張艷欣，楊 鑫*，謝冰潔，佘永新，杜鵬飛，鄒 攀，

金 芬2，金茂俊2，邵 華2，王珊珊2，鄭鷺飛2，王 靜2*

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081)

?

基于HPLC/Q-TOF MS的4種農(nóng)藥聯(lián)合暴露人群的代謝組學(xué)研究

張艷欣1，楊 鑫1*，謝冰潔2，佘永新2，杜鵬飛2，鄒 攀1，

金 芬2，金茂俊2，邵 華2，王珊珊2，鄭鷺飛2，王 靜2*

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081)

采用基于高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-TOF MS) 的代謝組學(xué)方法，研究了啶蟲(chóng)脒、高效氯氟氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽4種農(nóng)藥聯(lián)合暴露所致的施藥人群尿液中內(nèi)源性代謝物的變化。采集30位農(nóng)民噴灑4種復(fù)合農(nóng)藥前和噴灑農(nóng)藥期1，3，5，7 d的尿液進(jìn)行檢測(cè)。提取正常尿液中常見(jiàn)代謝物并通過(guò)質(zhì)控樣品評(píng)價(jià)手段進(jìn)行分析，結(jié)果表明該方法具有良好的穩(wěn)定性和精密度，可用于尿液中代謝物分析。多變量分析結(jié)果表明，暴露人群施藥前后尿液的代謝物含量存在較大差異。對(duì)選取的36個(gè)差異離子進(jìn)行鑒定，確定了8個(gè)生物標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示聯(lián)合暴露組人群尿液中多巴胺、5-羥色胺、酪氨酸、色氨酸、?；撬岷婉R尿酸的含量顯著下降；犬尿素和肌酸的含量顯著上升。4種農(nóng)藥聯(lián)合暴露導(dǎo)致接觸人群尿液中色氨酸代謝途徑的中間產(chǎn)物含量降低，肝代謝和能量代謝相關(guān)的代謝物蓄積，可能與神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟功能的受損有關(guān)。

聯(lián)合農(nóng)藥；代謝組學(xué)；高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用；生物標(biāo)志物

近年來(lái)，農(nóng)藥中毒一直是農(nóng)民的主要職業(yè)危害和農(nóng)村的主要公共衛(wèi)生問(wèn)題，由于農(nóng)作物多種病蟲(chóng)害并存且害蟲(chóng)普遍表現(xiàn)出耐藥性，農(nóng)民越來(lái)越多地將多種農(nóng)藥混合使用[1]。目前混配農(nóng)藥在殺蟲(chóng)劑登記品種中占相當(dāng)大的比例，農(nóng)藥中毒報(bào)告也證實(shí)農(nóng)藥混劑中毒事件逐年增多，對(duì)使用者的健康造成嚴(yán)重威脅[2]。因此，對(duì)不同殺蟲(chóng)劑混配后的聯(lián)合毒性和機(jī)制進(jìn)行評(píng)估意義重大。

多種農(nóng)藥暴露導(dǎo)致的健康危害很難簡(jiǎn)單地通過(guò)對(duì)污染物進(jìn)行傳統(tǒng)毒性試驗(yàn)而推斷其綜合毒性效應(yīng)。而代謝組學(xué)可通過(guò)分析機(jī)體體液中代謝物譜的變化，探索機(jī)體的整體生物學(xué)狀態(tài)[3-7]。中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所伍一軍課題組[8]以目前我國(guó)常用的化學(xué)農(nóng)藥毒死蜱和甲萘威為研究對(duì)象，通過(guò)基于核磁共振(NMR)的代謝組學(xué)方法，得到了連續(xù)單獨(dú)及混合染毒農(nóng)藥90 d的大鼠血清的1H NMR代謝物譜。通過(guò)模式識(shí)別技術(shù)和多元變量分析發(fā)現(xiàn)，毒死蜱和甲萘威單獨(dú)染毒及復(fù)合染毒均可引起大鼠肝臟線粒體能量和脂肪酸代謝紊亂?；蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)是研究毒物毒性和毒性機(jī)制的有效手段，然而有些毒物可能不影響基因的調(diào)節(jié)和表達(dá)，因此單從基因組和蛋白質(zhì)組的角度并不能非常準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)毒物的毒性[9-10]。但當(dāng)毒物進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)引起生物體內(nèi)多種不同代謝路徑上的內(nèi)源性代謝物的比例、濃度發(fā)生變化[11]。將這些代謝物信息與生理過(guò)程中的生物學(xué)變化聯(lián)系，可進(jìn)一步確定相關(guān)毒物的特異性生物標(biāo)志物。Bonvallot等[12]應(yīng)用HPLC-MS/MS技術(shù)分析法國(guó)糧食作物產(chǎn)區(qū)布列塔尼83名孕婦的尿液，發(fā)現(xiàn)處于農(nóng)藥暴露區(qū)域的孕婦代謝譜異常，甘氨酸和蘇氨酸等上調(diào)，檸檬酸下調(diào)。Wolff等[13]采集紐約地區(qū)不同民族的404位多氯聯(lián)苯、乙烯和有機(jī)磷職業(yè)暴露者的尿液，發(fā)現(xiàn)對(duì)氧磷酶發(fā)生明顯改變，可作為以上幾種污染物的生物標(biāo)志物。

