李梅花

（云南省宜良縣北古城鎮(zhèn)人民政府，云南宜良652112）

復(fù)合酵母在赤霞珠發(fā)酵過程中酵母菌相互作用研究

李梅花

（云南省宜良縣北古城鎮(zhèn)人民政府，云南宜良652112）

利用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基對發(fā)酵過程不同階段分離的菌株進行初步分類，結(jié)果表明，這些菌株分為5屬8種：釀酒酵母（Saccharomyces serevisiae）、有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、克魯維畢赤氏酵母（Pichia kluyveri）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis），假絲酵母(Candida)。對初步分類菌株進行26S rDNAD1/D2區(qū)擴增和測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast比對后證實，研究了這幾種酵母在不同階段的構(gòu)成比，揭示了整個過程中酵母菌的生物多樣性和不同菌種的動態(tài)變化。在此基礎(chǔ)上選用interdelta分析對161株釀酒酵母進行菌株區(qū)分，結(jié)果顯示,這些釀酒酵母可歸為9個基因型。研究了這9個基因型在復(fù)合發(fā)酵過程中的菌株組成及變化，為利用降酸酵母降酸研究提供依據(jù)。

復(fù)合發(fā)酵； 分類鑒定； 相互作用； interdelta分析； 葡萄酒

葡萄酒發(fā)酵過程是一個復(fù)雜的生態(tài)和生化過程，包含不同酵母屬種此消彼長的變化。多種酵母在發(fā)酵過程中的相互協(xié)作，可以有效地增加葡萄酒風(fēng)味的多樣性，但也可能影響葡萄酒質(zhì)量的穩(wěn)定性。研究發(fā)酵過程中酵母菌的動態(tài)變化，揭示在發(fā)酵不同階段中酵母菌的消長規(guī)律，有利于葡萄酒發(fā)酵過程中對微生物的控制，也可以為研究酵母菌對葡萄酒風(fēng)味的影響提供依據(jù)。

本實驗通過WL營養(yǎng)瓊脂聚類分析、26S rDNAD1/ D2和interdelta等方法和手段，對所采集的菌株進行較系統(tǒng)的分類鑒定，探究葡萄酒復(fù)合酵母發(fā)酵過程中酵母菌的種類、分布及特性，旨在揭示赤霞珠葡萄復(fù)合發(fā)酵過程中酵母菌的消長規(guī)律，為葡萄酒微生物降酸研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

葡萄原料：赤霞珠（CabernetSauvignon）。

試劑：葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂等培養(yǎng)基成分試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，引物、dNTPs、Taq酶、PCR buffer、MgCl2等分子生物學(xué)試劑。

儀器設(shè)備：霉菌培養(yǎng)箱、電熱鼓風(fēng)干燥箱、潔凈工作臺、冰箱、pH計、凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、PCR擴增儀、研磨式勻漿機、臺式冷凍離心機、M ilipore超純水制備系統(tǒng)、高壓蒸汽滅菌鍋。

1.2培養(yǎng)基

YEPD液體培養(yǎng)基：酵母浸粉10g/L（1%），蛋白胨20g/L（2%），葡萄糖20g/L（2%），氯霉素100 mg/L（0.01%），蒸餾水。121℃高壓滅菌20m in。

YEPD固體培養(yǎng)基：酵母浸粉10g/L（1%），蛋白胨20g/L（2%），葡萄糖20g/L（2%），氯霉素100 mg/L（0.01%）,瓊脂20g/L（2%），蒸餾水。121℃高壓滅菌20m in。

WL瓊脂培養(yǎng)基配方：酵母浸粉4g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，磷酸二氫鉀0.55g/L，氯化鉀0.425g/L，氯化鈣0.125g/L，硫酸鎂0.125g/L，氯化鐵0.0025g/L，硫酸錳0.0025g/L，溴甲酚綠22 mg/L，瓊脂20g/L，調(diào)pH5.5～6.5。

配制方法：先將鹽類和溴甲酚綠配制成儲備液，置于4℃冰箱。

儲備液A：磷酸二氫鉀5.5g，氯化鉀4.25g，氯化鈣1.25g，硫酸鎂1.25g，使用蒸餾水定容至400m L，高壓滅菌后4℃保存，使用時按40m L/1000m L加入。

儲備液B：氯化鐵0.25g，硫酸錳4.25g，蒸餾水定容至100m L，高壓滅菌后4℃保存，使用時按1m L/1000m L加入。

儲備液C：溴甲酚綠0.44g，溶解于100m L 50%乙醇溶液中（配制50%乙醇溶液時所有使用的器皿和蒸餾水都需經(jīng)高壓滅菌），使用時按1m L/1000m L加入。

