曲曉偉 尤耀東 張培海 李俊濤 常德貴

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中藥復(fù)方對(duì)ED大鼠海綿體Cx43的影響*

曲曉偉1尤耀東2張培海3李俊濤4常德貴5△

目的基于“肝藏”理論，從陰莖海綿體平滑肌縫隙鏈接蛋白Cx43角度研究疏肝養(yǎng)血法對(duì)肝郁血虛ED大鼠的干預(yù)作用。方法選取經(jīng)交配后證實(shí)有正常勃起功能的雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為空白組、模型組、疏肝養(yǎng)血組，每組10只，采用尾部放血和懸吊激惹方法配合低鐵飲食制備肝郁血虛勃起功能障礙模型，給以四物湯與逍遙散合方煎劑灌胃14天，末次灌胃24小時(shí)后處死大鼠，取陰莖海綿體組織，HE染色觀察陰莖海綿體組織病理學(xué)變化，免疫組化SP法檢測(cè)陰莖海綿體Cx43表達(dá)。結(jié)果與空白組相比，模型組陰莖海綿體組織病理學(xué)改變不明顯，陰莖海綿體平滑肌中Cx43表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，疏肝養(yǎng)血組陰莖海綿體平滑肌中Cx43表達(dá)顯著提高(P<0.05)。結(jié)論改善陰莖海綿體平滑肌中Cx43表達(dá)可能是基于“肝藏”理論，疏肝養(yǎng)血法治療ED的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制之一。

“肝藏”理論；勃起功能障礙；疏肝養(yǎng)血；Cx43

性生活是夫妻生活的重要組成部分，是人類(lèi)生存和繁衍的需要，男性勃起功能是影響性生活質(zhì)量的重要因素[1]。研究顯示，大約有52%的40～70歲男性存在不同程度的勃起功能障礙(Erectile Dysfunction，ED)，不和諧的性生活嚴(yán)重影響著家庭和睦和社會(huì)穩(wěn)定[2～4]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為男性勃起多與腎有關(guān)，故治療也多從腎論證，但目前效果不盡人意。我們前期臨床實(shí)踐表明[5，6]，ED患者大多表現(xiàn)為肝腎功能失調(diào)，從肝論治多獲良效。實(shí)驗(yàn)證明[7，8]，肝郁氣滯可致陰莖海綿體組織中5-磷酸二酯酶(PDE5)活性增強(qiáng)、一氧化氮合成酶(nNOS)活性下降，導(dǎo)致男性ED，而疏肝理氣活血中藥能逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程，改善病情，但對(duì)具體機(jī)制尚未研究。故本課題基于“肝藏”理論，運(yùn)用動(dòng)物模型，從陰莖海綿體平滑肌中縫隙鏈接蛋白Cx43角度研究疏肝養(yǎng)血法對(duì)肝郁血虛ED大鼠的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2.5月齡性成熟SD大鼠45只，體質(zhì)量370g～420g，雄性30只，雌性15只，由成都達(dá)碩生物科技有限公司提供，質(zhì)量合格證號(hào)：scxk(川)2013-24。每只雄性大鼠均經(jīng)交配后證實(shí)有正常勃起功能。實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于室溫(20±3.0)℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照12h∶12h(光∶暗)，自由攝食全價(jià)大顆粒飼料，飲水，適應(yīng)性馴養(yǎng)1周后使用。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備甲醛(由成都市聯(lián)合化工試劑廠生產(chǎn)，批號(hào)：201210101)；蘇木素(由上海華申康復(fù)器材有限公司提供，批號(hào)：20120822)；CX43試劑盒(由博奧森生物技術(shù)有限公司提供，貨號(hào)：北京bs-8987R)；生物素化山羊抗兔IgG(H+L)(由北京中山金橋生物有限公司提供，ZB-2010.LotV0527)；生物素化山羊抗小鼠IgG(H+L)(由北京中山金橋生物有限公司提供，ZB-2020.LotV0522)；DAB(由北京中山金橋生物有限公司提供，Kit ZL1-9032 Lot753223A)；倒置顯微鏡(由日本OLYMPUS公司生產(chǎn))；Motic BA400顯微攝像系統(tǒng)(由麥克奧迪公司生產(chǎn))；Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)(由Media Cybernetics，Inc.生產(chǎn))。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物白術(shù)、茯苓、柴胡、當(dāng)歸、白芍、甘草、生姜、薄荷、熟地黃與川芎中藥材均購(gòu)自成都同仁堂藥店，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李敏教授鑒定，各藥材均符合《中國(guó)藥典》(2010版第一部)藥品相關(guān)項(xiàng)目檢查。四物湯、逍遙散參照《方劑學(xué)》教材確定劑量[9]，四物湯藥物組成與劑量如下：熟地黃12 g，當(dāng)歸9 g，川芎6 g，白芍9 g；逍遙散藥物組成與劑量如下：柴胡15 g，當(dāng)歸15 g，白術(shù)15 g，白芍15 g，茯苓15 g，炙甘草7.5 g，生姜3 g，薄荷3 g。四物湯與逍遙散合方根據(jù)上述劑量加合。分別按上述劑量配比稱(chēng)取四物湯與逍遙散合方的藥材，置于溶器中，加8倍量水，浸泡30 min后，煎煮30 min，過(guò)濾，共煎2次，合并濾液，60℃水浴濃縮為1∶1(即每毫升藥液含原生藥1 g)藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組選取雄性SD大鼠30只，數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組、疏肝養(yǎng)血組，每組10只。

