董孝元，喻　斌，吳　昊，奚邦敏，李　良

(武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430050)

苦蕎酒中甜菜堿檢測方法及抗氧化性研究

董孝元，喻斌，吳昊，奚邦敏，李良

(武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430050)

利用HPLC檢測苦蕎酒中甜菜堿的含量，并對苦蕎酒體外抗氧化活性進(jìn)行研究。利用HPLC檢測甜菜堿的最佳條件為NH2柱，乙腈∶水=90∶10為流動相，流速為0.7m L/m in，檢測波長為195 nm，柱溫為30℃，運行時間為40min，進(jìn)樣量為20μL，在5.0～200.0mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，加標(biāo)回收率在98.23%～102.56%之間，該方法適用于苦蕎酒中的甜菜堿含量檢測，方法簡單、重復(fù)性好?？嗍w酒體外抗氧化實驗以Vc和BHT為對照，結(jié)果表明，苦蕎酒清除DPPH、·OH和·O2-的EC50分別為37.29mg/L、66.49mg/L、107.00mg/L，對照品Vc和BHT清除DPPH、·OH和·O2-的EC50是苦蕎酒的76%、75%和91%；132%、102%和115%?？嗍w酒的清除能力強于BHT，低于Vc，表明苦蕎酒有很好的抗氧化能力。

苦蕎酒； 甜菜堿； 苦蕎黃酮； 抗氧化能力

枸杞屬于茄科枸杞屬多年生灌木，主要分布在陜西北部黃土高原、寧夏、青海、甘肅、內(nèi)蒙古、新疆和西藏等地區(qū)。藏醫(yī)以其成熟果實入藥，治療心熱病、心臟病，并且藥效明顯，民間常將枸杞用作滋補強壯、明目及降壓藥，故常將枸杞與瓊珍靈芝、長白山人參、東阿阿膠并稱為中藥四寶。枸杞富含甜菜堿[1-2]，甜菜堿是枸杞中重要的生物活性物質(zhì)之一，在體內(nèi)起甲基供體的作用，具有抗脂肪肝[3]、降壓和抗腫瘤的作用[4]。

苦蕎（Fagopyrum tataricum）屬于蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum Mill)，苦蕎麥主要分布于我國云貴高原、西南地區(qū)及甘肅、陜西等地[5]。研究表明，苦蕎提取物中富含黃酮類物質(zhì)，黃酮類物質(zhì)主要是蘆丁、槲皮素及其糖苷、山奈酚及其糖苷[6-11]，這些物質(zhì)具有很強的生物活性，能降低血糖[12]、血脂[13]、尿糖，具有抗疲勞、抗衰老、抗炎鎮(zhèn)痛[14]、抑制腫瘤細(xì)胞的作用[15-16]。目前檢測甜菜堿的方法包括酸堿滴定法、凱氏定氮法、紫外分光光度法、高氯酸非水滴定法、HPLC法、離子色譜法。其中HPLC是比較通用的檢測方法，在檢測的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和操作方便上有滿意的結(jié)果。但是，由于苦蕎酒中具有諸多功效成分，對檢測具有極大的干擾，同時目前，采用HPLC檢測苦蕎酒中甜菜堿的含量未見報道。

本研究以“黃鶴小喬”苦蕎酒為供試樣品，利用HPLC優(yōu)化甜菜堿的檢測方法，再通過測定1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)、羥基自由基(·OH)和超氧陰離子(·O2-)的清除率，評價“黃鶴小喬”苦蕎酒的體外抗氧化活性，旨在為“黃鶴小喬”苦蕎酒的研究開發(fā)利用提供實驗數(shù)據(jù)及理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

“黃鶴小喬”苦蕎酒（苦蕎酒）：武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司提供；乙腈(色譜級)j.t.baker；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)，sigma；Vc，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；無水乙醇，F(xiàn)eSO4，H2O2，水楊酸，Tris-HCl緩沖液(pH8.2)，鄰苯三酚，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

Agilent1260液相色譜儀，安捷倫科技(中國)有限公司；ME204型電子分析天平，梅特勒-托利多(中國)有限公司；UV-2700分光光度計，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；HH-S型電熱恒溫水浴鍋，上海索普儀器有限公司；DHG-9070A型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海索普儀器有限公司；KQ-250E型超聲波儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1甜菜堿含量的檢測與優(yōu)化

1.3.1.1色譜條件

NH2柱(250mm×4.6mm，5μm)；乙腈∶水(90∶10)為流動相，流速為0.7m L/m in,檢測波長為195 nm，柱溫為30℃，運行時間為40m in，進(jìn)樣量為20μL，理論塔板數(shù)不低于5000。

