劉 麗 李 楊 李世大

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【實驗研究】

膈下逐瘀沖劑對沙眼衣原體輸卵管炎性不孕小鼠細(xì)胞因子影響的研究*

劉 麗1李 楊2李世大3

目的探討膈下逐瘀沖劑對沙眼衣原體輸卵管炎性不孕小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的影響，闡明藥物的作用機理和具體療效。方法選取6～8周雌性C3H/HeN小鼠100只，隨機分為空白對照組、模型組、阿奇霉素組、膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組5組，每組20只。采用“沙眼衣原體陰道接種法”復(fù)制輸卵管炎性不孕模型，接種第8周不同組按組給予藥物灌胃15天。處死后免疫組化法檢測TNF-a、IL-6、IL-8。結(jié)果與空白對照組比較，模型組IL-6、IL-8 及TNF-α陽性表達(dá)均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。與模型組比較，阿奇霉素組和膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-6、IL-8 及TNF-α陽性表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-6、IL-8 及TNF-α陽性表達(dá)明顯低于阿奇霉素組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論膈下逐瘀沖劑具有抗炎和提高免疫的作用，阿奇霉素與膈下逐沖劑合用可以有效治療沙眼衣原體感染所致輸卵管炎。

膈下逐瘀沖劑；輸卵管炎性不孕；細(xì)胞因子；沙眼衣原體

隨著社會的發(fā)展，不孕不育癥的發(fā)病率不斷上升，逐漸成為一個世界性難題。據(jù)我國性病統(tǒng)計資料顯示，由沙眼衣原體(CT)引起的非淋菌性尿道炎(宮頸炎)、輸卵管炎的發(fā)病率，在近兩年來以23%～75%的速度遞增[1]。據(jù)美國CDC統(tǒng)計，美國每年有400萬生殖道沙眼衣原體感染新發(fā)病例[2]。國內(nèi)外研究均已證實，CT是影響人類生殖健康的重要病原體之一。輸卵管炎感染初期多無明顯表現(xiàn)，慢性期會有一側(cè)或雙側(cè)下腹部隱痛，白帶異常等表現(xiàn)，常被人忽視。目前西醫(yī)主要采用抗生素的治療，效果尚可，但復(fù)發(fā)率較高，治療費用相對較高，且已有不少菌株產(chǎn)生耐藥，而中醫(yī)藥的應(yīng)用占有一定的優(yōu)勢，且發(fā)展前景較大。目前尋求一種有效的方法治療本病是婦科學(xué)研究焦點。本病病機多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為與瘀血關(guān)系較為密切，《醫(yī)宗金鑒》云 ：“或因宿血積于胞中， 新血不能成孕……壅塞胞中而不孕。”許潤三教授認(rèn)為輸卵管炎積水性不孕形成的主要機制是“血瘀水停，阻于胞脈”[3]。劉麗教授秉承歷代醫(yī)家不孕癥治療理念，結(jié)合多年治療輸卵管炎性不孕癥經(jīng)驗總結(jié)出“活血化瘀、行氣止痛”治療大法，并結(jié)合此法對王清任的膈下逐瘀湯加減化裁出我院內(nèi)制劑“膈下逐瘀沖劑”。本實驗致力于探討其治療輸卵管炎性不孕的作用機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種與試劑沙眼衣原體(由復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心周曉輝教授饋贈)：保存于本實驗室-70℃超低溫冰箱。TNF-α、IL-6、IL-8免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.2 實驗動物清潔級6～8周雌性C3H/HeN小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購買于中山大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)婦科實驗室清潔動物房，溫度18℃～24℃，光暗周期12h。

1.1.3 實驗藥物膈下逐瘀沖劑由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院天江藥局提供，藥物組成為牡丹皮2 袋，鱉甲1 袋，烏藥1 袋，川芎2 袋，香附2 袋，枳殼1 袋，延胡索2 袋，桃仁1 袋，赤芍2 袋，地龍1 袋； 阿奇霉素分散片(哈藥集團三精制藥諾捷有限責(zé)任公司，批準(zhǔn)文號：H20057906)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)沙眼衣原體小鼠生物型菌株和McCOy細(xì)胞，本實驗室保存?zhèn)鞔?，用RPMI1640生長培養(yǎng)基，蔗糖谷氨基酸鉀稀釋液(SPG)液中保存。沙眼衣原體小鼠生物型菌株體外培養(yǎng)，制備感染液，用沙眼衣原體小鼠生物型菌株感染McCOy細(xì)胞在含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，收集單層感染McCOy細(xì)胞，超聲碎解細(xì)胞30s，在4℃下500r /min離心10min，吸取上層液，在4℃下30000r/min，離心45min，取沉淀，用SPG-70℃保存。