1.2.2 造模及給藥除空白組外，其余各組動(dòng)物參照文獻(xiàn)[10～13]方法，采用尾部放血和懸吊激惹方法配合低鐵飲食制備肝郁血虛模型。具體操作方法如下：75%酒精消毒尾部后，手術(shù)刀在尾部橫向割開(kāi)約3mm創(chuàng)口，擠壓放血2ml/只，常規(guī)消毒創(chuàng)面并包扎，隔2天1次，連續(xù)5次。放血后休息2h(當(dāng)天如果沒(méi)有被動(dòng)失血操作，則直接進(jìn)行懸吊激惹)，將大鼠尾部綁縛在固定物上，使其懸空倒吊于20 cm 深，溫度為(20±2)℃的水面上，以大鼠前肢剛接觸水面為每只大鼠適宜的懸吊高度。同時(shí)用小木棍激惹大鼠，使其極度緊張與恐慌，而又無(wú)法發(fā)泄。懸吊激惹每天1次，連續(xù)14天，每次30 min，以后每2 天增加10 min。造模大鼠均飼喂低鐵飼料(配方：玉米淀粉54%，奶粉40%，豆油5%，食鹽1%)。造模的第1天開(kāi)始，在懸吊結(jié)束后1 h，疏肝養(yǎng)血組動(dòng)物給予灌胃四物湯與逍遙散合方煎劑12.96g/kg，空白組、模型組給予灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)14天。

1.2.3 標(biāo)本取材末次給藥24 h后，大鼠脫頸椎處死，在下腹正中低位切口，迅速剖取大鼠的陰莖組織，并將其立即置于冰上，快速分離大鼠的陰莖海綿體組織，用冰冷生理鹽水中洗凈殘留血液后，置入10%中性甲醛溶液中固定供制作標(biāo)本用。

1.2.4 觀察指標(biāo)陰莖海綿體平滑肌組織病理學(xué)觀察將上述取材標(biāo)本常規(guī)HE染色；檢測(cè)陰莖海綿體平滑肌Cx43的表達(dá)免疫組織化學(xué)S-P法可顯示組織和細(xì)胞中抗原分布，鏈霉親和素是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì)，其分子量47000，對(duì)生物素分子具有極高的親和力，其親和力是一般抗原抗體的一百萬(wàn)倍。親和素是一個(gè)堿性蛋白，經(jīng)生物改造后可轉(zhuǎn)變成中性的蛋白質(zhì)。免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察結(jié)果本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠活動(dòng)正常，對(duì)外界刺激較為靈敏，毛發(fā)光亮。模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，少動(dòng)萎靡，體毛暗淡無(wú)光澤。疏肝養(yǎng)血組大鼠與模型組大鼠比較，一般狀態(tài)均明顯改善。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因動(dòng)物撕咬、灌胃等因素致三組各脫落4例。

