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(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院診斷學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)心血管疾病研究所)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

1,25-二羥維生素D3對棕櫚酸誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

陳雯1，朱肖2，馮聚玲1，李熠1，游詠1，桂慶軍1，尹凱1,2*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院診斷學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)心血管疾病研究所)

目的研究1,25-二羥維生素D3(1,25(OH)2D3)對棕櫚酸(PMA)誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響及其機(jī)制。方法用1,25(OH)2D3(10 nmol/L)和/或PMA(250 μmol/L)處理THP-1巨噬細(xì)胞6 h，采用熒光定量PCR和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-10的表達(dá)水平；用1,25(OH)2D3和/或PMA處理THP-1巨噬細(xì)胞60 min，采用免疫印跡(Western-blot)法檢測AMPKα1和磷酸化AMPKα1(p-AMPKα1)水平。結(jié)果1,25(OH)2D3(10 μmol/L))明顯抑制PMA(250 μmol/L)作用下THP-1巨噬細(xì)胞TNFα、IL-1β和IL-6的表達(dá)，并上調(diào)IL-10的表達(dá)；1,25(OH)2D3顯著上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞AMPKα1的磷酸化水平。結(jié)論1,25(OH)2D3抑制PMA誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，該效應(yīng)可能與其激活A(yù)MPKα1有關(guān)。

1,25-二羥維生素D3； 棕櫚酸； 巨噬細(xì)胞； 炎癥反應(yīng)

維生素D(Vitamin D，VD)是一種脂溶性維生素，主要由皮膚合成和食物攝取。近來研究發(fā)現(xiàn)，VD不僅參與調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣磷代謝，其水平還與多種慢性炎癥疾病，如肥胖、2型糖尿病和動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)等的發(fā)生呈顯著負(fù)相關(guān)，提示VD可能對體內(nèi)代謝性因素引起的慢性炎癥具有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。VD進(jìn)入血液后，經(jīng)肝臟25-羥化酶和腎臟共同作用轉(zhuǎn)化為具有活性的1,25-二羥維生素D3(1,25-dihydroxyvitamin D3,1,25(OH)2D3)。研究報(bào)道1,25(OH)2D3能夠抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)[2]。本實(shí)驗(yàn)組前期發(fā)現(xiàn)，1,25(OH)2D3能夠調(diào)節(jié)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞膽固醇流出，并促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M2型極化[3]。血清游離脂肪酸(Free fat acid，F(xiàn)FA)水平升高是肥胖和2型糖尿病的主要脂質(zhì)代謝紊亂特征，然而1,25(OH)2D3是否調(diào)節(jié)FFA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥尚不明確。本研究擬探討1,25(OH)2D3對棕櫚酸(PMA)誘導(dǎo)的THP-1巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響和機(jī)制，為進(jìn)一步研究VD與慢性代謝性疾病的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑棕櫚酸購自Sigma公司；1,25(OH)2D3購自美國Peprotech公司；人單核細(xì)胞株(THP-1)購自中科院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞中心；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清和小牛血清購自杭州四季清生物工程材料有限公司；兔抗人AMPKα1單克隆抗體和兔抗人AMPKα1 (phospho T172)多克隆抗體購自ABCam公司；小鼠抗人GAPDH單克隆抗體購自康成生物科技公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗購自武漢博士德公司；TNFα、IL-1β、IL-6和IL-10 ELISA試劑盒購自R&D Systems公司；引物均由上海生物工程公司合成；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人單核細(xì)胞株(THP-1)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)液中加10 mmol/L的羥乙基哌秦乙硫磺酸(HEPES)和青霉素、鏈霉素各1.0×105U/L。在每次實(shí)驗(yàn)前用160 nmol/L佛波酯(PMA)孵育THP-1細(xì)胞12 h，使其誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)胞。

1.3實(shí)時(shí)定量PCR 將1 μg總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)反轉(zhuǎn)錄成20 μL cDNA。采用應(yīng)用生物系統(tǒng)7900HT(Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，試劑盒為FINNZYMES公司的DyNAmoTMSYBR?Green qPCR Kits。擴(kuò)增混合體系包括：去離子水13.5 μL,Master Mix 15 μL,cDNA 1μL,Primer 0.5 μL,共30 μL。溶解曲線分析表明PCR反應(yīng)產(chǎn)物為單獨(dú)的雙鏈DNA。用ΔΔCt值法，以GAPDH表達(dá)為內(nèi)參定量其它基因的表達(dá)。人TNFα引物序列為：上游 5′-CAGAGGGAATTCC CCAG-3′，下游：5′-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3′；人IL-1β引物序列為：上游 5′-ATGGCACAAGTACCTAAGCTCGC-3′，下游：5′-ACACAAATTGCATGGTGAAGTC AGTT-3′；人IL-6引物序列為：上游 5′-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3′，下游：5′-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3′；人IL-10引物序列為：上游 5′-GACTCCAA GAGA AAGGCATCTAC-3′，下游：5′-CCCTGATGTCTCAGTTTCGTATC-3′；人GAPDH引物序列：上游 5′-GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA-3′，下游 5′-GAGTCC TTCCACGATACCAAAG-3′。

