陸杏蓉，龐春英，鄧廷賢，朱 鵬，段安琴，梁賢威

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所 廣西水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

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水牛全血基因組抽提方法優(yōu)化

陸杏蓉，龐春英，鄧廷賢，朱 鵬，段安琴，梁賢威*

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所 廣西水牛遺傳繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001)

[目的]通過比較三種提取水牛全血基因組DNA的方法，獲得一種安全、高效、快速的DNA提取方法，為水?；蚬δ艿难芯康於ɑA(chǔ)。[方法]收集43頭水牛抗凝血樣，每份血樣隨機(jī)分為等量3份，每份血樣2 mL，分別使用試劑盒改良法、試劑盒說明書法及酚仿抽提法提取全血基因組 DNA。比較分析三種方法提取的同一頭牛三份血樣DNA的含量、OD260/280值、瓊脂糖凝膠電泳和基因擴(kuò)增結(jié)果。[結(jié)果]三種方法提取DNA的含量由高到低依次為試劑盒改良法、酚仿抽提法、試劑盒說明書法，各組間差異顯著(1376.72±127.54 VS 1121.32±81.64 VS 326.18±21.17，\%P\%<0.05)。三種方法提取DNA的OD-260/280值依次增加，試劑盒改良法與試劑盒說明書法OD260/280值差異不顯著(1.85±0.0017 VS 1.86±0.0021，\%P\%>0.05)，與酚仿抽提法OD260/280值有顯著差異(1.85±0.0017 VS 1.88±0.0029，1.86±0.0021 VS 1.88±0.0029，\%P\%<0.05)。三種方法提取 DNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，試劑盒改良法和試劑盒說明書法DNA條帶清晰、光密度高，酚仿抽提法條帶模糊有拖帶現(xiàn)象。三種方法所提取的基因組PCR擴(kuò)增stat5基因獲得較清晰準(zhǔn)確的條帶，擴(kuò)增效果良好。[結(jié)論]試劑盒改良法用于水牛全血基因組的提取比試劑盒說明書法和酚氯仿法更安全、高效、便捷。

水牛血液；基因組抽提；試劑盒改良法；試劑盒說明書法；酚仿抽提法

隨著人類基因組全序列的公布，分子生物學(xué)研究取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，人們對基因的研究也越來越深入，而模板 DNA 提取的質(zhì)量是進(jìn)行基因組研究的基本前提[1]。在分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中，用于提取 DNA的樣本多種多樣，包括血液、唾液、尿液、糞便、腦脊液以及組織等[2]。其中，血液可以作為基因組 DNA 的便捷來源，從血液中提取全基因組 DNA 是進(jìn)行各種分子遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，聚合酶鏈反應(yīng)、限制性內(nèi)切酶處理、突變檢測、基因型分型以及連鎖分析等遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)對于DNA的質(zhì)和量都有較高的要求[3]。因此使用一種操作簡單、快捷高效的提取方法對于進(jìn)一步的基因分型及分子育種具有重要意義。目前，許多實(shí)驗(yàn)室都開展了基因組方面的研究工作，對于基因組DNA的提取各實(shí)驗(yàn)室也采用不同的提取方法，本研究將對3種常規(guī)的 DNA提取方法[酚氯仿法，硅膠膜吸附法(天根血液基因組DNA提取試劑盒-離心柱型)，改良的硅膠膜吸附法]進(jìn)行比較分析，從而獲得一種安全、高效、快速的DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器

無水乙醇、Tris-酚、氯仿、蛋白酶 K、EDTA、ddH2O、DNA 提取試劑盒離心柱型 (北京天根生化科技公司)、超微量核酸分析儀(Nanodrop 2000 美國)、離心機(jī)(Thermo Sorvall ST16R 美國)、移液器(Eppendorf 德國)、恒溫水浴鍋、凝膠成像系統(tǒng)(UVI FireReader 英國)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本處理方法 新鮮水牛血樣2 mL (肝素鈉抗凝)加2 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻，室溫放置至上清為透明紅色，離心去上清，重復(fù) 3～4次至沉淀為白色。

1.2.2 試劑盒改良法 血液樣本經(jīng)細(xì)胞裂解液Buffer CL(NH4Cl)處理至白色沉淀后置于4℃過夜，除了裂解過程，其它步驟均按照天根血液基因組 DNA 提取試劑盒說明書操作，所得DNA 溶于70 μL ddH2O中。

1.2.3 離心柱型試劑盒抽提法 全程完全按照天根血液基因組 DNA 提取試劑盒說明書操作，所得DNA溶于70 μL ddH2O中。

1.2.4 酚仿抽提法 裂解過夜后，離心，收集白色沉淀，加入600 μL DNA抽提緩沖液，20 μL 蛋白酶K，55℃ 過夜，期間顛倒混勻數(shù)次。次日加入600 μL飽和酚，垂直混勻10 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清。300 μL飽和酚與300 μL氯仿混勻，加入上步所得上清，垂直混勻10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清。加入600 μL氯仿，垂直混勻10 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清。加入1 200 μL 無水乙醇，離心，取絮狀沉淀，用70%酒精洗滌，風(fēng)干后溶于70 μL ddH2O中。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 三種方法所抽提DNA的濃度及純度用超微量核酸分析儀(Nanodrop 2000 )檢測，結(jié)果用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析，\%P\%<0.05認(rèn)為差異顯著，\%P\%>0.05為差異不顯著。DNA含量(ng)=濃度(ng/μL)×體積(μL)；DNA純度= OD260/280