1.3.1.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取甜菜堿對照品27.0 mg，用90%乙腈水溶液溶解定容至25.00 m L，精密吸取0.5m L、1.0m L、2.0 m L、3.0 m L、4.0m L、5.0m L于10 m L容量瓶中，用90%乙腈水溶液定容至刻度，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾后作為對照品溶液備用。

1.3.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確吸取對照品溶液各20μL，HPLC色譜分析，得到各濃度下對照品溶液的色譜峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，相對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照信噪比3∶1確定檢測限。

標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=6.965X-40.415，R2=0.9999，檢出限為5 ppm。

1.3.2苦蕎酒的抗氧化研究

1.3.2.1苦蕎黃酮含量的測定

參照Hossain[17]的方法，準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品50.0mg，以60%vol乙醇溶解，置于100m L容量瓶中，配成500mg/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0m L、2.0m L、3.0m L、4.0m L、5.0m L，分別置于25m L容量瓶中，分別加入1m L的5%NaNO2溶液，混勻，放置6m in，加入1m L的10%A l(NO3)3溶液，混勻，放置6min，加4m L 20%NaOH溶液，定容至25m L，放置15m in，在510 nm處測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=0.01057X-0.00577，R2=0.9999，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，測定苦蕎酒中總黃酮的含量。

1.3.2.2清除DPPH自由基活性的測定

參考參考文獻(xiàn)[18-19]準(zhǔn)確稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品12.7mg，用無水乙醇溶解并定容至100m L，配成0.32mmol/L的DPPH儲備液，置于冰箱中備用。將4.0m L無水乙醇與4m L各濃度樣品加入同一試管中，搖勻，在黑暗中放置30m in，以無水乙醇為空白在517 nm處測定其吸光度A空白；用4m L的無水乙醇與4m L 0.32mmol/L的DPPH溶液加入同一試管中，搖勻，在黑暗中放置30m in，以無水乙醇為空白在517 nm測定其吸光度A對照；另取4m L不同濃度的樣品溶液與4m L 0.32mmol/L的DPPH溶液于同一試管中，搖勻，在黑暗中放置30min，以無水乙醇作為空白，在517 nm處測定其吸光度A樣品。按下式計算DPPH自由基清除率。

1.3.2.3清除羥基自由基的測定

參考參考文獻(xiàn)[20-21]在試管中依次加入2m L 6mmol/L FeSO4溶液，2m L不同濃度的樣品溶液，2m L 6mmol/L H2O2溶液，搖勻，靜置10m in，再加入2m L 6mmol/L水楊酸溶液，搖勻，靜置30m in后于530 nm處測定其吸光度A樣品，用蒸餾水代替水楊酸按上述方法測定吸光值為A對照，用蒸餾水代替樣品溶液按上述方法測定吸光值為A空白。以下式計算羥基自由基的清除率。

1.3.2.4清除超氧陰離子自由基實驗

參考參考文獻(xiàn)[22-23]在25℃的恒溫水浴鍋中，將0.1mol/L pH8.2 Tris-HCl緩沖液和5mmol/L鄰苯三酚水浴保溫10m in后，取5.9m L pH8.2的Tris-HCl緩沖液，加0.1m L 5mmol/L鄰苯三酚，搖勻，在325 nm下立即測定，每隔0.5m in測定依次吸光值(以pH8.2的Tris-HCl緩沖溶液為空白)，計算出鄰苯三酚的自氧化率，自氧化率控制在0.060～0.065A/m in，至5m in止，將所得吸光值與時間t(m in)進(jìn)行回歸分析，其斜率為V0；加入樣品后氧化率測定：取5.7m L pH8.2的Tris-HCl緩沖液，加待測樣品0.2m L，0.1m L 5mmol/L鄰苯三酚，搖勻，立即按同上步驟測定(以pH8.2的Tris-HCl緩沖液為空白對照)Vs。以下式計算清除超氧陰離子的清除率。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

本實驗采用90%乙腈水溶液作為流動相，在對色譜條件的篩選過程中，隨著乙腈濃度的降低，基線信號噪聲變強，流速變大時，對氨基柱的損傷程度會增大，最終選擇90%乙腈水溶液作為流動相，流速為0.7m L/m in。

2.1.1精密度實驗

按照1.3.1.2方法配制的甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同條件下，連續(xù)進(jìn)行6次平行實驗，考察方法的精密度，根據(jù)其峰面積計算精密度，利用spss19.0計算其RSD為2.33%，表明該方法的精密度良好。