1.4 ELISA法檢測炎癥因子表達(dá)THP-1細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于96孔板，以含10%的胎牛血清(FCS)培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞。按不同處理因素進(jìn)行處理，處理前加無血清培養(yǎng)基，處理后收集培養(yǎng)基，存儲于-20 ℃冰箱備用。按說明書方法，將100 μL樣品和標(biāo)準(zhǔn)品加入板孔，蓋上封板膜，室溫孵育1～2 h?？廴タ變?nèi)液體，重復(fù)洗板3次。加入50～100 μL生物素標(biāo)記抗體，孵育1～2 h?？廴タ變?nèi)液體，又重復(fù)洗板3次。加入抗生物素蛋白鏈菌素-HRP，室溫孵育30 min。重復(fù)洗板3次后，加入顯色劑，室溫孵育10～20 min。終止反應(yīng)后，用450 nm波長讀值。

1.5 Western-blot技術(shù)檢測AMPKα1和p-AMPKα1表達(dá)將收集好的細(xì)胞進(jìn)行裂解，于4 ℃離心10 min，棄除沉淀，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。上樣緩沖液調(diào)各組蛋白量一致，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠(AnyKD)，100 mV電泳2 h后轉(zhuǎn)移(4 ℃，100 mA，2 h)至PVDF膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果，并確定蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的位置。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h，按1∶500加入兔抗人AMPKα1或p-AMPKα1或GAPDH(1∶1000)一抗，4 ℃培育過夜，TBST洗三次，1∶1000 加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫培育1 h，TBST洗三次，用Western blot免疫印跡熒光檢測試劑盒激發(fā)熒光，結(jié)果用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)獲取各條帶的光密度值(OD值)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 1,25(OH)2D3抑制PMA誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)用1,25(OH)2D3(10 nmol/L)和/或PMA(250 μmol/L)處理THP-1巨噬細(xì)胞6 h，采用熒光定量PCR和ELISA法檢測TNFα、IL-1β、IL-6和IL-10的表達(dá)水平。如圖1和圖2所示，1,25(OH)2D3(10 nmol/L)顯著抑制PMA(250 μmol/L)作用下THP-1巨噬細(xì)胞TNFα、IL-1β和IL-6的表達(dá)，并上調(diào)IL-10的表達(dá)水平。

圖1 1,25(OH)2D3對PMA作用下THP-1巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響(n=3) 熒光定量PCR法檢測TNFα(左上圖)、IL-1β(右上圖)、IL-6(左下圖)和IL-10(右下圖)mRNA的表達(dá)(1,25(OH)2D3+PMA 與PMA組比較，*：P<0.05)

2.2 1,25(OH)2D3上調(diào)PMA作用下THP-1巨噬細(xì)胞AMPKα1磷酸化用1,25(OH)2D3處理THP-1巨噬細(xì)胞不同時(shí)間(0，15,30,60,120 min)，采用Western-blot檢測AMPKα1和磷酸化AMPKα1的表達(dá)，如圖3所示，1,25(OH)2D3上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞磷酸化AMPKα1水平。選擇60 min為時(shí)間點(diǎn)，如圖4所示，PMA下調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞AMPKα1磷酸化，而1,25(OH)2D3顯著上調(diào)PMA(250 μmol/L)作用下THP-1巨噬細(xì)胞AMPKα1磷酸化水平。

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國超過90%以上的人群存在VD缺乏(參照美國內(nèi)分泌學(xué)會指南，血清25-羥膽鈣化醇(25(OH)D3)含量低于20 ng/mL為VD缺乏，低于30 ng/mL為VD不足)，提示VD缺乏是我國重要的健康問題[4]。除了參與鈣磷代謝，VD缺乏與多種慢性炎癥疾病密切相關(guān)，然而VD與上述疾病是否存在直接因果關(guān)系尚不明確[1]。1,25(OH)2D3是VD在體內(nèi)的活性成分，通過與維生素D受體(VDR)結(jié)合，啟動胞內(nèi)機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎癥和抗氧化等作用[5]。在前期研究中，發(fā)現(xiàn)VD能夠顯著促進(jìn)As斑塊巨噬細(xì)胞向抗炎M2型極化，從而抑制As的發(fā)生發(fā)展[3]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3能夠抑制PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，這進(jìn)一步為VD與肥胖/2型糖尿病相關(guān)提供了直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

