侯建光，郭富祥，樊建輝，韓素娜，張俊峰，陳蒙恩

（河南仰韶酒業(yè)有限公司博士后研發(fā)基地，河南澠池472400）

陶香型窖池中1株高產(chǎn)乙酸乙酯酵母的篩選與鑒定

侯建光，郭富祥，樊建輝，韓素娜，張俊峰，陳蒙恩

（河南仰韶酒業(yè)有限公司博士后研發(fā)基地，河南澠池472400）

從仰韶陶香型窖池糟醅中篩選產(chǎn)香功能微生物，研究其與大曲酒香味物質(zhì)之間的聯(lián)系，并對產(chǎn)香功能菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用傳統(tǒng)微生物分離方法，從不同發(fā)酵階段的陶香型窖池糟醅中分離獲得25株酵母菌。以豆芽汁培養(yǎng)基為底物，對各酵母菌株進(jìn)行單菌產(chǎn)香實(shí)驗(yàn)，經(jīng)聞香評定，菌株YS/Y/22能夠產(chǎn)生濃郁的酒香味和水果香味。采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行揮發(fā)性成分檢測分析，發(fā)現(xiàn)菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)物的主要香味成分為乙酸乙酯，是大曲酒的重要香味成分之一，因此可確定菌種YS/Y/22為陶香型窖池糟醅中的1株產(chǎn)香功能菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確定菌株YS/Y/22為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）。

陶香型窖池； 產(chǎn)香微生物； 揮發(fā)性成分； 篩選； 鑒定

陶香型是豫酒的獨(dú)有香型，屬于今年來中國白酒行業(yè)的創(chuàng)新性香型，目前不少專家、學(xué)者對濃香、清香、醬香、芝麻香等香型的成因及發(fā)酵過程中產(chǎn)香微生物等進(jìn)行了廣泛深入的研究，但對陶香型白酒產(chǎn)香功能微生物的研究卻未見報(bào)道。仰韶陶香型白酒是指在仰韶地域自然環(huán)境、生產(chǎn)原料、釀造工藝等因素的前提下，生產(chǎn)的兼有濃香型、清香型、醬香型、芝麻香型4種香型的白酒，其以幽雅的醬香和濃香的窖香為主體香韻，細(xì)膩的芝麻香和凈柔的清香為載體，滿足了廣大消費(fèi)者全方位飲酒舒適度的需求[1-3]。

本研究以仰韶地區(qū)不同發(fā)酵階段的陶香型工藝窖池為研究對象，對其發(fā)酵各階段糟醅中的產(chǎn)香微生物進(jìn)行篩選，分析鑒定其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，探尋與陶香型白酒香味成分之間的關(guān)系，以期找到產(chǎn)香性能突出的菌株，改良窖池發(fā)酵功能菌群，為提高陶香型白酒的產(chǎn)質(zhì)量和改善原酒風(fēng)味奠定基礎(chǔ)，為推動中國白酒地域資源的有效利用和地域資源型白酒企業(yè)健康發(fā)展提供支撐。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1酒糟樣品

選取河南仰韶酒業(yè)有限公司陶香型窖池10口，從其酒糟入池后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、15 d、20 d、30 d的酒糟，采取五點(diǎn)取樣法，將窖池酒糟分上、中、下3層進(jìn)行取樣，混勻，并分別用無菌袋保存至4℃冰箱備用。

1.1.2培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：WL培養(yǎng)基；種子液培養(yǎng)基：葡萄糖20g，胰蛋白胨20g，酵母浸出膏10g，蒸餾水1000 m L，pH5.0～5.5；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖含量50g，豆芽汁200g，酵母粉5g，蒸餾水800m L。

1.1.3試劑

TaqDNA polymerase，dNTPs，DL2000TMDNAMarker，均購自西安熱默爾生物科技；溶菌酶，蛋白酶K，酵母基因組DNA快速抽提試劑盒，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.4儀器與設(shè)備

SF-CT-1A型超凈工作臺：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；B203LED型生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；KF960型PCR儀，杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；50μm/30μm DVAB/CAR/PDMS固相微萃取頭，美國Supelco公司；DYY-6C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；WD-9403C型紫外儀，北京六一生物科技有限公司；HYG-B型搖床，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；20m L帶硅橡膠墊的樣品瓶，美國Supelco公司；D-37520型離心機(jī)，德國SIGMA公司；Thermo Scientific Trace1310-ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾而科技公司；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HH-型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1酵母菌的分離與純化