本文收集山西省萬(wàn)榮縣周王村4種農(nóng)藥復(fù)合暴露人群的尿液進(jìn)行毒性評(píng)估，該村土地面積4 000余畝，耕地面積3 700多畝，其中3 000畝土地種植桃樹(shù)，農(nóng)藥使用劑量大。本次噴灑的4種農(nóng)藥為啶蟲(chóng)脒(陜西美邦農(nóng)藥有限公司)、高效氯氟氰菊酯(陜西美邦農(nóng)藥有限公司)、聯(lián)苯菊酯(青島東生藥業(yè)有限公司)、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(青島東生藥業(yè)有限公司)，噴灑周期為7 d。以噴灑復(fù)合農(nóng)藥的農(nóng)民作為復(fù)合農(nóng)藥職業(yè)暴露人群，利用基于高效液相色譜法-飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-TOF MS)聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法分析其尿液樣本，通過(guò)多元變量分析找出農(nóng)藥暴露前后不同時(shí)間點(diǎn)的差異代謝物，并和代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，找出潛在的生物標(biāo)志物，為毒理學(xué)家了解人體接觸環(huán)境中的多種農(nóng)藥可能引起的復(fù)合毒性效應(yīng)提供了重要基礎(chǔ)，也為預(yù)防醫(yī)學(xué)工作者在制定農(nóng)藥復(fù)合污染毒性的防治策略方面提供了有價(jià)值的參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫1200系列高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent Technologies公司)；QSTARTMElite飛行時(shí)間質(zhì)譜(美國(guó)AB Sciex 公司)，配有ESI 源；Waters XBridge C8色譜柱(5 μm，150 mm×2.1 mm)；乙腈、甲醇、甲酸(色譜純,Aldrich公司)；超純水由美國(guó)Milli-Q 超純水系統(tǒng)(Millipore，Billerica，USA) 制備。

1.2 暴露人群以及樣品采集

暴露人群是來(lái)自山西省萬(wàn)榮縣周王村的30位噴灑復(fù)合農(nóng)藥的農(nóng)民，年齡分布在43～70周歲之間，其中43～50周歲3人；50～60周歲11人；60～70周歲16人。男女各15人。均為了解實(shí)驗(yàn)步驟和目的后自愿參加樣品收集和調(diào)查試驗(yàn)。因整個(gè)農(nóng)藥噴灑過(guò)程為7 d，所以采集每個(gè)農(nóng)民噴灑農(nóng)藥前1 d和噴灑農(nóng)藥期間1，3，5，7 d的晨尿。尿樣采集后立即裝入冰盒中寄送至實(shí)驗(yàn)室，分裝后于-80 ℃保存。

1.3 生物樣品制備

實(shí)驗(yàn)前將尿液樣本在室溫下解凍，于4 ℃以12 000 r/min 高速離心15 min除去尿液中的蛋白，用超純水將尿液上清液稀釋4倍，避免濃度太高污染儀器，渦旋振蕩1 min，過(guò)0.22 μm 水系濾膜，裝樣品瓶待測(cè)。 質(zhì)控樣品(QC) 的制備:將處理后上機(jī)待測(cè)的尿液樣本各取100 μL渦旋振蕩混合，取1 mL裝樣品瓶待測(cè)。上機(jī)檢測(cè)時(shí)，每5個(gè)待測(cè)樣品間穿插1個(gè)QC樣品。