2.1.2穩(wěn)定性實驗

按照1.3.1.2方法配制的甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液在相同條件下，室溫放置，分別在0、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h進(jìn)樣，考察方法的穩(wěn)定性，根據(jù)其峰面積計算穩(wěn)定性，利用spss19.0計算其RSD為1.23%，表明該方法的穩(wěn)定性良好。

2.1.3重復(fù)性實驗

按照1.3.1.2方法配制的同一甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)其峰面積計算重復(fù)性，其利用spss19.0其RSD為0.98%，表明該方法的重復(fù)性達(dá)到分析的要求。

2.1.4加樣回收實驗

本實驗采用加樣回收法，按照1.3.1.2方法配制已知濃度甜菜堿樣品6份，分別精密加入不同量的甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品含量，按照樣品溶液的制備方法處理，在同樣色譜條件下測定甜菜堿的含量，其樣品的回收率為98.23%～102.56%，表明該方法的準(zhǔn)確率較高。

2.2抗氧化實驗結(jié)果

2.2.1清除DPPH能力的測定結(jié)果

苦蕎酒、Vc和BHT對DPPH自由基清除效果見圖1，利用spss19.0計算苦蕎酒的EC50為37.29mg/L，而Vc和BHT的EC50分別為28.34mg/L、49.29mg/L?？嗍w酒中抗氧化物質(zhì)的EC50約是Vc和BHT的0.76倍和1.32倍，表明苦蕎酒中抗氧化物質(zhì)有較大的抗氧化活性。

2.2.2清除羥基自由基能力的測定結(jié)果

圖1　不同濃度的Vc、BHT和苦蕎黃酮對DPPH自由基的清除作用

苦蕎酒、Vc和BHT對羥基自由基清除效果見圖2，利用spss19.0技術(shù)計算苦蕎酒的EC50為66.49mg/L，而Vc和BHT的EC50分別為49.67mg/L和67.75mg/L。苦蕎酒中抗氧化物質(zhì)的EC50分別是Vc和BHT的0.75倍和1.02倍，表明苦蕎酒有很強的清除羥基自由基的能力。

圖2　不同濃度的Vc、BHT和苦蕎黃酮對·OH的清除作用

2.2.3清除超氧陰離子能力的測定結(jié)果

苦蕎酒、Vc和BHT對·O2-清除結(jié)果見圖3，利用spss19.0計算苦蕎酒的EC50為107.00mg/L，而Vc和BHT的EC50分別為97.23mg/L和122.62mg/L。苦蕎酒中抗氧化物質(zhì)的EC50分別為Vc和BHT的0.91倍和1.15倍，表明苦蕎酒有很強的清除超氧陰離子的能力。

圖3　不同濃度的Vc、BHT和苦蕎黃酮對超氧陰離子的清除作用

3　結(jié)論

通過優(yōu)化甜菜堿的HPLC的檢測方法，得到HPLC液相條件為氨基柱，乙腈∶水(90∶10)為流動相，流速為0.7m L/min。檢測波長為195 nm，運行時間為40m in，進(jìn)樣量為20μL。

通過對苦蕎酒中抗氧化能力測定表明，苦蕎酒具有很強的清除DPPH、羥基自由基和超氧陰離子的能力。

苦蕎酒清除DPPH的EC50為37.29mg/L，而Vc和BHT的EC50分別為28.34mg/L、49.29mg/L，苦蕎酒中抗氧化物質(zhì)的EC50約是Vc和BHT的0.76倍和1.32倍。

苦蕎酒清除·OH的EC50為66.49mg/L，而Vc和BHT的EC50分別為49.67mg/L和67.75mg/L?？嗍w酒中抗氧化物質(zhì)的EC50分別是Vc和BHT的0.75倍和1.02倍。

苦蕎酒清除·O2-的EC50為107.00 mg/L，而Vc和BHT的EC50分別為97.23mg/L和122.62mg/L。苦蕎酒中抗氧化物質(zhì)的EC50分別為Vc和BHT的0.91倍和1.15倍。

苦蕎酒的抗氧化能力強于BHT，略低于Vc，表明苦蕎酒具有很強的抗氧化能力。

[1]耿丹丹,譚亮,肖遠(yuǎn)燦,等.離子色譜法測定黑果枸杞中的甜菜堿[J].食品科學(xué),2015,36：145-147.

[2]黨軍,王瑛,陶燕鐸,等.微波法提取枸杞葉甜菜堿工藝的研究[J].氨基酸和生物資源,2011(3)：27-29.