1.2.2 膈下逐瘀沖劑、阿奇霉素的制備膈下逐瘀沖劑：由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供(產(chǎn)品批號：20100226)每袋6g(相當(dāng)于生藥20g)，日3次口服，根據(jù)小鼠與人體表面積轉(zhuǎn)換系數(shù)計算(每人每天60 g)，將膈下逐瘀制為：60 g×0.0026=0.156g，0.156g/0.4ml=0.39 g/ml；阿奇霉素片(產(chǎn)品批號：101012)以蒸餾水溶化，調(diào)成溶液濃度為6.5g/ml。 每鼠0.4ml/天灌胃。

1.2.3 造模方法雌性C3H/HeN小鼠100只，隨機分為空白對照組、模型組、阿奇霉素組、膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組5組，每組20只。除空白對照組外其余4組雌性小鼠先后用1.5%的戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔注射麻醉后，用0.1%新潔爾滅消毒外陰，再用0.9%的生理鹽水清洗；分別用濃度為含106IFU 的感染液50UL，用無菌500UL微量注射器(針頭套硅膠硬外麻套管)通過陰道內(nèi)接種感染。空白對照組用無沙眼衣原體感染的McCOy細(xì)胞感染液(SPG)陰道接種，術(shù)后禁食不禁水，待小鼠正常排便后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.4 給藥方法陰道接種7周后每日上午8 時灌胃1次，每次0.4ml，連續(xù)灌胃15天，模型組、空白對照組給同等量的生理鹽水灌胃治療15天。

1.2.5 標(biāo)本采集方法灌胃15天后，清晨予以禁食、不禁水，采用頸椎脫臼法處死小鼠，開腹找到輸卵管，快速剝離性腺旁脂肪、卵巢、子宮，取標(biāo)本，放入4%多聚甲醛溶液中固定，待用。

1.2.6 指標(biāo)檢測免疫組化法檢測TNF-α、IL-6、IL-8蛋白的表達(dá)。

1.2.7 免疫組化陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)采用半定量分析法[4]：判定標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，將其染色強度分四級：陰性(-)：細(xì)胞無任何著色或出現(xiàn)陽性細(xì)胞數(shù)比例<5%；弱陽性(+)：細(xì)胞輕度著色，呈淡黃色，陽性細(xì)胞數(shù)占5%～25%；陽性(++)：細(xì)胞著色呈深黃色，陽性細(xì)胞數(shù)占25%～50%；強陽性(+++)：細(xì)胞明顯著色，呈深棕色，陽性細(xì)胞數(shù)占>50%。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下輸卵管組織病理改變造模后，輸卵管組織經(jīng)HE染色，光鏡下可見管壁結(jié)構(gòu)無明顯分界，見結(jié)締組織增生，黏膜柱狀上皮細(xì)胞成矮柱狀，頂部纖毛變短，部分脫落，管腔內(nèi)纖毛排列不整齊，部分管腔堵塞，漿膜層可見淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞及少量嗜酸性粒細(xì)胞等浸潤。

2.2 對大鼠輸卵管組織IL-6陽性表達(dá)的影響與正常組比較，模型組IL-6陽性表達(dá)均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，阿奇霉素組和膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-6陽性表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-6陽性表達(dá)明顯低于阿奇霉素組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 對大鼠輸卵管組織IL-6陽性表達(dá)的影響

2.3 對大鼠輸卵管組織IL-8 陽性表達(dá)的影響與正常組比較，模型組IL-8陽性表達(dá)均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，阿奇霉素組和膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-8陽性表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組IL-8陽性表達(dá)明顯低于阿奇霉素組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 對大鼠輸卵管組織IL-8 陽性表達(dá)的影響

2.4 對大鼠輸卵管組織TNF-α陽性表達(dá)的影響與正常組比較，模型組TNF-α陽性表達(dá)均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，阿奇霉素組和膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組TNF-α陽性表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；膈下逐瘀沖劑組、膈下+阿奇組TNF-α陽性表達(dá)明顯低于阿奇霉素組，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 對大鼠輸卵管組織TNF-α陽性表達(dá)的影響