配制培養(yǎng)基時按比例加入儲備液A和儲備液B以及剩余培養(yǎng)基組分，加入蒸餾水至目標體積，調(diào)節(jié)pH5.5～6.5。高壓滅菌后冷卻至65℃加入儲備液C，混勻制備平板。

1.3實驗方法

1.3.1菌株的分離保藏

將葡萄破碎，用20 L已預(yù)先滅菌的玻璃發(fā)酵瓶，每瓶加入15 L帶葡萄皮的葡萄汁，取其中2瓶作為對照，在另3個瓶中按接種表中組合加入酵母，置于25℃恒溫下進行發(fā)酵。

其中1號、2號罐在破碎入罐后分別加入活性干酵母（RC212）和降酸酵母（R312）；3號罐破碎入罐后同時加入兩種酵母；4號罐破碎時加入R312，2 d后加入RC212；5號罐破碎時加入RC212，2 d后加入R312。

酵母菌的分離分別在葡萄酒發(fā)酵過程的前期、中期、后期3個時期取樣。前期從葡萄破碎進罐至發(fā)酵啟動（此時罐底部有少量氣泡向頂部上升）；中期即發(fā)酵旺盛期(此時葡萄皮渣上升形成“冒”，罐內(nèi)大量氣泡上升)；后期為發(fā)酵消退期(此時液面又降至初期，發(fā)酵醪中無明顯氣泡上升)。于發(fā)酵的前、中、后期，每次取1m L發(fā)酵液，稀釋至適當(dāng)梯度，取0.2 m L樣品稀釋液涂布YEPD和WL平板，28℃下分別培養(yǎng)3 d和5 d，選取合適稀釋濃度的平板進行總酵母菌和不同類別酵母菌的計數(shù)。在YPD平板上，每個時期隨機挑取15～20個酵母單菌落，于20%甘油中保藏備用。

1.3.2菌株的初步形態(tài)分類

將保藏的酵母菌種在25℃下于5m LYEPD液體培養(yǎng)基中活化24 h，用接種環(huán)劃線接種于WL營養(yǎng)培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中28℃下倒置5 d后觀察，記錄菌落顏色和形態(tài)，對照WL菌落特征表進行初步分類。

1.3.326S rDNAD1/D2區(qū)序列分析

1.3.3.1總DNA的提取

①用接種環(huán)取平板上菌落2～4環(huán)于200μL裂解液中，加入3/10總體積石英砂在勻漿機振蕩8min，每隔2m in將離心管取出用力甩幾下（如果菌齡過大可將破壁時間延長），然后65℃水浴10m in。

②加入200μL 5mol/LKAc，冰浴8m in。

③14000 r/m in×5m in轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中。

④加入3mol/LNaAc 35μL，加入異丙醇200μL混勻后，冰浴8m in，14000 r/m in×5m in收集沉淀。

⑤200μL TE溶解，加入RNase 3μL，65℃水浴10m in。

⑥加入200μL氯仿-異戊醇（24∶1）,抽提。

⑦轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，加入35μL 3mol/L NaAc及390μL無水乙醇，混勻后以14000 r/m in×8m in收集DNA。

⑧用150μL 70%乙醇洗滌沉淀，吹干后TE溶解，-20℃保藏。

1.3.3.226S rDNAD1/D2區(qū)擴增

①PCR引物。使用引物NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和 NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）。

②PCR體系（50μL）。每管中含PCR緩沖液（10×）5.0μL；25mM MgCl23.0μL；10mM dNTP 1.0μL；10μM NL1和NL4各1μL；0.5U/μLDNA聚合酶3μL；10μg/μL模板DNA 1.0μL；最后添加ddH2O定容到50μL。

③PCR反應(yīng)程序

95℃預(yù)變性5m in，94℃變性1m in，52℃退火1min，72℃延伸80 s；循環(huán)36次；再72℃延伸8m in。

1.3.3.326S rDNAD1/D2區(qū)序列測定

所得產(chǎn)物委托生物技術(shù)公司測序。

1.3.3.4測序結(jié)果分析

根據(jù)測序結(jié)果，利用BLAST軟件從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索（BLAST search），比較供試菌株與已知酵母菌相應(yīng)序列的相似程度。序列的搜索，可以得到該酵母菌株在這段序列上與其他親緣關(guān)系相近的已知酵母菌的相關(guān)信息，因為絕大多數(shù)已發(fā)表的種的26S rDNA的Dl/D2區(qū)、ITS序列已經(jīng)在EMBL/DDBJ/GenBank中。因此，可以根據(jù)同源搜索的結(jié)果初步確定所做菌株的分類地位。

