楊軍何圓圓，2

新生大鼠耳蝸K?lliker器在體凋亡的研究△

楊軍1何圓圓1，2

目的 了解不同天齡新生大鼠耳蝸K?lliker器的形態(tài)變化，研究凋亡相關(guān)因子的mRNA及蛋白的表達(dá)水平，探討K?lliker器在聽(tīng)覺(jué)功能發(fā)育過(guò)程中凋亡的機(jī)制。方法 選取出生后不同天齡的Sprague－Dawley大鼠共192只，其中出生后1天（P1）、5天（P5）、12天（P12）各6只大鼠耳蝸冰凍切片后，通過(guò)蘇木精－伊紅染色及免疫熒光染色等方法，觀察耳蝸K?lliker器的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；取P1大鼠6只行耳蝸基底膜免疫熒光觀察；提取出生后1、3、5、7、10、12及14天（P1、P3、P5、P7、P10、P12和P14）大鼠耳蝸基底膜mRNA（各6只）及蛋白（各18只），運(yùn)用real－time PCR及蛋白質(zhì)印跡的方法，觀察出生后各天齡組大鼠耳蝸基底膜K?lliker器凋亡過(guò)程中bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果 出生后大鼠聽(tīng)力出現(xiàn)之前其耳蝸K?lliker器支持細(xì)胞的形態(tài)自頂回向底回從高柱狀向矮柱狀變化，同時(shí)支持細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少。出生后不同天齡大鼠耳蝸基底膜的caspase－3、caspase－8、caspase－9及bcl－2的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均呈明顯的時(shí)間依賴性。結(jié)論 在大鼠出生后、聽(tīng)力出現(xiàn)前耳蝸發(fā)育的整個(gè)階段，K?lliker器自底回向頂回逐漸發(fā)生退化；caspase－3、caspase－8、caspase－9及bcl－2的m RNA和蛋白的表達(dá)表現(xiàn)為時(shí)間依賴性。

大鼠； 耳蝸； K?lliker器； 支持細(xì)胞； 凋亡

鼠類(lèi)動(dòng)物出生時(shí)其聽(tīng)覺(jué)器官并未發(fā)育成熟，其出生后至12～14天沒(méi)有聽(tīng)覺(jué)。K?lliker器（亦稱大上皮嵴）是耳蝸發(fā)育過(guò)程中的一種暫態(tài)結(jié)構(gòu)，位于耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞（IHCs）內(nèi)側(cè)的柱狀支持細(xì)胞團(tuán)［1］，存在于胚胎中晚期和出生后早期，是耳蝸未成熟的標(biāo)志之一；出生后，K?lliker器細(xì)胞發(fā)生凋亡，數(shù)目減少，在有聽(tīng)覺(jué)之后，當(dāng)耳蝸成熟時(shí)，K?lliker器消失［2］。

以往有研究觀察到K?lliker器在出生后12～14天消失［3］，但目前對(duì)出生后聽(tīng)力發(fā)育過(guò)程中K?lliker器的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及生物化學(xué)變化知之甚少，且對(duì)K?lliker器支持細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制也少有研究。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)研究不同天齡新生大鼠耳蝸K?lliker器的形態(tài)變化及凋亡相關(guān)因子的m RNA及蛋白的表達(dá)變化，探討K?lliker器在新生大鼠聽(tīng)覺(jué)功能發(fā)育過(guò)程中凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取健康清潔級(jí)Sprague－Dawley大鼠192只，雌雄不拘，所有大鼠父輩耳廓反射靈敏，耳部外形正常，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。取出生后1天（P1）、5天（P5）以及12天（P12）各6只，用于制備耳蝸切片；另選取P1大鼠6只，用于行耳蝸基底膜免疫熒光觀察；選取生后1、3、5、7、10、12及14天（P1、P3、P5、P7、P10、P12、P14）大鼠各6只，提取基底膜RNA；選取P1、P3、P5、P7、P10、P12及P14大鼠各18只，提取基底膜蛋白。