2.2 陰莖海綿體平滑肌病理學(xué)觀察各組大鼠陰莖海綿體平滑肌病理切片HE染色后置于光鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組形態(tài)學(xué)改變不明顯。見(jiàn)圖1。

2.3 陰莖海綿體平滑肌Cx43表達(dá)Cx43呈棕黃色—黃色表達(dá)于細(xì)胞漿，陰性細(xì)胞核為藍(lán)色。與空白組相比，模型組大鼠陰莖海綿體平滑肌組織Cx43積分光密度明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，疏肝養(yǎng)血組陰莖海綿體平滑肌組織Cx43積分光密度明顯增高(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

圖1 各組大鼠陰莖海綿體平滑肌病理學(xué)圖片(HE×100)

圖2 Cx43在陰莖海綿體平滑肌的表達(dá)(IHC×200)

表1 各組陰莖海綿體平滑肌Cx43積分光密度

表1 各組陰莖海綿體平滑肌Cx43積分光密度

組別樣本數(shù)CX43積分光密度空白組60.0561±0.0096模型組60.0209±0.00381)疏肝養(yǎng)血組60.0463±0.01142)

注：與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝與勃起功能關(guān)系密切，《沈氏尊生書(shū)》說(shuō)：“失志之人，抑郁傷肝，肝木不能疏泄，亦致陽(yáng)痿不起”。王氏在80年代初提出“陽(yáng)痿從肝論治”理論，曾對(duì)中醫(yī)治療陽(yáng)痿產(chǎn)生較大影響[14]。肝主疏泄，主司精神活動(dòng)，肝之疏泄情志功能障礙，影響到宗筋功能的正常發(fā)揮，從而導(dǎo)致陽(yáng)痿?！案尾匮?，主疏泄”，“肝藏”是人體內(nèi)調(diào)節(jié)物質(zhì)流動(dòng)和分布的功能系統(tǒng)，其生理解剖基礎(chǔ)是人體平滑肌系統(tǒng)[15]。血管以平滑肌為其結(jié)構(gòu)主體，是“肝藏”貯藏和疏泄血液的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。陰莖海綿體組織由平滑肌細(xì)胞、血竇、竇內(nèi)皮細(xì)胞、竇間隙等組成。其中，平滑肌細(xì)胞是陰莖海綿體的主要成分，血竇之間是富有平滑肌纖維的結(jié)締組織小梁，而血竇與其靜脈相連，當(dāng)血液進(jìn)入血竇后，竇間隙擴(kuò)張，血液則充盈，陰莖發(fā)揮勃起功能。陰莖勃起和排精由平滑肌完成，是“肝行腎氣”的體現(xiàn)，而“肝行腎氣”的生理解剖基礎(chǔ)是生殖系統(tǒng)平滑肌，肝對(duì)性生理的調(diào)節(jié)是通過(guò)平滑肌系統(tǒng)而實(shí)現(xiàn)[16～18]。疏肝理氣活血之法，基于“肝藏血，主疏泄”的理論，使筋為肝主，氣血暢行，從而改善陰莖的血液循環(huán)，提高陰莖海綿體平滑肌充血灌注功能，以復(fù)陰莖之作強(qiáng)功能，從而達(dá)到治療ED的目的。