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法抽提水牛全血基因組含量

運(yùn)用超微量核酸分析儀檢測比較水牛DNA提取液濃度， 計算出2 mL所提取的水牛血液DNA含量，試劑盒改良法所提取DNA含量顯著高于其它兩種方法，如表1。

表1 不同方法抽提水牛全血基因組含量比較

2.2 不同方法抽提水牛全血基因組純度比較

運(yùn)用超微量核酸分析儀檢測所提取的水牛血液DNA OD260/280，三組純度OD260/280都在1.8附近，而試劑盒法更趨近1.8顯著優(yōu)于酚仿抽提法，如表2。

表2 不同方法抽提水牛全血基因組OD260/280比較

2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測

使用 1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，將DNA樣品與加樣緩沖液按1:1的比例混勻加入加樣孔中，當(dāng)溴酚藍(lán)移到距凝膠前沿1～2 cm 時，停止電泳，取出凝膠，在 245 nm 紫外燈下照相記錄電泳圖譜，圖1.A顯示瓊脂糖電泳DNA帶型整齊、集中、無拖尾現(xiàn)象，說明所提取基因組DNA完整無降解；圖1.B瓊脂糖電泳DNA帶型整齊、集中、個別樣本有拖尾現(xiàn)象；圖1.C瓊脂糖電泳DNA帶型略有拖尾現(xiàn)象。

圖1 不同抽提方法所得DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.4 PCR擴(kuò)增檢測

以三組提取的基因組為模板進(jìn)行stat5基因PCR擴(kuò)增，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖2所示。

圖2 三種方法提取基因組的stat5基因PCR擴(kuò)增

3 討論

3.1 試劑盒改良法在提取效果上的優(yōu)勢

核酸提取是下游操作和分析的前提，高質(zhì)量核酸的獲取是下游基因組實(shí)驗(yàn)成功進(jìn)行的關(guān)鍵因素之一。哺乳動物血液由血漿和血細(xì)胞構(gòu)成，而血細(xì)胞中又包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板三類細(xì)胞，這三類細(xì)胞中只有白細(xì)胞含有細(xì)胞核，核內(nèi)含有遺傳物質(zhì)基因組DNA[4]。本實(shí)驗(yàn)中，試劑盒改良法主要通過充分裂解紅細(xì)胞，從而達(dá)到了提高基因組提取濃度和純度的效果(表1)。王大明等[5]報道了血液樣本反復(fù)凍融雖對提取基因組的純度無影響但卻降低了基因組數(shù)量(濃度)。本試驗(yàn)中改良法采用了裂解過夜的方法，如若不能及時做后續(xù)處理，則可在4℃較長時間保存，既可使裂解充分，又不影響后面的操作，避免了血液樣本未能及時處理反復(fù)凍融造成提取基因組的損失。值得注意的是，該法裂解過夜并非簡單添加裂解液放置過夜，而是將首輪裂解離心沉淀后的紅-白細(xì)胞混合物再次添加裂解重懸放置過夜，目的在于使白細(xì)胞核基因組的充分釋放，如若多次離心沉淀后再裂解過夜則有可能在這一過程中損失了大量的DNA。從產(chǎn)出量方面考慮，酚仿抽提法和試劑盒改良法提取的DNA產(chǎn)量最高，而采用酚仿抽提法提取的DNA純度卻不及試劑盒改良法。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)后發(fā)現(xiàn)試劑盒改良后并不影響DNA的質(zhì)量，對后續(xù)的基因組研究無不良影響，電泳圖中有些條帶略有抹帶現(xiàn)在可能是由于DNA濃度過高或者基因組發(fā)生降解的緣故，本試驗(yàn)的不足之處在于沒有進(jìn)一步探討其中的原因。從PCR擴(kuò)增結(jié)果看，圖2為stat5基因PCR擴(kuò)增結(jié)果(1514 bp)，三種方法提取的基因組DNA均可作為PCR擴(kuò)增模版，且擴(kuò)增效果良好，條帶清晰，片段大小準(zhǔn)確。由此可見試劑盒改良法可以確保獲得穩(wěn)定的DNA質(zhì)量和數(shù)量，保證實(shí)驗(yàn)室DNA模板的正常使用。