1.4 色譜條件及質(zhì)譜條件

安捷倫1200系列高效液相色譜儀，流動(dòng)相:A為0.1%甲酸水，B為乙腈，C為甲醇。梯度洗脫程序:0～2 min，90% A；2～40 min，90%～5% A并保持10 min；50～51 min，5%～90% A并保持10 min，回到初始流動(dòng)相比例；40～50 min，30% B，其他時(shí)間為0% B。流速300 μL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

利用QSTARTMElite TOFMS(美國(guó) AB Sciex 公司)正離子掃描模式，霧化氣(GS1)為60 psi，霧化氣(GS2)為50 psi，氣簾氣(Curtain gas)為25 psi，離子源溫度為500 ℃，聚焦電壓為265 V，去簇電壓為80 V。采用Analyst QS 2.0(美國(guó) AB Sciex 公司)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。

1.5 LC-MS 數(shù)據(jù)處理、多變量分析以及生物標(biāo)記物鑒定

圖1 尿液代謝物的總離子流圖( TIC)Fig.1 Total ion chromatogram of a urine sample

將通過(guò)HPLC-TOF MS方法獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkerViewTM1.2.1(AB Sciex) 數(shù)據(jù)分析軟件，以每個(gè)樣品的峰面積作為變量進(jìn)行提取，所有樣品通過(guò)保留時(shí)間和質(zhì)荷比進(jìn)行峰對(duì)齊、歸一化處理，獲得校正后的原始數(shù)據(jù)矩陣。對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis，PCA)，得到得分圖(Score plot)和載荷圖(Loading plot)，并從載荷圖中的離散點(diǎn)選取差異變量離子，進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。PCA模型的質(zhì)量可以通過(guò)R2Y(擬合度)和Q2(預(yù)測(cè)性)兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，這兩個(gè)參數(shù)值大于0.5，并且越接近1，表明PCA模型越優(yōu)秀。

圖2 尿液中13種常見(jiàn)代謝物的提取離子流圖(XIC)Fig.2 Extracted ion chromatograms of 13 common metabolites in urine sample1.1-methyl adenosine(1-甲基腺苷),2.hypoxanthine nucleoside(次黃嘌呤核苷),3.cytidine(胞苷),4.histidine(組氨酸),5.phenylalanine(苯丙氨酸),6.threonine(蘇氨酸),7.trypto-phan(色氨酸),8.kynurenic acid(犬尿烯酸),9.isoleucine(異亮氨酸),10.serotonin(5-羥色胺),11.gallic acid(沒(méi)食子酸),12.tyrosine(酪氨酸),13.vanillic acid(香草酸)

由于以上步驟只得到差異代謝物的質(zhì)荷比，并不確定其元素組成和分子式等信息，鑒定其具體結(jié)構(gòu)難度較大。本研究采取以下方法進(jìn)行代謝物鑒定:①找出差異代謝物離子，通過(guò)精確質(zhì)量數(shù)預(yù)測(cè)可能的元素組成。②根據(jù)該代謝物的高分辨一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，推斷其可能的結(jié)構(gòu)類型，并結(jié)合代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)(HMDB，MassBank，Metlin 和KEGG)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。③對(duì)于有市售標(biāo)準(zhǔn)品的差異代謝物，通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)和高分辨二級(jí)質(zhì)譜，確認(rèn)其最終結(jié)構(gòu)。

圖3 尿液代謝物的主成分分析(PCA)得分圖Fig.3 Results of principal component analysis (scores plot)0 d,1 d,3 d,5 d,7 d,QC samples