縫隙鏈接(Gap junction，GJ)是細(xì)胞之間的主要通訊方式之一。GJ是由連接相鄰兩個(gè)細(xì)胞間的連接通道排列而形成的一種特殊膜結(jié)構(gòu)。相鄰的細(xì)胞之間通過(guò)GJ介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊進(jìn)行著信息、能量與物質(zhì)的交換，參與細(xì)胞之間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)與電信號(hào)傳遞的電偶聯(lián)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、增殖與分化等生理過(guò)程發(fā)揮重要的調(diào)控作用。陰莖海綿體平滑肌中含有大量縫隙鏈接蛋白Cx43，在海綿體收縮與舒張的協(xié)調(diào)性過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，調(diào)節(jié)海綿體的舒縮，參與陰莖勃起的調(diào)控。Larson等于1990年首先報(bào)道了人類(lèi)陰莖海綿體的血管內(nèi)皮細(xì)胞能表達(dá)Cx43mRNA，其后有學(xué)者進(jìn)一步證實(shí)了Cx43及其mRNA在陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞的存在[19]。Cx43作為陰莖平滑肌組織主要的連接蛋白，將Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的信號(hào)從一個(gè)平滑肌細(xì)胞傳遞到另一個(gè)平滑肌細(xì)胞內(nèi)，對(duì)于協(xié)調(diào)平滑肌細(xì)胞間的同步收縮和舒張有著十分重要的作用。李錚等[20]以6例具有正常勃起功能的正常人體海綿體組織作為對(duì)照，運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)了9例器質(zhì)性ED患者陰莖海綿體組織中Cx43的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)器質(zhì)性ED患者陰莖海綿體組織中Cx43的表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照組。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝郁血虛ED大鼠陰莖海綿體平滑肌Cx43表達(dá)明顯降低。通過(guò)逍遙散合四物湯干預(yù)后，Cx43表達(dá)明顯增高，表明疏肝養(yǎng)血法可通過(guò)養(yǎng)肝血使宗筋得養(yǎng)，疏肝氣而宗筋得控，從而調(diào)節(jié)陰莖的勃起功能。而改善Cx43表達(dá)可能是基于“肝藏”理論，疏肝養(yǎng)血法是治療ED的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制之一。

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《中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育》雜志征訂征稿啟事

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Effect of Traditional Chinese Medicine Compound on Cx43 in Penis Smooth Muscle of SD Rats

QU Xiaowei1YOU Yaodong2ZHANG Peihai3LI Juntao CHANG Degui5△

(1.Department of Urology, Zhengzhou People's Hospital, Henan, Zhengzhou 450003, China;2.Department of Andrology,The First Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Sichuan, Chengdu 610072, China;3.Department of Andrology, Sichuan Hospital of Combined of Traditional Chinese and Western Medicine, Sichuan,Chengdu 610041, China;4.Department of Andrology, The First Affiliated Hospital of Henan University of Traditional Chinese Medicine, Henan, Zhengzhou 450008, China;5.Department of Andrology, The Second Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Sichuan, Chengdu 610041, China)

Objective To observe the effect of dispersing liver and nourishing blood treatment on Cx43 in penis smooth muscle of SD rats with the liver-stagnation and blood-deficiency erectile dysfunction based on the guidance of “Gancang” theory. Methods 30 normal erectile function sexually mature male SD rats which confirmed by mating with female rats were randomly divided into blank group, model group and dispersing liver and nourishing blood group, with 10 rats in each group, meanwhile they were fed with low-iron diet to establish the liver-stagnation and blood-deficiency ED models. After 14 days intragastric administration with Siwu decoction and Xiaoyaosan decoction, all were killed after last gavage 24 hours with taking the sponge meristem to pathological observation with HE and the expression of Cx43 with SP. Results We found that the pathological changes of sponge meristem between blank group and model group were unobvious, but the expression of Cx43 in penis smooth muscle was declined significantly in the model group. Comparing with the model group, the expression of Cx43 in penis smooth muscle was increased in southing liver and nourishing blood group had statistical significance (P<0.05). Conclusions The dispersing liver and nourishing blood treatment based on the guidance of “Gancang” theory could effectively recovery the erectile functions through the mechanisms of affecting the expression of Cx43 in penis smooth muscle.

“Gancang” theory; Erectile dysfunction; Dispersing liver and nourishing blood; Cx43

四川省教育廳課題(No.12ZA033)

1.河南省鄭州人民醫(yī)院泌尿外科(鄭州 450003)；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科(成都 610072)；3.四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院男科(成都 610041)；4.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院男科(鄭州 450008)；5.成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院男科(成都 610041)

△通訊作者

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.21.023

1003-8914(2016)-21-3115-04

?楠

2016-08-12)