3.2 試劑盒改良法在在時效性和安全性上的優(yōu)勢

從時效性看，完全按照試劑盒說明書提取便捷省時，單個樣品可在30min內(nèi)操作完畢[6]，但是提取的DNA 濃度較低。酚仿抽提法所提取的DNA基本沒有蛋白質(zhì)殘余，適合做各種分析，但操作繁瑣，抽提步驟多，耗時長，這一點(diǎn)與陳麗霞等報道相符[7]。試劑盒改良法除了裂解部分需過夜外，其它操作與試劑盒說明書操作方法無異。從安全環(huán)保方面看，氯仿對人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心、肝、腎、皮膚具有損害，對環(huán)境、水體可造成污染，易爆，疑可致癌。低劑量的酚對皮膚、粘膜有強(qiáng)烈腐蝕作用，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，損害肝、腎功能，高劑量可致死。酚仿抽提法使用酚試劑對人體有傷害，試劑盒說明書提取和改良法避免了使用有毒的苯酚、氯仿等有毒試劑，減少了操作過程中對操作人員身體健康的損害且有助于環(huán)保。

4 結(jié)論

酚仿抽提法提取DNA效率高、成本低，但對人體危害大，不安全；試劑盒法操作簡便、省時，但成本高，效率較低；而經(jīng)試劑盒法改良的基因組抽提方法能夠大幅度提高水牛血液基因組的提取效率，是一種安全、高效、便捷、快速的 DNA 提取方法，具有推廣價值。

[1] 王小飛, 陳玉紅和王惠民. 人類基因組 DNA 四種不同抽提方法比較[J]. 陜西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn), 2001,16(4):9-10.

[2] TAN S C and YIAP B C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present[J]. BioMed Research International, 2009.

[3] SHAMS S S, VAHED S Z, SOLTANZAD F, et al. Highly effective DNA extraction method from fresh, frozen, dried and clotted blood samples[J]. BioImpacts: BI, 2011,1(3):183.

[4] 成令忠, 組織與胚胎學(xué)[M]. 1990, 北京:人民衛(wèi)生出版社.

[5] 王大明, 李楨, 鄒紅巖等. 全血抽提基因組 DNA 數(shù)量與純度影響因素的探討[J]. 江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn), 2005,23(4):297-298.

[6] 王春艷, 鄭旭, 高月等. 兩種動物組織 DNA 提取方法的比較[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī), 2012,41(10):57-59.

[7] 陳麗霞, 張振昶,謝小冬,等. 3 種提取全血基因組 DNA 的方法比較[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2014. 33(5):1110-1113

Optimization of Methods for Genomic Extraction of Buffalo Blood

LU Xing-rong, PANG Chun-ying, DENG Ting-xian, ZHU Peng, DUAN An-qin, LIANG Xian-wei*

(GuangxiBuffaloResearchInstituteofChineseAcademyofAgriculturalScience,TheKeyLaboratoryofBuffaloGeneticsBreedingandReproductioninGuangxi,Nanning,Guangxi, 530001,China)

【Objective】The aim of this study was to obtain an security, efficient and rapid DNA extraction method by comparing three genomic DNA extraction methods of buffalo, which would lay the foundation for gene function in buffalo.【Method】 In this study, a total of 43 anticoagulant blood samples of buffalo were collected. Eachblood samples were randomly divided into three equal parts, and the volume of every part is 2 mL. Modified blood DNA Kit method, Blood DNA Kit instruction method and phenol-chloroform extraction method were used to extract the genomic DNA from blood sample of same individual, respectively. Then, several contents, including the content of DNA, OD260/280, agar sugar gel rubber electrophoresis and gene amplification, were compared by using these three extraction methods. 【Result】 A significantly difference was found in the content of DNA by using these three extraction methods, and the order from high to low was the modified Blood DNA Kit method, phenol extraction and Blood DNA Kit instruction method (1376.72 ± 127.54 VS 1121.32 ± 81.64 VS 326.18 ± 21.17, \%P\%<0.05). Moreover, comparing the value of OD260/280, it was added by order, and there was not significant difference between modified Blood DNA Kit method and Blood DNA Kit instruction method (1.85±0.0017 VS 1.86 ± 0.0021,\%P\%>0.05), but it was significant differences among the phenol-chloroform extraction and other two groups (1.85±0.0017 VS 1.88±0.0029, 1.86±0.0021 VS 1.88±0.0029,\% P\%< 0.05). Interestingly, the results of agarose gel electrophoresis by using these three DNA extraction groups showed that the DNA strap of modified Blood DNA Kit method and Blood DNA Kit instruction method was clear and high opticaldensity, but the DNA strap of phenol extraction method was fuzzy and towing. By amplifing stat5 gene, the results of three methods showed clear and accurate straps, and had good amplification effect consistently.【Conclusion】Compared with the Blood DNA Kit instruction method and phenol-chloroform extraction method, modified Blood DNA Kit method is a safer , more efficient and more convenient method for genomic extraction of buffalo blood.

buffalo blood；genomic extraction；modified Blood DNA Kit method；Blood DNA Kit instruction method；phenol-chloroform extraction method

2015-12-10 修改日期:2015-12-30

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重點(diǎn)項(xiàng)目(2014ZX08010-012B)；水?；?1504004)

陸杏蓉(1987-)，廣西百色人，女，壯族，實(shí)習(xí)研究員，碩士研究生，研究方向：動物繁殖生物技術(shù)，luxingrong074@163.com.

梁賢威(1962-)，研究員，主要從事動物繁殖生物技術(shù)研究，liangbri@126.com。

S813

A

1001-9111(2016)02-0028-04