劉　青，李志勇，張洋子，龐世琦，潘丙珍

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東廣州510623； 2.廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510623)

葡萄酒中5-羥甲基糠醛含量的測定

劉青1，2，李志勇1，2，張洋子1，2，龐世琦1，2，潘丙珍1，2

(1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東廣州510623； 2.廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510623)

葡萄酒中的5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfura，5-HMF）是生產(chǎn)及儲存過程中由熱降解反應(yīng)而生成的產(chǎn)物，可以作為衡量葡萄酒是否過度受熱和儲存時間是否過長的指標(biāo)。研究建立了高效液相色譜測定葡萄酒中5-HMF的方法，方法準(zhǔn)確靈敏，重復(fù)性好。采用該法對我國河北昌黎、膠東半島、天津和甘肅4個葡萄酒產(chǎn)區(qū)，以及法國、澳洲、葡萄牙和南非等41支國產(chǎn)和進(jìn)口葡萄酒中的5-羥甲基糠醛含量進(jìn)行測定，檢出樣品中羥甲基糠醛的含量范圍為1.25～85.5mg/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為我國葡萄酒品質(zhì)監(jiān)控提供有益的參考。

葡萄酒； 5-羥甲基糠醛； 高效液相色譜

5-羥甲基糠醛（5-HMF），又名5-羥甲基-2-呋喃甲醛，廣泛存在于含糖類物質(zhì)的食品中，如果汁、啤酒、蜂蜜、牛奶和果酒等[1]。葡萄酒由于生產(chǎn)及儲存過程中不可避免發(fā)生熱降解反應(yīng)（蔗糖的焦化及還原糖的分解）從而導(dǎo)致5-HMF的產(chǎn)生或含量增加[2-3]。近年來，5-HMF的含量已成為衡量許多食品是否過度受熱和儲存時間是否過長的指標(biāo)。

研究表明，5-HMF可能會引發(fā)并促進(jìn)結(jié)腸小囊異常生長（ACF），還具有一定程度的基因毒性[4]。一定劑量的5-HMF被機(jī)體吸收后，會對眼、黏膜或皮膚有刺激性攝入過多會引起中毒，造成動物橫紋肌麻痹和肝臟、腎臟、心臟等內(nèi)臟器官損害[2-3，5]。目前國際上對5-HMF的毒副作用仍存有爭議，歐盟食品安全委員會食品添加劑香料、加工助劑及食品接觸材料科學(xué)小組認(rèn)為每人每天攝入HMF的上限為1.6mg[3]，但也有相關(guān)文獻(xiàn)報道5-HMF的每日允許攝入量為30～60mg[5]。國外多個食品協(xié)會已規(guī)定部分食品中5-HMF的含量，如美國香味料和萃取物質(zhì)制造者協(xié)會規(guī)定5-HMF在酒類中的限量為10.0mg/kg[3]。然而，目前我國大部分食品中5-HMF的含量尚未有明確的限量標(biāo)準(zhǔn)，僅有國家標(biāo)準(zhǔn)GH/T 18796—2012《蜂蜜》規(guī)定了蜂蜜中5-HMF的限量為40mg/kg[6]，其他食品包括葡萄酒均無限量要求。在GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中也并未規(guī)定5-HMF的限量要求，且允許按實(shí)際生產(chǎn)需求添加[7]。

食品中5-HMF的測定方法多使用紫外吸光光度法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法或氣相色譜-質(zhì)譜法[8-15]，所適用的檢測對象主要是啤酒、黃酒、蜂蜜、乳制品等食品[9-13]。本文通過實(shí)驗(yàn)，建立了葡萄酒中5-羥甲基糠醛的檢測方法，方法操作簡便，準(zhǔn)確靈敏，能夠滿足日常進(jìn)出口葡萄酒該指標(biāo)的檢測需要。采用所建立的方法對國產(chǎn)和進(jìn)口的多支葡萄酒進(jìn)行了檢測，效果滿意。

表1　葡萄酒樣品信息匯總

1　材料與方法

1.1材料及儀器

樣品：由超市購買、產(chǎn)地采樣等方式，收集到我國膠東半島、河北昌黎、天津和甘肅4個葡萄酒產(chǎn)區(qū)及日常進(jìn)口法定委托檢驗(yàn)的葡萄酒共計41個樣品。樣品情況匯總見表1。

試劑：5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥98%，CAS編號：67-47-0，購自Aldrich公司）；甲醇（色譜純）；水采用GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》[16]中規(guī)定的一級水。水相微孔濾膜：0.45μm。

儀器設(shè)備：高效液相色譜儀Waterse2695：配有二極管陣列檢測器，美國Waters公司；水平振蕩器；超聲波水?。环治鎏炱剑焊辛?.01g。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品預(yù)處理

