯微鏡200×

3 討 論

神經(jīng)干細胞實驗及臨床研究一直是神經(jīng)醫(yī)學研究領(lǐng)域的熱點及難點。大量實驗結(jié)果證實，成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中存在神經(jīng)干細胞，這些存在自身的干細胞稱為內(nèi)源性干細胞［3］。內(nèi)源性干細胞所處的居所稱為干細胞巢，而干細胞巢的穩(wěn)定性有賴于所處的微環(huán)境，即由基質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)以及各種調(diào)控因子等共同構(gòu)成［4］。生理情況下，巢中干細胞常保持“睡眠”狀態(tài)，但病理過程時，受一些信號（如Wnt，Notch，bHLH等）激活后，神經(jīng)干細胞即發(fā)生增殖，遷移和分化等細胞行為。內(nèi)源性神經(jīng)干細胞對神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能重建具有巨大潛力［5］，為治療各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了廣闊前景。

本實驗經(jīng)提取大鼠的海馬中HSF體外模擬宿主細胞顱內(nèi)微環(huán)境，跟蹤ENSCs在體內(nèi)的發(fā)育及分化等歸宿。ENSCs在含HSF100μl/mL無血清DMEM/F12中發(fā)育為表達Nestin及CD133陽性的神經(jīng)干細胞。更重要的是，在該濃度的HSF中發(fā)育而成的神經(jīng)干細胞進一步分化為表達GFAP、S100、P75NGFR陽性且不表達神經(jīng)元特異蛋白βtubullin III和MAP2的膠質(zhì)樣細胞。故而，我們初步假設(shè)，在神經(jīng)組織受到創(chuàng)傷情況下，其微環(huán)境中沉默的單個神經(jīng)干細胞很可能發(fā)育、不斷增殖成神經(jīng)球并進一步分化成膠質(zhì)樣細胞，且膠質(zhì)樣細胞通過細胞替代或分泌營養(yǎng)因子，改善損傷灶周圍微環(huán)境而參與修復中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［6］。

海馬組織屬于大腦邊緣系統(tǒng)的一部分。海馬組織的微環(huán)境是神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞及干細胞均賴以生存的。所以探索ENSCs與顱內(nèi)微環(huán)境的相互作用，為神經(jīng)干細胞體內(nèi)增殖、發(fā)育及分化過程提供一定的實驗證據(jù)。近年來的研究主要聚焦在干細胞的遷移、再生、分化以及存活。本實驗結(jié)果簡而概之即:HSF用以模擬顱內(nèi)的微環(huán)境，被認為是一種復合的生理性誘導劑，其作用于ENSCs，能夠促進ENSCs分裂增殖，nestin與CD133蛋白的表達，并進一步分化為膠質(zhì)樣細胞［7］。其中潛在的機制可考慮:HSF中存在的某些蛋白或者小分子可激活誘導ENSCs分化為膠質(zhì)樣細胞的信號通路，因此該實驗誘導方法可能快速促進ENSCs發(fā)育成神經(jīng)干細胞，或者可考慮將HSF注射神經(jīng)損傷區(qū)域作為修復中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)疾病的一種參考方法［8］。因為分化的細胞是表達GFAP、S100、P75NGFR陽性的膠質(zhì)樣細胞，所以其優(yōu)勢可發(fā)揮在修復外周神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面。

本實驗的不足之處為實驗現(xiàn)象的潛在機制尚不明確，下一步擬對海馬HSF行質(zhì)譜分析，了解其中大部分蛋白質(zhì)成分，探索某些分子激活ENSCs的信號通路。

綜上所述，從海馬組織提取的的HSF，尤其是在濃度為100μl/mL作用于ENSCs時，即體外模擬顱內(nèi)微環(huán)境探索及驗證ENSCs的發(fā)育與歸宿；100μl/mL濃度的HSF可促進ENSCs的增殖分裂，且在該濃度中ENSCs可進一步分化為膠質(zhì)樣細胞。

4 結(jié) 論

大鼠ENSCs在終濃度為100μl/mL的HSF作用下，可促進ENSCs的增殖分裂，ENSCs在同樣濃度下的HSF中可進一步分化為表達GFAP、S100、p75NGFR陽性的膠質(zhì)樣細胞；100μl/mL的HSFS是ENSCs的一種生理性誘導劑或參與促進ENSCs增殖、分化及通過細胞替代或因子分泌等機制修復神經(jīng)損傷。

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Adult rat hippocampus soluble factors:a novel method mimicking intracranial microenvironment for tracing the induction and differentiation of endogenous neural stem cells in vitro

Li Peng，Chen Fanfan，Xie Wei，et al.Neurosurgery Department of Guangzhou First Hospital Affiliated Guangzhou Medical University

Objective The aim of this study was to explore induction and differentiation of endogenous neural stem cells（ENSCs）in the hippocampus soluble factors（HSF）from the hippocampus of adult Wistar rats by mimicking an intracranial microenvironment. Methods After Wistar rats sacrificed，the hippocampus tissue was obtained in cold DMEM/F12.After centrigued and filtered，the HSF was stored at-20℃.The ENSCs was obtained from the hippocampus tissue of a neonate Wistar rat.Collected the tissue，digested and obtained the ENSCs.After we observed the morphology，the ENSCs were cultured in different concentration（0、50、100、200、400μl/mL）of HSF for 6 days，and compared the expression of Nestin and CD133 by immunocytochemistry.Meanwhile，we compared the Nestin and CD133 protein by western blot.And then we explored the optimal concentration of HSF by the numbers of all groups on the second and sixth day.Furthermore，we did the differentiated experiment using the same concentration of HSF. Results The number of neurospheres in the 100μg/mL group was significantly higher than those in the other groups on the 6th day.Immunofluorescence revealed that the neurospheres from ENSCs in the 100μg/mL group more highly expressed nestin and CD133 than control.This result was confirmed by western blot analysis.The neurospheres can differentiate into glia-like cells in 100μg/mL HSF and 1%FBS expressing GFAP，S100 and P75 NGFR by immunofluorescence. Conclusion These data indicated that HSF alone，mimicking a destination of ENSCs in vitro，could induce and differentiate neurospheres from ENSCs，as a new method to get NSCs and glia-like cells differentiated from ENCs to repair thediseases of center nervous system.

Hippocampal；Soluble factors；Microenvironment；Stem cells；Glia-like cells

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.01.001

2015-09-29）

國家自然科學基金（81301098）

全偉，E-mail：zhimeng_li＠163.com