1.3.4酒酵母的interdelta分析

1.3.4.1總DNA的提取

具體操作同上1.3.3.1。

1.3.4.2interdelta區(qū)擴增

①PCR引物

采用引物為delta12(5′-TCAACAATGGAATCCCAAC-3′)和delta21(5′-CATCTTAACACCGTATATGA-3′)。

②PCR體系（25μL）

5×PCR buffer（Taq buffer w ith KCL）5μL；25 mMMgCl25μL；1mM dNTPs 5μL；10μM引物各1.25μL；5 U/μL Taq酶0.4μL，模版DNA 1μL；加ddH2O（雙蒸水）至25μL。

③PCR反應(yīng)程序

95℃4m in；95℃30 s，46℃30 s，72℃90 s，循環(huán)35次；72℃10m in。

1.3.4.3PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

①稱取1.5%瓊脂糖，加入40m L 1×TAE加熱至膠完全融化，待膠冷卻至60℃左右時，加入4μLEB，搖勻。

②放好梳子，將液體倒在制膠槽內(nèi)，3～5mm厚，除氣泡。

③室溫下放置待膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽，然后小心地拔掉梳子，保持點樣孔完整。

④將7～8μL PCR產(chǎn)物與2μL上樣緩沖液一次點到加樣孔內(nèi)，其中1個為對照樣品。

⑤60～100 V恒溫電泳，當(dāng)溴酚藍染料移至距凝膠前沿1～2 cm處，停止電泳。

⑥取出凝膠，用紫外分析儀（300 nm）觀察，并照相記錄。

1.3.4.4圖譜統(tǒng)計及聚類分析

對照100 bp DNA Marker的電泳譜帶，將特定位置上的PCR產(chǎn)物電泳譜帶按“1”(有)和“0”（無）進行人工讀帶并統(tǒng)計，應(yīng)用DPS軟件進行聚類分析。聚類距離為歐式距離，聚類方法為類平均法（UPGMA）。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株的初步培養(yǎng)分類結(jié)果

本實驗直接取樣稀釋，取不同的梯度樣劃線于WL培養(yǎng)基。最后選取合適梯度計數(shù)，共分離857株酵母，并初步可以分為：釀酒酵母（Saccharomyces serevisiae），有孢漢遜酵母（Hanseniaspora），克魯維畢赤氏酵母（Pichia kluyveri），東方伊薩酵母（Issatchenka orientalis），假絲酵母（Candida species）。其代表性菌株的菌落形態(tài)見圖1。

2.2菌株26S rDNAD1/D2區(qū)序列分析

使用引物對NLI/NL4對所挑選出的20個菌株的26S rRNA基因序列進行擴增，測定其片斷大小在550～620 bp之間。經(jīng)BLAST分析，與菌株26S rRNA基因序列相似性最大的酵母菌見表1。

2.3酵母菌群的種類組成和變化

5組對照實驗發(fā)酵過程中菌種組成和變化見表2、表3、表4、表5、表6。

觀察以上結(jié)果，破碎時期一般以葡萄汁有孢漢遜酵母和克魯維畢赤氏酵母為主，還有少量東方伊薩酵母等。在培養(yǎng)過程中，釀酒酵母慢慢增多，葡萄汁有孢漢遜酵母、克魯維畢赤氏酵母等其他酵母逐漸減少，最后釀酒酵母占主導(dǎo)地位，其他酵母基本消失。

表2中主要以釀酒酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母為主，少數(shù)其他酵母。前期釀酒酵母少，葡萄汁有孢漢遜酵母為主，中期則相反，后期大多釀酒酵母，少數(shù)葡萄汁有孢漢遜酵母。

表3中破碎期到前期，葡萄汁有孢漢遜酵母減少，釀酒酵母突然增多。前期到中期，釀酒酵母減少，葡萄汁有孢漢遜酵母增多，后期，釀酒酵母又增多，葡萄汁有孢漢遜酵母消失。

表4中還是以釀酒酵母和葡萄汁有孢漢遜酵母為主，釀酒酵母前期到中期略有降低，葡萄汁有孢漢遜酵母略有升高，后期只剩釀酒酵母。

表5中前期到中期釀酒酵母降低，葡萄汁有孢漢遜酵母升高，最后只剩釀酒酵母。和表3變化情況相似，只是比例變化高低不同。

表6中前期2種酵母比例和表2相近，中期釀酒酵母比例明顯低于表2，葡萄汁有孢漢遜酵母比例明顯高于表2。

圖1　8種酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

表2　1號酒樣菌株WL營養(yǎng)培養(yǎng)基聚類結(jié)果(釀酒酵母)

表3　2號酒樣菌株WL營養(yǎng)培養(yǎng)基聚類結(jié)果(降酸酵母)

表4　3號酒樣菌株WL營養(yǎng)培養(yǎng)基聚類結(jié)果(釀酒酵母+降酸酵母)

表5　4號酒樣菌株WL營養(yǎng)培養(yǎng)基聚類結(jié)果(降酸酵母，2 d后加入釀酒酵母)