1.2 試劑 Tissue－Tek冷凍組織包埋劑由日本Sakura公司提供；L－多聚賴氨酸及10%山羊血清由美國(guó)Sigma公司提供；兔抗大鼠Myosin－VIIa購(gòu)自美國(guó)Proteus BioSciences公司；山羊抗大鼠Sox2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit）及Realtime試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM，Perfect Real Time）由Takara公司提供；小鼠抗大鼠β－actin抗體購(gòu)自美國(guó)Protein Tech公司；兔抗大鼠caspase－3抗體、caspase－8抗體、caspase－9抗體、bcl－2及cleaved caspase－3抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 耳蝸冰凍切片 取P1、P5及P12大鼠各6只快速斷頭，取下顳骨后，放入新鮮4%多聚甲醛溶液中。在解剖顯微鏡下打開(kāi)顳骨壁，打開(kāi)聽(tīng)泡，分離耳蝸，挑去鐙骨底板，開(kāi)放圓窗及卵圓窗，并在蝸?lái)敶蛞恍】?，置?%多聚甲醛溶液內(nèi)，4℃固定24 h。P5及P12大鼠耳蝸放入10%EDTA溶液中于4℃冰箱脫鈣，P5組脫鈣2 d，P12組脫鈣5 d，每天更換新鮮脫鈣液，用0.01 M PBS漂洗3次，在4℃耳蝸通過(guò)10.0%、12.5%、15%和20%的系列蔗糖磷酸緩沖液梯度，每一梯度至耳蝸沉底。將耳蝸浸入Tissue－Tek冷凍組織包埋劑中，耳蝸快速冷凍在－20℃用冷凍切片機(jī)沿蝸軸作冰凍切片，片厚6～8 μm，切片置于涂L－多聚賴氨酸的載玻片上融解，并在空氣中干燥，冰凍切片可儲(chǔ)存在－20℃冰箱或立即用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 HE染色 取出耳蝸切片，置室溫晾干。蒸餾水漂洗，蘇木精染液染色5 min。蒸餾水洗去多余蘇木精染液后，滴加1%鹽酸酒精分化5～10 s，細(xì)流水沖洗，至細(xì)胞核呈藍(lán)色。滴加0.1%伊紅染液染色1 min，依次經(jīng)70%、85%、95%、100%梯度酒精脫水，其中95%、100%酒精各2次，每次各為5 min，二甲苯透明2次，每次5 min；滴加適量中性樹(shù)膠，加蓋玻片封閉，封片過(guò)程避免出現(xiàn)氣泡。過(guò)夜晾干，顯微鏡下觀察P1、P5、P12大鼠耳蝸K?lliker器形態(tài)并攝片。

1.3.3 基底膜免疫熒光染色 取6只P1大鼠，快速斷頭，在體視解剖顯微鏡下自頂回至基底回仔細(xì)分離出血管紋和螺旋韌帶，自基底膜底回完整撕下基底膜，將基底膜置于4%多聚甲醛溶液室溫4 h，PBS漂洗3次，每次5 min。滴加0.1%Triton X－100溶液通透40 min，PBS漂洗；加10%山羊血清封閉30 min，滴加1：300兔抗大鼠Myosin－VIIa抗體及1：200山羊抗大鼠Sox2抗體，置于4℃冰箱過(guò)夜，復(fù)溫1 h，PBS漂洗。滴加Dy Light 594山羊抗兔IgG及Dy Light 488兔抗山羊IgG，避光室溫孵育2 h，PBS漂洗，避光滴加50%甘油磷酸緩沖液，加蓋玻片封閉。熒光顯微鏡下觀察耳蝸基底膜頂、中、底回K?lliker器細(xì)胞的數(shù)量并攝片。Myosin－VIIa標(biāo)記毛細(xì)胞，顯示為綠色；Sox2標(biāo)記所有的支持細(xì)胞，包括K?lliker器支持細(xì)胞，顯示為紅色。