2 結(jié)果與討論

2.1 基于HPLC-TOF MS技術(shù)的尿液代謝物分析

尿液作為體內(nèi)代謝物排出的主要途徑，廣闊覆蓋了體內(nèi)代謝物，尤其是水溶性和極性大的代謝物含量豐富。本研究對(duì)3種類型的色譜柱進(jìn)行優(yōu)化，分別比較了Agilent Eclipse XDB C8色譜柱、Agilent Eclipse XDB C18色譜柱、Waters XBridge C8色譜柱的效果，最后選擇分離效果最好的Waters XBridge C8色譜柱，可在較高的流速下實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源性代謝物高響應(yīng)強(qiáng)度的分析。圖1為優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件后對(duì)農(nóng)藥暴露的尿液樣本進(jìn)行分析的總離子流圖，可以看到，色譜峰均勻分布在整個(gè)洗脫過(guò)程，可檢測(cè)到665個(gè)色譜峰。圖2為從正?？瞻啄蛞褐刑崛?-甲基腺苷、次黃嘌呤核苷、胞苷、組氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、犬尿烯酸、異亮氨酸、5-羥色胺、沒(méi)食子酸、酪氨酸和香草酸13種尿液中常見(jiàn)物質(zhì)的提取離子流圖(XIC)(尿液常見(jiàn)化合物數(shù)據(jù)查自HMDB數(shù)據(jù)庫(kù))，各離子均可提取得到，且峰形良好。因此該方法可用于對(duì)尿液中代謝物的考察。

2.2 數(shù)據(jù)模式識(shí)別分析

采用MarkerViewTM1.2.1( AB Sciex)軟件以尿液質(zhì)譜峰面積作為變量進(jìn)行PCA。該軟件內(nèi)置了峰提取、峰對(duì)齊、峰歸一化和保留時(shí)間校正功能，選擇Pareto Scaling模式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。從總?cè)藬?shù)為30的樣本中去除分布在95%置信區(qū)間外的2個(gè)樣本，再去除由于個(gè)體差異導(dǎo)致的噴灑農(nóng)藥前一天因人體個(gè)體差異不能聚集的21個(gè)樣本，最后用7個(gè)樣本做PCA分析。PCA得分圖和相應(yīng)的載荷圖見(jiàn)圖3～4。PCA分析結(jié)果表明，R2Y和Q2分別為82%和76%，表明該P(yáng)CA模型有良好的擬合度和預(yù)測(cè)性，可用于數(shù)據(jù)分析。由圖3可見(jiàn)，QC樣本聚集在一小區(qū)域內(nèi)，表明方法穩(wěn)定性、精密度良好。噴灑農(nóng)藥前1 d的樣本和噴灑農(nóng)藥后第1 d的樣本有部分重疊，在噴灑農(nóng)藥第3 d后，各時(shí)間點(diǎn)的樣本完全分開(kāi)，無(wú)交叉和重疊，表明隨著人群和農(nóng)藥的接觸，尿液中的代謝物發(fā)生明顯變化。而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，尿液中代謝物的含量變化越來(lái)越大。由圖4可見(jiàn)，大多數(shù)變量點(diǎn)集中在原點(diǎn)附近，只有少數(shù)點(diǎn)遠(yuǎn)離原點(diǎn)，正是這些點(diǎn)所代表的代謝物造成了不同時(shí)間點(diǎn)樣品組間差異。確定這些差異代謝物離子的分子結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有可能發(fā)現(xiàn)反映毒性作用的潛在生物標(biāo)志物。

圖4 尿液代謝物的主成分分析(PCA)載荷圖(loading plot)Fig.4 Results of principal component analysis(loading plot)

2.3 生物標(biāo)記物的質(zhì)譜鑒定結(jié)果及相應(yīng)代謝通路分析

表1 暴露于4種農(nóng)藥后人尿液中的代謝生物標(biāo)志物

Table 1 LC-MS/MS data of the discriminated metabolites related to multiple pesticides exposure and their identification results

m/zRT(min)MolecularformulaIdentificationresultsPathwaysConcentration153079027C8H11NO2Dopamine(多巴胺)Tyrosinemetabolism(酪氨酸代謝)下調(diào)2080848131C10H12N2O3Kynurenine(犬尿素)Tryptophanmetabolism(色氨酸代謝)上調(diào)1760950137C10H12N2O5?Hydroxytryptamine(5?羥色胺)Tryptophanmetabolism(色氨酸代謝)下調(diào)181073930C9H11NO3Tyrosine(酪氨酸)Phenylalaninemetabolism(苯丙氨酸代謝)下調(diào)204089998C11H12N2O2Tryptophan(色氨酸)Tryptophanmetabolism(色氨酸代謝)下調(diào)1250147407C2H7NO3STaurine(?；撬?Bileacidmetabolism(初級(jí)膽酸合成代謝)下調(diào)1310695158C4H9N3O2Creatine(肌酸)Glycine，threonine，argininemetabolism(甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸代謝)上調(diào) 179058223C9H9NO3Hippuricacid(馬尿酸)Phenylalaninemetabolism(苯丙氨酸代謝)下調(diào)