采用稀釋平板涂布法對微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)。準(zhǔn)確稱取1g酒糟樣品，置于裝有99m L無菌水的三角瓶中，振蕩30min。然后用移液槍吸取100μL振蕩均勻的菌懸液，置于裝有900μL無菌水的1.5m L離心管中，振蕩均勻，以此10倍逐級稀釋至10-7。取10-5、10-6、10-73個(gè)稀釋度的菌懸液100μL于WL培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布，之后于28℃倒置培養(yǎng)48 h。待長出適宜大小菌落后，選取具有典型酵母菌特征的菌落進(jìn)行分離純化、鏡檢編號，接種于斜面試管中保藏。

1.2.2產(chǎn)香實(shí)驗(yàn)

分離的各酵母菌株分別接入對應(yīng)編號的種子培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)48 h后，調(diào)節(jié)種子液濃度至107個(gè)/m L。之后按10%接種量接種于滅菌處理后的豆芽汁液體培養(yǎng)基中，以2℃培養(yǎng)7 d，然后對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行聞香評定、揮發(fā)性成分鑒定。

1.2.3揮發(fā)性成分檢測[4-5]

頂空固相微萃取條件：取8m L（10%）發(fā)酵液倒入20m L頂空瓶（專用）中，5μL內(nèi)標(biāo)（乙酸正戊酯和2-乙基丁酸），旋緊瓶蓋，60℃孵化萃取45m in后取出萃取頭，插入GC進(jìn)樣口熱解吸5m in，熱解吸溫度250℃。

氣相色譜條件：毛細(xì)管色譜柱為DB-FFAP（60m× 0.25μm，0.25μm），進(jìn)樣口和檢測口溫度均為250℃，載氣為He，流速為2m L/m in。程序升溫：初始溫度為50℃，穩(wěn)定2m in后，以4℃/m in升至230℃，保持15m in。

質(zhì)譜條件：EI電離源，掃描范圍20～550 u，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，接口溫度230℃。

1.2.4產(chǎn)香功能菌株鑒定[6-7]

對篩選出的產(chǎn)香性能突出的菌株采用顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察，并進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。采用18S rDNA分子生物學(xué)對產(chǎn)香性能突出的酵母菌株進(jìn)行鑒定，引物設(shè)計(jì)為NL-1：GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG和NL-4：GGTCCGTGTTTCAAGACGG。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)對18S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增后送樣測序，將測序結(jié)果在國際GeneBank中進(jìn)行BLAST比對，利用MEGA5.05軟件進(jìn)行多重序列同源性比對分析，并采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與分析

2.1微生物篩選、純化結(jié)果

采用稀釋平板涂布法對不同發(fā)酵階段陶香型酒糟樣品中的酵母進(jìn)行分離，選取具有典型酵母菌特征的菌落進(jìn)行純化，結(jié)合顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)，得到酵母25株，分別編號為YS/Y/1—YS/Y/25。

2.2液體發(fā)酵產(chǎn)香結(jié)果

2.2.1液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物感官評價(jià)結(jié)果

將分離獲得25株酵母的種子液接種至豆芽汁液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后對各菌株發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行外觀、氣味評價(jià)，其中6株酵母發(fā)酵后香氣較好，其發(fā)酵7 d后的液態(tài)產(chǎn)物感官評價(jià)結(jié)果見表1。

表1　各菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物感官評價(jià)

由表1可知，各菌株發(fā)酵豆芽汁液體培養(yǎng)基后所產(chǎn)生的感官特征各異。酵母菌株YS/Y/7、YS/Y/8、YS/Y/ 11、YS/Y/20、YS/Y/22、YS/Y/25發(fā)酵后產(chǎn)物有令人愉悅的香味，可初步確定為具有產(chǎn)香性能的菌株。其中菌株YS/Y/22經(jīng)過28℃發(fā)酵7 d后，發(fā)酵基質(zhì)呈深黃色，菌體生長旺盛，發(fā)酵液內(nèi)有白色呈現(xiàn)，且?guī)в袧庥舻木葡阄逗退阄?。其他菌株發(fā)酵后均未產(chǎn)生令人愉悅的香味，或保持豆芽汁培養(yǎng)基原味，或無味或產(chǎn)生怪味。綜合來看，菌株YS/Y/22的產(chǎn)香性能較為突出，可作為下一步揮發(fā)性發(fā)酵產(chǎn)物研究的菌株。