用移液管準(zhǔn)確量取10.0m L的試樣（起泡酒需預(yù)先脫氣：將100m L試樣倒入帶排氣塞的瓶中，在室溫下使用水平振蕩器或超聲波水浴脫氣，直至無氣泡逸出）至100m L的容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容到刻度，混合均勻后經(jīng)濾膜過濾后待測。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)品配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取適量的5-羥甲基糠醛的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用10%甲醇水溶液配制成濃度為200mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。該溶液在密封的棕色瓶中于0～4℃下可保存2～3個月。

標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液10.0m L于100m L容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，配成濃度為20.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。該溶液在密封的棕色瓶中于0～4℃下可保存2～3個月。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液0.05m L、0.1m L、0.25m L、0.5m L、1.0m L、2.5m L于10m L容量瓶中，用10%甲醇水溶液定容至刻度，分別配成0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3液相色譜條件

色譜柱：Welch Ulitimate C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；柱溫：30℃；流動相：甲醇+水（1+9，v/v）；檢測波長：284 nm；進(jìn)樣量：10μL；流速：1.0m L/m in。

1.2.4結(jié)果的計算

在上述的色譜條件（1.2.3）下，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品試液中的5-羥甲基糠醛經(jīng)反相液相色譜柱分離后，在二極管陣列檢測器284 nm處進(jìn)行檢測，以保留時間對樣品，結(jié)合光譜圖進(jìn)行定性，標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法對樣品進(jìn)行定量。5-羥甲基糠醛的參考保留時間為10.6m in。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品與標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液中待測物質(zhì)的色譜峰相對保留時間的偏差應(yīng)在2.5%以內(nèi)。同時進(jìn)行空白對照實(shí)驗(yàn)，除不添加樣品試液外，其余步驟相同。

試樣中5-羥甲基糠醛的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式(1)計算獲得，計算結(jié)果應(yīng)扣除空白值。

式中：X——試樣中5-羥甲基糠醛的含量，mg/L；

C——從工作曲線求得的試樣溶液中5-羥甲基糠醛的含量（扣除空白），mg/L；

V——試樣最終的定容體積，m L；

L——試樣的取樣體積，m L。

計算結(jié)果用平行測定的算數(shù)平均值表示，保留2位有效數(shù)字。

2　結(jié)果與討論

2.1方法的驗(yàn)證

2.1.1檢出限和定量限

方法的檢出限采用添加法進(jìn)行實(shí)際測定得到?；诟怕式y(tǒng)計學(xué)的原理，即通過檢測目標(biāo)物質(zhì)5-HMF在葡萄酒典型代表基質(zhì)——紅葡萄酒、白葡萄酒和起泡酒中被有效檢出的概率達(dá)到95%時的濃度水平來確定。對于葡萄酒的3種典型基質(zhì)，以剛好能被有效檢出的濃度水平作為參考濃度，以1～2倍該濃度水平作為參考檢出限LODR獨(dú)立檢測6個以上，計算出其標(biāo)準(zhǔn)偏差SD值；以LODR-3SD、LODR、LODR+3SD 3個濃度水平分別檢測20個標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，剛好有19個樣品能被有效檢出的濃度即為該方法的檢出限。

綜合3種基質(zhì)檢出限的驗(yàn)證試驗(yàn)，該方法葡萄酒中5-HMF的檢出限為0.3mg/L。根據(jù)定量限須滿足“≥3倍檢出限”或其信噪比≥10，初步得出定量限為1.0mg/L。

2.1.2方法線性范圍和回歸方程

選擇0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、5.0mg/L共7個不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過平行測定6次來進(jìn)行驗(yàn)證，以5-HMF濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為y=6.62e+ 004X-1.80e+003，相關(guān)系數(shù)0.9997，該結(jié)果表明，在0.05～5.0mg/L濃度范圍內(nèi)，峰面積與5-HMF濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

2.1.3正確度（回收率）和重復(fù)性

本方法的正確度是通過在空白基質(zhì)中加標(biāo)測定回收率來進(jìn)行驗(yàn)證。分別選擇以定量限、5倍定量限、10倍定量限、20倍定量限4個水平進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個水平重復(fù)進(jìn)行6次平行單獨(dú)測定，測定結(jié)果詳見表2。結(jié)果表明，該方法測定3種典型葡萄酒基質(zhì)中5-HMF含量的總體平均回收率為88.4%～105.3%，方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.268%～3.74%，能夠滿足日常檢測需要。

表2　3種典型葡萄酒基質(zhì)中5-HMF回收率和重復(fù)性結(jié)果

2.1.4穩(wěn)健性

為了驗(yàn)證方法的穩(wěn)健性，選取了本次實(shí)驗(yàn)過程中的主要變量因素，每個變量取2個不同的水平，采用8種組合方式，分別對紅葡萄酒和起泡葡萄酒進(jìn)行分析方法的穩(wěn)健性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表3、表4。