圖5 HPLC-TOF MS/MS獲得的m/z132.069 5 的代謝物的一級(jí)質(zhì)譜圖(A)和二級(jí)質(zhì)譜圖(B)

Fig.5 MS spectra of precursor ion(A) and product ion(B) ofm/z132.069 5 obtained by HPLC-TOF MS/MS

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，暴露于農(nóng)藥混劑后農(nóng)民尿液中的色氨酸水平異常低。作為神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺和褪黑激素的唯一合成前體，色氨酸的耗竭會(huì)導(dǎo)致大腦中的5-羥色胺和褪黑激素枯竭。由于5-羥色胺是一種有效的食欲抑制劑，該化合物的缺乏會(huì)導(dǎo)致暴飲暴食和肥胖[14]。在炎癥條件下，色氨酸被炎癥部位的淋巴組織轉(zhuǎn)化為犬尿氨酸，并由原位的巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞貯存起來(lái)[15]。因此可以預(yù)期，色氨酸耗竭很可能是由接觸農(nóng)藥后產(chǎn)生的炎癥所致。巨噬細(xì)胞通過(guò)IPO吞沒(méi)色氨酸生成犬尿素,本研究中犬尿素量的升高也印證5-羥色胺水平降低的事實(shí)。5-羥色胺是一種重要的控制人的情緒、食欲和睡眠的神經(jīng)遞質(zhì)，人的抑郁、自閉、老年癡呆與肥胖均與5-羥色胺的內(nèi)在失衡有關(guān)。重型抑郁癥常伴隨著免疫系統(tǒng)的活化，“炎癥性與神經(jīng)變性假說(shuō)”已被用于描述此種現(xiàn)象[16]。抑郁癥和睡眠差的病人的血清中含有較低水平的色氨酸，以及炎癥性的血清標(biāo)志物如白介素-6和白介素-8。這一代謝通路的擾動(dòng)提示混合農(nóng)藥污染物可能引起免疫和神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

由于多巴胺是由酪氨酸及其前體物苯基丙氨酸合成的，已經(jīng)證實(shí)酪氨酸和苯基丙氨酸的減少誘導(dǎo)多巴胺在腦中濃度減少。大腦黑體中多巴胺信號(hào)的減少是帕金森癥的關(guān)鍵特征，并且帕金森和接觸殺蟲(chóng)劑有關(guān)(如除草劑百草枯[17])。盡管更多種類的農(nóng)藥還未在這一層面上被研究，然而有報(bào)道表明，接觸草甘膦的線蟲(chóng)的大腦中一定區(qū)域的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生了病變[18]。這個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)和人的黑質(zhì)紋狀體的多巴胺系統(tǒng)非常接近，而多巴胺系統(tǒng)與帕金森癥有關(guān)[19]。

本研究還發(fā)現(xiàn)復(fù)合農(nóng)藥暴露后農(nóng)民尿液中的?；撬岷棵黠@降低。?；撬釁⑴c膽汁酸的生物合成，?；撬崃康淖兓c肝毒性密切相關(guān)，經(jīng)常被認(rèn)為是肝受損時(shí)的尿液標(biāo)志物[20]。有資料顯示，影響肝臟中線粒體氧化磷酸化的因素會(huì)導(dǎo)致其能量代謝障礙，進(jìn)而影響合成馬尿酸的能力，因此馬尿酸常被看作是肝能量代謝的負(fù)荷指標(biāo)[21]。本研究暴露后的農(nóng)民尿液中馬尿酸含量顯著降低，表明肝受損。肌酸是磷酸肌酸的前體物質(zhì)，主要存在于肝臟中并與能量代謝關(guān)系密切。有文獻(xiàn)證實(shí)，大鼠經(jīng)四氯化碳暴露后，尿液中肌酸的含量明顯升高是由于肝損傷所造成[22-23]。本研究尿液中的肌酸顯著升高，提示其毒性機(jī)制可能為肝損傷導(dǎo)致的代謝異常。