圖1　菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS總離子流色譜圖

2.2.2液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性成分測定結(jié)果

對菌株YS/Y/22發(fā)酵7 d后的液態(tài)產(chǎn)物采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定其中的揮發(fā)性物質(zhì)，其萃取的揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流色譜圖見圖1，分析鑒定出的揮發(fā)性物質(zhì)見表2。

表2　菌株YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性物質(zhì)測定

對菌株YS/Y/22的發(fā)酵產(chǎn)物跟蹤進(jìn)行感官和揮發(fā)性成分分析，結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵基質(zhì)由原來的豆芽汁原味、無香味，演變?yōu)闈庥舻木葡阄逗退阄?。剛開始發(fā)酵原料中并無乙酸乙酯的存在，到發(fā)酵7 d時(shí)色譜峰達(dá)到峰值。其他物質(zhì)在發(fā)酵過程中含量波動變化、不穩(wěn)定，發(fā)酵過程中這些物質(zhì)有可能存在生成及轉(zhuǎn)化兩方面的作用，還有待進(jìn)一步研究。酵母YS/Y/22發(fā)酵產(chǎn)生乙酸乙酯的能力較強(qiáng)，而乙酸乙酯屬于大曲酒的主要酯類香味成分，因此，可確定酵母菌株YS/Y/22為陶香型白酒的產(chǎn)香功能菌。

2.3產(chǎn)香菌株鑒定結(jié)果（圖2、圖3、圖4）

經(jīng)對YS/Y/22菌體進(jìn)行DNA提取、目的片段PCR擴(kuò)增后[8]，將PCR產(chǎn)物送往上海杰里公司測序，測序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，結(jié)果表明，菌株YS/Y/22與 Wickerhamomyces anomalus FJ972217.1相似性為99%。利用Mega5.05軟件通過N-J法對菌株YS/Y/22構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。菌株YS/Y/22的菌落及菌體形態(tài)見圖3、圖4。根據(jù)菌株rDNA的相似性、系統(tǒng)發(fā)育樹和菌體形態(tài)，初步鑒定菌株YS/Y/22為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomycesanomalus）。

圖2　基于18S rDNA序列同源性構(gòu)建的菌株YS/Y/22系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3　酵母YS/Y/22菌落形態(tài)圖

圖4　酵母YS/Y/22菌體形態(tài)圖

3　結(jié)論

本研究采用了單菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)研究從陶香型窖池糟醅中篩選出的酵母微生物，共篩選出6株產(chǎn)香酵母，其中菌株YS/Y/22產(chǎn)香能力最強(qiáng)，其揮發(fā)性香味成分主要是具有酒香味和水果香味的乙酸乙酯，屬于陶香型白酒的香味成分之一。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，菌株YS/Y/22為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。對于酵母YS/Y/22的產(chǎn)香機(jī)理和影響因素以及多菌共同發(fā)酵的效果、相互作用等將在后續(xù)研究中陸續(xù)進(jìn)行，以期早日運(yùn)用于生產(chǎn)實(shí)踐，改善原酒口感提高技術(shù)參考。

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Screening and Identification of a Strain w ith High Yield of Ethyl Acetate from Taoxiang Pits

HOU Jianguang,GUO Fuxiang,FAN Jianhui,HAN Su'na,ZHANG Junfeng and CHENMengen
(Yangshao Distillery Co.Ltd.,M ianchi,He'nan 472400,China)

In the experiments,25 yeaststrainswere isolated from fermentedgrains in Taoxiang pits in different fermenting stagesby traditional m icrobe isolationmethods.Then bean sproutsmedium was used as the substrate for aroma-producing experiment of each single yeast strain. Aroma assessment suggested that yeast strain YS/Y/22 could produce strong fruit aroma and w ine aroma.The volatile compounds of such strainwere analyzed by HPLC-GC-MSand itwas found that itsmain flavoring compound wasethylacetate,whichwasoneof themost important flavoring compounds in Daqu.Accrodingly,strain YS/Y/22 was an aroma-producing functionalm icrobial strain.Itwas identified as Wickerhamomycesanomalus throughmorphologicalobservation andmolecularbio-assay.(Trans.by YUEYang)

Taoxiang pits;aroma-producingm icrobes;volatile compounds;screening;identification

TS262.1；TS261.4；TS261.3；Q93-3

A

1001-9286（2016）11-0056-04

10.13746/j.njkj.2016227

2016-07-15

侯建光(1968-)，男，在職研究生，高級工程師，E-mail：610365356@qq.com。

樊建輝(1976-)男，大專，工程師，E-mail：fanjianhui2006@163.com。