表3　紅葡萄酒穩(wěn)健性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4　起泡酒穩(wěn)健性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行差值檢驗(yàn)，將8個測定值按因素字母的順序分成2組，計算各個因素的影響，如第一個因素柱溫變化的影響可由1/4（s+t+u+v）和1/4（w+x+y+z）之間的差值di給出，其他幾個因素依次類推。再根據(jù)公式計算環(huán)境等因素引起的標(biāo)準(zhǔn)偏差，對紅葡萄酒的5種因素2個水平和起泡葡萄酒的7種因素2個水平進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)果分別見表5和表6。通過將差值di與該分析方法在相同條件下重復(fù)測定的2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差相比較，差值di均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于2倍方法標(biāo)準(zhǔn)偏差，說明該方法穩(wěn)健性良好，各因素對該方法及其結(jié)果不會造成顯著影響，即檢測中某個因素參數(shù)產(chǎn)生微小變動后仍能獲得較為一致、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表5　紅葡萄酒穩(wěn)健性驗(yàn)證試驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計

表6　起泡酒穩(wěn)健性驗(yàn)證試驗(yàn)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2.2葡萄酒樣品中5-HMF含量的測定

使用本方法對收集的41個葡萄酒樣品進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果見表7。

表7　葡萄酒樣品中5-HMF含量分析結(jié)果

由表7可知，有11個葡萄酒樣品中檢出5-HMF，多為半干白葡萄酒和冰葡萄酒，含量范圍為1.25～85.5mg/L，其中甘肅冰葡萄酒中5-HMF含量高達(dá)85.5mg/L。結(jié)合葡萄酒樣品中總糖含量檢測結(jié)果和瓶標(biāo)酒精度值分析，三者存在一定的相關(guān)性，即總糖含量高且酒精度相對較低的樣品，如半干白葡萄酒和冰葡萄酒中5-HMF含量偏高。這可能與葡萄酒釀造工藝有關(guān)系，如使用熱浸提法釀造葡萄酒或添加葡萄濃縮汁生產(chǎn)的葡萄酒可能會產(chǎn)生5-HMF或使其含量升高[17]。樣品中檢出5-羥基甲糠醛的色譜圖和與標(biāo)準(zhǔn)的光譜比較圖分別見圖1和圖2。

圖1　冰葡萄酒中檢出5-HMF的色譜圖

圖2　冰葡萄酒中檢出5-HMF與標(biāo)準(zhǔn)的光譜比較圖

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)研究建立了葡萄酒中5-HMF的高效液相色譜檢測方法，方法操作簡單，靈敏度高，穩(wěn)健性好。采用該方法對41個進(jìn)口和國產(chǎn)不同類型的葡萄酒樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，葡萄酒中酒精度偏低、總糖含量高的半干白葡萄酒和冰葡萄酒中，5-HMF含量相對較高。日常對葡萄酒中5-HMF的監(jiān)控，應(yīng)將半干的白葡萄酒和冰葡萄酒作為重點(diǎn)關(guān)注對象。

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Determ ination of 5-HydroxymethylfurfuralContent inW ine

LIU Qing1,2,LIZhiyong1,2,ZHANG Yangzi1,2,PANG Shiqi1,2and PAN Bingzhen1,2
(1.TechnicalCenterofguangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou,Guangdong 510623;2.Guangdong Key Lab of Importand ExportTechnicalMeasuresof Animal,Plantand Food,Guangzhou,Guangdong 510623,China)

5-hydroxymethylfurfural isa productderived from the thermaldegradation reaction during the production and the storage ofw ine.It is an indicator to judgewhether thew ine is overheated/the storage time is too long.In this study,themethod of detecting 5-HMF content in w ine by HPLC had been developed.Such method had the advantages including high accuracy,good sensitivity andgood reproducibility.5-HMF content in 41 domestic and imported w ine samples(from Changli,Shandong,Tianjing andgansu/from French,Australia,Portugal,etc.) was detected in the experimentsand the contentof 5-HMF of all detected sampleswas in the range of 1.25～85.5mg/L.The experimental results provided useful references formonitoringgrapew ine quality.

grapew ine;5-hydroxymethylfurfural;HPLC

TS262.6；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286(2016)11-0107-05

10.13746/j.njkj.2016220

廣東省科技廳國際合作項(xiàng)目（2013B051000068）；廣東省科技廳公益項(xiàng)目（2014A04041065）；廣東檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目（2015GDK36）。

2016-07-06

劉青（1971-），碩士，主要研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量安全檢測，色譜、色譜質(zhì)譜等檢測技術(shù)應(yīng)用等，E-mail：gdciqlq@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-10-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161012.0937.004.htm l。