3 結(jié) 論

本研究將LC-TOF MS 代謝譜分析應(yīng)用于施藥人群暴露于多種農(nóng)藥后尿液的代謝物分析，通過(guò)PCA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到含量隨采樣時(shí)間點(diǎn)變化的36個(gè)差異離子作為感興趣離子，并通過(guò)精確質(zhì)量數(shù)匹配、多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照的方法鑒定出其中8 個(gè)代謝物，分別為多巴胺、犬尿素、5-羥色胺、酪氨酸、色氨酸、牛磺酸、肌酸和馬尿酸。標(biāo)志物的生物功能表明復(fù)合農(nóng)藥可造成人的氨基酸代謝異常，以及肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷等多種毒性效應(yīng)。這些效應(yīng)與4種農(nóng)藥通過(guò)抑制昆蟲(chóng)神經(jīng)軸突部位的傳導(dǎo)，麻痹害蟲(chóng)的神經(jīng)中樞而殺死害蟲(chóng)的機(jī)制相一致[24]。表明人體暴露在這4種農(nóng)藥中會(huì)產(chǎn)生類似于對(duì)昆蟲(chóng)的毒性作用。該方法基于我國(guó)多種農(nóng)藥共存污染的現(xiàn)狀，應(yīng)用新技術(shù)開(kāi)展對(duì)多種農(nóng)藥聯(lián)合暴露的復(fù)合效應(yīng)研究，對(duì)完善農(nóng)藥毒性識(shí)別機(jī)制，建立毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方法和人類健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系具有重要意義。

[1] Barr D B,Angerer J.Environ.HealthPerspect.,2006,114(11):1763-1769.

[2] Barr D B,Needham L L.J.Chromatogr.B,2002,778(1/2):5-29.

[3] Dettmer K,Hammock B D.Environ.HealthPerspect.,2004,112(7):396-397.

[4] Bradman A,Castorina R,Barr D B,Chevrier J,Harnly M E,Eisen E A,McKone T E,Harley K,Holland N,Eskenazi B.Int.J.Environ.Res.PublicHealth,2011,8(4):1061-1083.

[5] Bradman A,Whitaker D,Quiros L,Castorina R,Claus Henn B,Nishioka M,Morgan J,Barr D B,Harnly M,Brisbin J A,Sheldon L S,Mckone T E,Eskenazi B.J.ExposureSci.Environ.Epidemiol.,2007,17(4):331-349.

[6] Braun J M,Daniels J L,Poole C,Olshan A F,Hornung R,Bernert J T,Khoury J,Needham L L,Barr D B,Lanphear B P.PaediatricandPerinatalEpidemiology,2010,24(6):524-534.

[7] Vlaanderen J,Moore L E,Smith M T,Lan Q,Zhang L,Skibola C F,Rothman N,Vermeulen R.Occup.Environ.Med.,2010,67(2):136-143.

[8] Wang H P,Liang Y J,Long D X,Chen J X,Hou W Y,Wu Y J.Chem.Res.Toxic.,2009,22(6):1026-1033.

[9] Bino R J,Hall R D,Fiehn O,Kopka J,Saito K,Draper J,Nikolau B J,Mendes P,Roessner-Tunali U,Beale M H,Trethewey R N,Markus Lange B,Wurtele E S,Sumner L W.TrendsPlantSci.,2004,9(9):418-425.

[10] D′Adamo P,Ulivi S,Beneduci A,Pontoni G,Capasso G,Lanzara C,Andrighetto G,Hladnik U,Nunes V,Palacin M,Gasparini P.AminoAcids,2010,38(1):65-73.

[11] Ma X L,Meng L,Li X X,Li L L,Wang Y,Mao X M.J.Instrum.Anal.(馬曉麗,孟磊,李新霞,李琳琳,王燁,毛新民.分析測(cè)試學(xué)報(bào)),2014,33(6):621-627.

[12] Bonvallot N,Tremblay-Franco M,Chevrier C,Canlet C,Warembourg C,Cravedi J P,Cordier S.PloSOne,2013,8(5):e64433.

[13] Wolff M S,Engel S,Berkowitz G,Teitelbaum S,Siskind J,Barr D B,Wetmur J.PediatricRes.,2007,61(2):243-250.

[14] Moffett J R,Namboodiri M A.Immunol.CellBiol.,2003,81(4):247-265.

[15] Mbongue J C,Nicholas D A,Zhang K,Kim N S,Hamilton B N,Larios M,Zhang G,Umezawa K,Firek A F,Langridge W H R.PloSOne,2015,10(2):e0118562.