1.3.4 Real time PCR檢測(cè)不同天齡大鼠耳蝸感覺(jué)上皮bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9 m RNA的表達(dá) 常規(guī)提取P1、P3、P5、P7、P10及P12大鼠（各6只）耳蝸基底膜mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，SYBR Green嵌合熒光定量real－time PCR檢測(cè)bcl－2、caspase－3、caspase－8及 caspase－9 m RNA的表達(dá)。PCR引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)；以β－actin為內(nèi)參，根據(jù)2－ΔΔCt法分析bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9 m RNA表達(dá)量。設(shè)對(duì)照組的表達(dá)量為1，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組中各個(gè)因子的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1.3.5 凋亡相關(guān)蛋白的蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)（Western blot） 新鮮抽提的P1、P3、P5、P7、P10及P12大鼠耳蝸基底膜組織，配置含蛋白酶抑制劑PMSF（苯甲基磺酰氟）的蛋白質(zhì)抽提試劑RIPA，提取同鼠齡耳蝸感覺(jué)上皮的總蛋白，經(jīng)蛋白含量測(cè)定及蛋白變性后，SDS－PAGE（十二烷硫酸鈉聚丙烯酰胺）凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，分別用兔克隆bcl－2、caspase－3、caspase－8、caspase－9及cleaved caspase－3一抗及小鼠克隆β－actin抗體4℃孵育24 h，洗膜3次，每次5 min，加1：1 000辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗（由美國(guó)Protein Tech公司提供）孵育60 min，洗膜3次，每次10 min，凝膠成像分析系統(tǒng)分析各不同天齡組大鼠耳蝸感覺(jué)上皮的bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9及cleaved caspase－3蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0（SPSS Inc，美國(guó)）同步統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用方差分析（F檢驗(yàn)），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同天齡大鼠耳蝸K?lliker器形態(tài)比較 大鼠出生后，其耳蝸形態(tài)發(fā)育尚不成熟，K?lliker器仍存在（圖1）?？梢?jiàn)P1和P5組大鼠耳蝸底回、中回及頂回K?lliker器均還未退化，從底回到頂回，K?lliker器內(nèi)支持細(xì)胞的形態(tài)從矮柱狀向高柱狀變化，支持細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，從8～14排減少至3～4排；P12組耳蝸底回和中回的K?lliker器基本消失，而頂回的K?lliker器還未退化；說(shuō)明新生大鼠耳蝸的發(fā)育及K?lliker器的退化是從底回開(kāi)始逐漸向頂回進(jìn)展。

2.2 耳蝸基底膜免疫熒光染色顯示K?lliker器支持細(xì)胞數(shù)量變化 P1大鼠耳蝸的基底膜Myosin－VIIa和Sox2的免疫熒光染色結(jié)果表明，其耳蝸底回、中回和頂回中K?lliker器支持細(xì)胞均存在，且自底回向頂回K?lliker器支持細(xì)胞數(shù)量依次明顯減少（圖2）。說(shuō)明在出生后大鼠的耳蝸仍處在發(fā)育過(guò)程中，K?lliker器的支持細(xì)胞存在凋亡使細(xì)胞數(shù)目減少。

2.3 不同天齡大鼠耳蝸感覺(jué)上皮bcl－2、caspase－3、caspase－8和caspase－9的m RNA表達(dá)P1、P3、P5、P7、P10、P12及P14大鼠耳蝸感覺(jué)上皮bcl－2、caspase－3、caspase－8和caspase－9的m RNA表達(dá)呈一定的時(shí)間依賴性；bcl－2的m RNA表達(dá)水平在P3、P5和P7組均顯著增高，約為P1組的2～2.5倍（P＜0.05）（圖3a）；P3組caspase－3的mRNA表達(dá)水平約為P1組的1.8倍（P＜0.05）（圖3b）；且caspase－8 mRNA的表達(dá)水平在P3組最高，約為P1組的2.5倍（P＜0.05），而P14組caspase－8 m RNA的表達(dá)水平明顯降低，約為P1組的1／2（P＜0.05）（圖3c）；各組caspase－9 m RNA表達(dá)規(guī)律與caspase－3 m RNA和caspase－8 mRNA不同（圖3d）；P5、P10組和P12組的caspase－9 m RNA表達(dá)水平分別約為P1組的0.6～0.7倍（P＜0.05）。