由以上實驗分析可以說明：此降酸酵母也是釀酒酵母的一種；釀酒酵母是酒精發(fā)酵的主要酵母；此降酸酵母在前期中期有助于葡萄汁有孢漢遜酵母增長，抑制其他釀酒酵母和自身的繁殖。即此降酸酵母在和釀酒酵母的前期中期競爭中取勝，后期失??；有1種未知酵母受此降酸酵母影響較大。

2.4釀酒酵母interdicts分析

2.4.1釀酒酵母interdelta分類情況

將以上實驗分離到的161株釀酒酵母進行interdelta PCR，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到相應(yīng)的圖譜，根據(jù)電泳圖譜的差異將全部釀酒酵母分為9種基因型，分類情況見表7。

2.4.2釀酒酵母基因型組成及變化

本實驗應(yīng)用interdelta分析區(qū)分釀酒酵母種內(nèi)不同的基因型，達到了展示復(fù)合發(fā)酵過程中釀酒酵母不同基因型的組成及變化的效果，見表8。

實驗中，釀酒酵母基因型在各時段變化如下：

表6　5號酒樣菌株WL營養(yǎng)培養(yǎng)基聚類結(jié)果(釀酒酵母，2 d后+降酸酵母)

表7　161株釀酒酵母的interdel ta分析結(jié)果

表8　赤霞珠復(fù)合發(fā)酵過程中釀酒酵母的基因型種類、數(shù)量、比例

(1)在開始添加活性干酵母的發(fā)酵過程中分出2種基因型：Ⅵ和Ⅷ。其中Ⅵ是添加酵母，從開始到最后一直存在，并漸漸占主導(dǎo)地位，Ⅷ少量出現(xiàn)，變化不大。

(2)在開始添加降酸酵母的發(fā)酵過程中分離出2種基因型：Ⅲ和Ⅳ。其中Ⅳ是添加降酸酵母，前期較多，中期減少，最后很多，主導(dǎo)發(fā)酵。Ⅲ發(fā)酵過程中一直增長，但增幅較小。

(3)在開始同時添加降酸酵母和活性干酵母的發(fā)酵過程中分離出6種基因型：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ。前中期主要以Ⅰ和Ⅴ為主，Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ少量出現(xiàn)。后期Ⅴ較多，其他幾種都在減少，出現(xiàn)Ⅲ。

(4)在開始加入降酸酵母，2 d后加入干酵母的發(fā)酵過程中分離出3種基因型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。前期Ⅰ和Ⅲ為主，漸漸Ⅲ減少，Ⅰ增多，最后Ⅰ占主導(dǎo)地位，后期出現(xiàn)少量Ⅱ。

(5)在開始加入干酵母，2 d后加入降酸酵母的發(fā)酵過程中分離出3種基因型：Ⅵ、Ⅷ和Ⅸ。Ⅵ在此過程中漸漸變多主導(dǎo)發(fā)酵，Ⅷ、Ⅸ開始不存在，中后期突然出現(xiàn)。

3　結(jié)論

破碎時期一般以葡萄汁有孢漢遜酵母和克魯維畢赤氏酵母為主，還有少量東方伊薩酵母等。釀酒酵母數(shù)量緩慢增多，葡萄汁有孢漢遜酵母、克魯維畢赤氏酵母等其他酵母逐漸減少，最后釀酒酵母占主導(dǎo)地位，其他酵母基本消失。

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Interactionsof Yeast Strains in the Fermentation Processof Cabernet Sauvignon

LIMeihua
(People'sGovernmentof Beigu,Yiliang,Yunnan 652112,China)

WL nutrientagar culturemedium was used for preliminary classification of strains isolated from different fermentation process.The results suggested that those strainsbelonged to 5genera including S.cerevisiae,Hanseniaspora uvarum,Pichia kluyveri,Issatchenkia orientalis and Candida.Then 26S rDNA D1/D2 amplification and sequencing of the isolated strains were performed.The sequencing results through Blast comparison indicated the constituent ratio of these strains in different fermenting stage and further revealed the bio-diversity of yeast strainsand the dynamic changeof differentbacteria species.On thisbasis,161 yeaststrainswere classified into 9gene typesby using interdelta analysis.Furthermore,the composition and the change of yeaststrainsof these 9gene types in compound fermentationwere investigated to provideevidence for theutilization of acid-reducing yeaststrains.(Trans.by YUEYang)

compound fermentation;classification and identification;interaction;interdeltaanalysis

TS261.1；TS262.6；TS261.4

A

1001-9286（2016）11-0060-05

10.13746/j.njkj.2016254

2016-08-15

李梅花(1975-)，女，云南宜良人，工程師，研究方向為葡萄栽培與釀酒。