[16] Maes M,Yirmyia R,Noraberg J,Brene S,Hibbeln J,Perini G,Kubera M,Bob P,Lerer B,Maj M.MetabolicBrainDisease,2009,24(1):27-53.

[17] Costello S,Cockburn M,Bronstein J,Zhang X,Ritz B.Am.J.Epidemiol.,2009,169(8):919-926.

[18] Samsel A,Seneff S.Entropy,2013,15(4):1416-1463.

[19] Negga R,Rudd D A,Davis N S,Justice A N,Hatfield H E,Valente A L,Fields A S,Fitsanakis V A.Neurotoxicology,2011,32(3):331-341.

[20] Waterfield C J,Turton J A,Scales M D C,Timbrell J A.Arch.Toxicol.,1993,67(4):244-254.

[21] Balkan J,Kanbangli O,Aykac-Toker G,Uysal M.Biol.Pharm.Bull.,2002,25(9):1231-1233.[22] Holmes E,Nicholls A W,Linton J C,Ramos S,Spraul M,Neidig P,Connor S C,Connelly J,Damment S J P,Haselden J,Nicholson J K.NMRBiomed.,1998,11(4/5):235-244.

[23] Barr D B,Wilder L C,Caudill S P,Gonzalez A J,Needham L L,Pirkle J L.Environ.HealthPerspect.,2005,113(2):192-200.

[24] Ansari R W,Shukla R K,Yadav R S,Seth K,Pant A B,Singh D,Agrawal A K,Islam F,Khanna V K.Toxicol.Lett.,2012,211(1):1-9.

Metabolomics Tools for Describing Complex Pesticide Exposure in Occupational Population by HPLC/Q-TOF MS

ZHANG Yan-xin1,YANG Xin1*,XIE Bing-jie2,SHE Yong-xin2,DU Peng-fei2,ZOU Pan1,JIN Fen2,JIN Mao-jun2,SHAO Hua2,WANG Shan-shan2,ZHENG Lu-fei2,WANG Jing2*

(1.School of Chemical Engineering & Technology,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China；2.Institute of Quality Standard & Testing Technology for Agro-Product,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

Based on high performance liquid chromatography combined with time of flight mass spectrometry(HPLC-TOF MS),the metabolomics method was established to evaluate the urine samples collected from 30 farmers,an occupational exposure population in Zhouwang village,Shanxi province,P.R.China.These people were exposed to a circumstance with acetamiprid,lambda-cyhalothrin,bifenthrin acetate and methyl amino abamectin benzoate.The urine samples were detected before the exposure,and at the first day,the third day,the fifth and seventh day after the exposure. Extracting 10 common metabolites in urine and quality control samples showed that the method has high precision and reliability.Principal component analysis(PCA) score plot was used to separate the urinary metabolic profiles from the different time urine sample,and the results showed that the urine metabolic profiles before and after the exposure to pesticide were obvious different.36 different ions were found by PCA loading plot model,in which 8 ions were identified by retrieving metabolites database and identified with standard.The most statistically significant changes were observed for dopamine,serotonin,tyrosine,tryptophan,taurine and hippuric acid(downward trend),canine urea and creatine(upward trend).This work suggests that an exposure to pesticide mixtures induces metabolism disturbance.It is inferred that the pesticide mixtures could lead to tryptophan metabolism intermediates decreased,accumulation of hepatic and energy metabolism change may related with the nervous system and liver function damage.These changes of metabolites existed in nervous and liver system are consistent with the mechanism of four kinds of pesticides which could cause damage to insecticidal nervous system.

pesticide mixtures；metabolomics；high performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry(HPLC-TOF MS)；biomarkers

2015-11-05；

2015-12-02

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程“農(nóng)業(yè)化學(xué)污染物殘留檢測(cè)及行為研究”創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助；中國(guó)科技部基礎(chǔ)性專項(xiàng)(2013FY110100)

研究報(bào)告

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.05.001

O657.63;F767.2

A

1004-4957(2016)05-0501-07

*通訊作者：楊 鑫，博士，教授，研究方向:食品質(zhì)量與安全研究，Tel:0451-86282910，E-mail:yangxin@hit.edu.cn 王 靜，博士，教授，研究方向:食品安全與檢測(cè)技術(shù)，Tel:010-82106568，E-mail:w-jing2001@126.com