2.4 不同天齡大鼠耳蝸感覺(jué)上皮的bcl－2、caspase－3、caspase－8和caspase－9及cleaved caspase－3蛋白的表達(dá) Western blot檢測(cè)P1、P3、P5、P7、P10、P12及P14大鼠耳蝸感覺(jué)上皮bcl－2、caspase－3、caspase－8和caspase－9蛋白的表達(dá)呈一定的時(shí)間依賴性（圖4）；與P1組相比，P3組的caspase－3的水平明顯較高，而P12組和P14組相對(duì)較低；caspase－8蛋白表達(dá)在P3組最高，而在P10組降至與P1相當(dāng)；與P1組相比，caspase－9的蛋白水平在P12組和P14組明顯降低，但其余各組與P1組相比無(wú)明顯變化；bcl－2蛋白表達(dá)在P3、P5及P7組有明顯增高。

Western blot檢測(cè)P1、P3組大鼠耳蝸感覺(jué)上皮cleaved caspase－3蛋白的表達(dá)顯示，與caspase－3蛋白表達(dá)水平相似，cleaved caspase－3蛋白的表達(dá)也呈一定的時(shí)間依賴性（圖5），與P1組相比，P3組的cleaved caspase－3蛋白的表達(dá)水平明顯較高。

圖1 P1、P5、P12新生大鼠耳蝸K?lliker器的HE染色

圖2 P1新生大鼠耳蝸基底膜免疫熒光染色

3 討論

眾所周知，在發(fā)育成熟的耳蝸中，聲波振動(dòng)導(dǎo)致內(nèi)毛細(xì)胞（IHCs）去極化，之后電壓門(mén)控的鈣離子通道開(kāi)放，鈣離子內(nèi)流觸發(fā)傳入性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸釋放，通過(guò)如此機(jī)械－電信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，最終產(chǎn)生聽(tīng)覺(jué)。在大鼠出生后、聽(tīng)覺(jué)產(chǎn)生前，發(fā)育中的螺旋神經(jīng)元產(chǎn)生的動(dòng)作電位依賴于非聲音介導(dǎo)的自發(fā)性活動(dòng)［4］，這種非聲音介導(dǎo)的自發(fā)性活動(dòng)起源于耳蝸［5］，且有促進(jìn)聽(tīng)覺(jué)神經(jīng)元的存活及成熟［5～7］、突觸的發(fā)育［8，9］及音頻定位的建立［10］等作用。Tritsch等［1］研究表明K?lliker器的支持細(xì)胞可以自發(fā)性節(jié)律性釋放ATP，與IHCs上的嘌呤受體結(jié)合導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，之后IHCs去極化并釋放谷氨酸；谷氨酸激活螺旋神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位，以此模擬外界聲輸入的效應(yīng)，在不成熟的耳蝸中產(chǎn)生不依賴聲音的自發(fā)性活動(dòng)。前期研究發(fā)現(xiàn)，新生大鼠耳蝸K?lliker器的支持細(xì)胞在體外能夠釋放ATP［11］。在出生后12～14天的鼠類(lèi)動(dòng)物，外耳道開(kāi)放，K?lliker器不復(fù)存在，支持細(xì)胞終止釋放ATP，自發(fā)性活動(dòng)停止，耳蝸功能成熟，耳蝸中出現(xiàn)聲音介導(dǎo)的電活動(dòng)。因此，K?lliker器在出生后大鼠耳蝸發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。作為耳蝸未成熟的標(biāo)識(shí)之一，K?lliker器細(xì)胞的胞體細(xì)長(zhǎng)，頂部有雙極或單極突起，其末端可見(jiàn)微絨毛，胞核小，位于胞體中部，部分細(xì)胞在胚胎晚期和出生后早期可能存在有絲分裂活動(dòng)。在耳蝸的發(fā)育階段，大鼠耳蝸K?lliker器自內(nèi)側(cè)向外側(cè)自底回向頂回發(fā)生退化，其退化的機(jī)制可能是細(xì)胞凋亡［12，13］。細(xì)胞凋亡的信號(hào)可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的多個(gè)獨(dú)立的途徑啟動(dòng)從而誘導(dǎo)凋亡，而半胱天冬酶（caspase）是許多器官凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵酶。當(dāng)線粒體膜電位損失后，細(xì)胞色素C自線粒體釋放，而細(xì)胞色素C可以激活caspase－3，目前caspase－3是研究最多的凋亡途徑啟動(dòng)的下游的酶。caspase－8通過(guò)與位于細(xì)胞膜上的死亡受體結(jié)合并形成三聚體而啟動(dòng)外源性凋亡通路，caspase－8一旦被激活，便可以激活下游的半胱天冬酶，如直接裂解caspase－3或間接造成線粒體膜的破裂釋放細(xì)胞色素C。caspase－9參與線粒體介導(dǎo)的活化和隨后釋放到細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞色素C的激活，從而激活caspase－3［14］。半胱天冬酶的激活受多種因素的調(diào)節(jié)，如B－細(xì)胞淋巴瘤2（bcl－2）蛋白家族?？沟蛲龅鞍譩cl－2是眾所周知的bcl－2家族成員，可以對(duì)抗細(xì)胞凋亡。