3 討論

輸卵管炎性不孕癥，檢索中醫(yī)古典著作，未查閱到明確敘述，但根據(jù)其少腹部疼痛、痛經(jīng)、少腹部觸及包塊等臨床特點，可散見于“腹痛”“癥瘕”“痛經(jīng)”“熱入血室”“不孕癥”等病證中。在臨床治療輸卵管炎性不孕癥中運用膈下逐瘀沖劑得到了較好療效。膈下逐瘀湯為王清任《醫(yī)林改錯》中代表方劑，用于治療瘀血阻滯膈下證，劉麗教授根據(jù)多年治療輸卵管炎性不孕癥經(jīng)驗，加減化裁方由川芎、赤芍、牡丹皮、桃仁、香附、延胡索、烏藥、枳殼、鱉甲、地龍組成。桃仁活血祛瘀，潤腸通便，止咳平喘?！侗静菥V目》云：“主瘀血，血閉癥瘕，邪氣……”牡丹皮清熱涼血、活血散瘀?！兜崮媳静荨罚骸捌蒲?血)，消癥瘕之疾，除血分之熱”。赤芍瀉肝清熱，散瘀活血止痛?！兜崮媳静荨吩唬骸盀a脾火，降氣，行血，破瘀，散血塊，止腹痛，攻癰瘡?！睘跛幮袣庵雇?，溫腎散寒?！侗静菔斑z》：“主中惡心腹痛……婦人血氣，小兒腹中諸蟲?！毖雍骰钛袣庵雇?。《本草綱目》：“延胡索，能行血中氣滯，故專治一身上下諸痛?！贝ㄜ夯钛袣?，祛風(fēng)止痛?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》：“主中風(fēng)入腦頭痛，寒痹，筋攣緩急，金瘡，婦人血閉無子?！毕愀绞韪卫須?，調(diào)經(jīng)止痛?！侗静菥V目》：“利三焦，解六郁，消飲食積聚，痰飲痞滿，胕腫腹脹，腳氣，止心腹、肢體、頭目、齒耳諸痛……婦人崩漏帶下、月經(jīng)不調(diào)，胎前產(chǎn)后百病?！辫讱て茪獬?，化痰消積?！度杖A子》：“破瘕結(jié)痃癖，五膈氣”。地龍清熱、平肝、止喘、通絡(luò)?！侗静菥V目》：“性寒而下行，性寒故能解諸熱疾”鱉甲滋陰潛陽，軟堅散結(jié)。用于癥瘕積聚之證?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》：“主心腹癥瘕堅積，寒熱，去痞息肉，陰蝕，痔，惡肉。”諸藥合用共奏活血化瘀，行氣止痛之功，又因“氣行則血行”故活血藥必配以行氣藥，使瘀滯得除。

細(xì)胞因子具有介導(dǎo)和調(diào)控免疫、炎癥過程的功能，對機體感染、炎癥、創(chuàng)傷及免疫應(yīng)答有調(diào)節(jié)作用[5]。IL-6、IL-8、TNF-α屬于促炎細(xì)胞因子。當(dāng)機體感染CT時刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、TNF-α、繼而活化T細(xì)胞，產(chǎn)生TNF-α，TNF-α在正常輸卵管和炎性輸卵管上皮細(xì)胞均有表達(dá)，它可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，激活單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，TNF-α可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生一些有害物質(zhì)，激活單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)IL-6、IL-8合成，促進炎癥反應(yīng)[6]。簡言之，三者產(chǎn)生越多，輸卵管損傷越重。本實驗應(yīng)用膈下逐瘀沖劑干預(yù)沙眼衣原體致輸卵管炎性不孕癥大鼠，膈下逐瘀沖劑組，阿奇霉素組和阿奇+膈下逐瘀沖劑組均能降低IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)，且阿奇+膈下逐瘀沖劑組能明顯抑制三者表達(dá)。三組結(jié)果對比說明膈下逐瘀沖劑具有抗炎作用且抗炎效果優(yōu)于阿奇霉素，二者合用可使炎性輸卵管細(xì)胞中IL-6、IL-8和TNF-α表達(dá)接近或恢復(fù)正常，可能為其治療輸卵管炎性不孕的作用機制，發(fā)揮其抗炎作用，從而控制炎癥發(fā)展。

綜上所述，膈下逐瘀沖劑具有抗炎和提高免疫的作用，阿奇霉素與膈下逐瘀沖劑合用可以有效治療沙眼衣原體感染所致輸卵管炎。

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黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(No.12521504)

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1003-8914(2016)-22-3268-03

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2016-08-09)