近來研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞代謝在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞免疫/炎癥過程中起著關(guān)鍵作用[6]。在FFA、游離膽固醇等促炎因素作用下，巨噬細(xì)胞脂肪酸氧化(Fatty Acid Oxidation，F(xiàn)AO)水平明顯下降，有氧糖酵解(Aerobic Glycolysis，AG)活性顯著增加，導(dǎo)致細(xì)胞呈促炎狀態(tài)，表現(xiàn)為促炎因子TNFα、IL-1β和IL-6的上調(diào)及抗炎因子IL-10的下調(diào)[7-8]。5′單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)是維持細(xì)胞代謝平衡的關(guān)鍵蛋白酶，由α、β和γ 3個(gè)亞基組成的異源三聚體蛋白，其中α亞單位起催化作用，β和γ亞單位起穩(wěn)定作用[9]。研究證實(shí)，肥胖狀態(tài)下ATM的AMPK活性受到顯著抑制，細(xì)胞FAO水平明顯下降，AG活性顯著增加，因此調(diào)節(jié)AMPK活性成為改善胰島素抵抗和2型糖尿病新的靶點(diǎn)[10]。Li等[11]最近報(bào)道VD能夠通過激活A(yù)MPK/mTOR信號增強(qiáng)二甲雙胍對前列腺癌細(xì)胞的抑制作用[11]。VD能夠通過激活自噬介導(dǎo)的AMPK信號減輕魚藤酮引起的神經(jīng)損傷[5]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)PMA能夠下調(diào)AMPKα1的磷酸化水平，而VD能夠顯著上調(diào)PMA作用下THP-1巨噬細(xì)胞AMPKα1的磷酸化水平，提示AMPKα1活化可能參與了VD對PMA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞促炎/抗炎因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。然而，VD抑制PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞FAO/AG，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)。

圖2 1,25(OH)2D3對PMA作用下THP-1巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響(n=3) ELISA法檢測TNFα(左上圖)、IL-1β(右上圖)、IL-6(左下圖)和IL-10(右下圖)的表達(dá)(1,25(OH)2D3+PMA與PMA組比較，*：P<0.05)

圖3 1,25(OH)2D3對THP-1巨噬細(xì)胞AMPKα1和p-AMPKα1表達(dá)的影響(n=3) Western blot法檢測AMPKα1和p-AMPKα1表達(dá)(與0 min組比較，*：P<0.05)

圖4 1,25(OH)2D3對PMA作用下THP-1巨噬細(xì)胞AMPKα1和p-AMPKα1表達(dá)的影響(n=3) Western blot法檢測AMPKα1和p-AMPKα1表達(dá)(與control組比較，*：P<0.05；與PMA組比較，#：P<0.05)

綜上，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)VD抑制PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，并激活THP-1巨噬細(xì)胞AMPKα1磷酸化水平，這將為肥胖和2型糖尿病的防治提供一種新的思路。

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1,25-dihydroxyvitaminD3SuppressesPalmiticAcid-inducedInflammatoryCytokinesExpressionintheTHP-1Macrophage

CHEN Wen，ZHU Xiao，F(xiàn)ENG Juling，et al
(ResearchLabofTranslationalMedicine,MedicalSchool,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of 1,25-dihydroxyvitamin D(1,25(OH)2D3) on palmitic acid(PMA)-induced inflammatory cytokines expression in THP-1 macrophage.MethodsThe THP-1 macrophages were cultured and incubated with 1,25(OH)2D3(10 nmol/L) and/or PMA(250 μmol/L) for 6h.The RT-PCR and ELISA technology were used to detect mRNA and protein expression of inflammatory cytokines including TNFα,IL-1β,IL-6 and IL-10 in different groups.The THP-1 macrophages were treated with 1,25(OH)2D3and/or PMA for 60min.The westernblot technology was used to detect the expression of AMPKα1 and AMPKα1 phosphorylation.Results1,25(OH)2D3obviously abolished the effect of PMA on the expression of inflammatory cytokines including TNFα,IL-1β,IL-6 and increased the expression of IL-10 in THP-1 macrophages.1,25(OH)2D3significantly promoted the phosphorylation of AMPKα1 in THP-1 macrophages.Conclusion1,25(OH)2D3can suppress PMA-induced inflammatory cytokines expression in THP-1 macrophages via regulation of AMPKα1 phosphorylation.

1,25-dihydroxyvitamin D； palmitic acid； macrophage； inflammation

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2016.04.008

2016-04-09；

2016-06-28

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81100213，81470569)；南華大學(xué)博士啟動基金(2015XQD49)；南華大學(xué)留學(xué)歸國人員啟動基金(2015XQD55).

*通訊作者，E-mail：kaiyinby@hotmail.com.

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