圖3 各組耳蝸K?lliker器bcl－2、caspase－3、caspase－8及caspase－9 mRNA的表達(dá)

圖4 Western blot分析各組耳蝸K?lliker器bcl－2、caspase－3、caspase－8和caspase－9蛋白的表達(dá)

圖5 Western blot分析P1及P3組耳蝸K?lliker器cleaved caspase－3蛋白的表達(dá)

目前少有研究集中在耳蝸K?lliker器的形態(tài)發(fā)育，對(duì)K?lliker器的認(rèn)識(shí)僅限于其在出生后的短時(shí)間內(nèi)會(huì)消失［15］。本研究結(jié)果顯示，新生的P1、P3、P5、P7、P10、P12及P14大鼠耳蝸底回、中回及頂回的K?lliker器的支持細(xì)胞的形態(tài)從底回向頂回逐漸從矮柱狀向高柱狀變化，支持細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，因此可以推測(cè)在新生大鼠耳蝸發(fā)育的過(guò)程中，存在K?lliker器支持細(xì)胞的凋亡。

在內(nèi)耳中，參與凋亡途徑的分子在耳蝸發(fā)育中發(fā)揮了重要的作用［15］，半胱天冬酶在細(xì)胞程序性死亡／凋亡中作用顯著［16］，caspase－3在凋亡裂解過(guò)程中是不可缺少的［17］。以往的研究表明，在胚胎期和出生后早期的發(fā)育過(guò)程中，caspase－3影響聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的形成和維持［13］；在2周齡的caspase－3（－／－）小鼠耳蝸，K?lliker器在底回、中回和頂回中均存在，沒(méi)有退化，推測(cè)caspase－3依賴的凋亡途徑對(duì)哺乳動(dòng)物聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)發(fā)育和功能成熟是必需的。在野生型鼠類(lèi)動(dòng)物，K?lliker器凋亡的這些信號(hào)途徑亟待深入研究［18］。

本研究結(jié)果顯示，在K?lliker器中，caspase－3在大鼠出生后第一天即有高表達(dá)，在P5～P7組大鼠，K?lliker器支持細(xì)胞的凋亡達(dá)高峰，而自P10起凋亡減弱。bcl－2的表達(dá)趨勢(shì)和上述趨勢(shì)一致，即在體K?lliker器支持細(xì)胞中凋亡和抗凋亡同時(shí)存在。而在K?lliker器支持細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)K?lliker器支持細(xì)胞離體培養(yǎng)時(shí)不凋亡，而具有明顯的增殖能力［19］。結(jié)合在體和離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)在體K?lliker器支持細(xì)胞不僅只存在凋亡，也存在增殖。當(dāng)?shù)蛲龊涂沟蛲鍪Ш鈺r(shí)，在體K?lliker器支持細(xì)胞才表現(xiàn)為凋亡或增殖。細(xì)胞增殖的數(shù)量遠(yuǎn)少于細(xì)胞凋亡的數(shù)量時(shí)，在組織結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為K?lliker器的消失。本研究首次揭示了在耳蝸發(fā)育過(guò)程中，caspase－3和bcl－2在在體K?lliker器中表達(dá)的時(shí)間趨勢(shì)，初步了解這兩種蛋白在耳蝸發(fā)育過(guò)程中的作用。

在細(xì)胞凋亡的途徑中，caspase－8和caspase－9是處于上游的半胱天冬酶。從本研究結(jié)果看，P3組大鼠K?lliker器caspase－8顯著高表達(dá)；在P1～P10大鼠，caspase－9均有明顯的表達(dá)。推測(cè)在體K?lliker器的凋亡經(jīng)細(xì)胞外凋亡途徑啟動(dòng)進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)兩條途徑共同參與，但是具體機(jī)制需要進(jìn)一步的研究證明。

綜上所述，在出生之后聽(tīng)覺(jué)產(chǎn)生之前，大鼠耳蝸K?lliker器從底回向頂回逐漸發(fā)生退化，從底回至頂回，K?lliker器內(nèi)的支持細(xì)胞的形態(tài)從矮柱狀向高柱狀變化，支持細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少；在出生后耳蝸發(fā)育的整個(gè)階段，K?lliker器的退化表現(xiàn)為時(shí)間依賴性。本研究首次揭示了在大鼠出生后耳蝸發(fā)育過(guò)程中，caspase－3和bcl－2在在體K?lliker器中表達(dá)的時(shí)間趨勢(shì)。

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（2015－09－04收稿）

（本文編輯 周濤）

The Apoptosis of the K?lliker Organ in the Cochlea of Newborn Rat in Vivo

Yang Jun*，He Yuanyuan
（*Department of Otorhinolaryngology－Head＆Neck Surgery，Xinhua Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai Jiaotong University School of Medicine Ear lnstitute，Shanghai Key Laboratory of Translational Medicine on Ear and Nose Diseases，Shanghai，200092，China）

Objective To explore the apoptosis mechanisms of the K?lliker organ during the development of the auditory function，through the obser vation of the morphological changes，the expression of the apoptosis－related mRNA or protein of the K?lliker organ in the cochlea of newborn rats.Methods A total of 192 Sprague－Dawley rats at different days after parturition（P）were used.There were P1，P5，and P12 rats（6 rats in each group）for hematoxylin－eosin staining and immunohistochemistry to investigate the morphological changes using frozen sections of the cochlea.Six rats at P1 were used for the immunofluorescence of the cochlear basal membrane.The sensory epitheliums in P1，P3，P5，P7，P10，P12 and P14 rats（6 rats each）were separated to extract mRNA（6 rats each）and protein（18 rats each），respectively.The differential expressions of the bcl－2，caspase－3，caspase－8 and caspase－9 through the real－time PCR and western blot during the apoptotic process of the K?lliker organ were studied.Results After birth，the supporting cells in the K?lliker organ showed the morphological change from the high columnar to short columnar and the disappearance with a base－to－apex gradient.The resultsof real－time PCR and western blot showed the expression pattern of bcl－2，caspase－3，caspase－8 and caspase－9 mRNA and protein in the cochlear sensory epithelium at 1st，3rd，5th，7th，10th，12thand 14thday.This indicates a significant time－dependent along the course of development.Conclusion After birth，but prior to the onset of hearing，the K?lliker organ in the cochlea of newborn rats degraded with a base－to－apex gradient throughout the developmental period of the cochlea.The expression of the caspase－3，caspase－8，caspase－9 and bcl－2 in the K?lliker organ during this period also showed in a time－dependence pattern.

Rat； Cochlea； K?lliker organ； Supporting cells； Apoptosis

10.3969／j.issn.1006－7299.2016.04.012

時(shí)間：2016－6－29 16：11

R339.16

A

1006－7299（2016）04－0371－06

△ 國(guó)家自然科學(xué)基金（81170919，81470689）、國(guó)家科技部973課題（2014CB541705）、上海市科委重大項(xiàng)目（14DJ1400201，14DZ2260300）資助

1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉－頭頸外科 上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所（上海 200092）； 2 南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院耳鼻咽喉科

楊軍，男，湖北人，主任醫(yī)師，博士，主要研究方向?yàn)槎伆l(fā)育及耳蝸信息轉(zhuǎn)導(dǎo)。

楊軍（Email：yangjun67＠hotmail.com）

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20160629.1611.024.html