[3] 張林.甜菜堿對大鼠離體脂肪組織影響的實驗研究[D].蘭州：蘭州大學(xué),2009.

[4]劉燕燕,曾新安,朱思明,等.甜菜堿的生理功能與藥物活性[J].現(xiàn)代食品科技,2008,103(1)：96-100.

[5]徐笑宇.高黃酮苦蕎資源鑒選與評價利用研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué),2015.

[6]尤玲玲,劉幻幻,李曉雁,等.苦蕎黃酮的純化及抗氧化活性的研究[J].中國糧油學(xué)報,2014,29(8)：23-27.

[7]徐寶才,肖剛,丁霄霖,等.液質(zhì)聯(lián)用分析測定苦蕎黃酮[J].食品科學(xué),2003(6)：113-117.

[8]Jiang SJ,Liu Q,Xie Y X,etal.Separation of five flavonoids from tartary buckwheat(Fagopyrum tataricum(L.)Gaertn)grainsviaoff-line two dimensionalhigh-speed counter-current chromatography[J].Food Chem istry,2015,186(1)：153-159.

[9]LiFH,Zhang X L,Zheng SJ,etal.The composition, antioxidantand antiproliferative capacitiesof phenolic compoundsextracted from tartary buckwheatbran[Fagopyrum tartaricum(L.)Gaerth][J].Journalof Functional Foods,2016, 22：145-155.

[10]Ren Q,Wu CS,Ren Y,etal.Characterization and identification of the chem ical constituents from tartary buckwheat(Fagopyrum tataricumgaertn)by high performance liquid chromatography photodiodearray detector/linear ion trap FTICR hybridmass spectrometry[J]. Food Chem istry,2013,136(3-4)：1377-1389.

[11]朱琳,任清,徐笑穎.高速逆流色譜分離純化苦蕎中蘆丁、槲皮素[J].食品科學(xué),2014(2)：47-50.

[12]王斯慧,黃琬凌,陳慶松,等.蘆丁、槲皮素對α-葡萄糖苷酶活性抑制研究[J].中國釀造,2012(1)：133-135.

[13]王敏,魏益民,高錦明.苦蕎黃酮的抗脂質(zhì)過氧化和紅細(xì)胞保護(hù)作用研究[J].中國食品學(xué)報,2006(1)：278-283.

[14] 周小理,成少寧,周一鳴,等.苦蕎芽中黃酮類化合物的抑菌作用研究[J].食品工業(yè),2010(2)：12-14.

[15]趙強,索有瑞,李天才,等.響應(yīng)面法優(yōu)化苦蕎皮中總黃酮超聲波提取工藝[J].食品科學(xué),2014(16)：64-70.

[16]許效群,劉志芳,霍乃蕊,等.苦蕎糠皮總黃酮的抗氧化活性及免疫調(diào)節(jié)活性[J].中國食品學(xué)報,2012(6):42-47.

[17]Hossain M A,KalbaniM SA,FarsiSA JA,etal. Comparative study of totalphenolics,flavonoids contentsand evaluation of antioxidantand antimicrobialactivitiesof differentpolarities fruits crudeextractsof Daturametal L[J]. Asian Pacific Journalof TropicalDisease,2014,4(5)：378-383.

[18]Grajeda-lglesiasC,Salas E,Barouh N,etal.Antioxidant activity of protocatechuatesevaluated by DPPH,ORAC,and CATmethods[J].Food Chem istry,2016,194(1)：749-757.

[19]JabbariM,JabbariA.Antioxidantpotentialand DPPH radical scavenging kineticsofwater-insoluble flavonoid naringenin in aqueous solution ofm icelles[J].Colloidsand SurfacesA: Physicochem icaland Engineering Aspects,2016,489(20)：392-399.

[20]Yang ZH,Luo S,WeiZS,etal.Rate constantsof hydroxyl radicaloxidation of polychlorinated biphenyls in thegas phase:A single-descriptorbased QSAR and DFT study[J]. Environmental Pollution,2016,211：157-164.

[21]Chen H S,Diao JJ,LiY Y,etal.The effectivenessof clove extracts in the inhibition of hydroxyl radicaloxidationinduced structuraland rheologicalchanges in porcine myofibrillarprotein[J].MeatScience,2016,11：60-65.

[22]Masuoka N,NiheiK,MaetaA,etal.Inhibitory effectsof cardolsand related compoundson superoxide aniongeneration by xanthine oxidase[J].Food Chem istry,2015, 166(1)：270-274.

[23]TsaiYR,Huang L J,Lin H Y,etal.Inhibition of formyl peptide-stimulated superoxide aniongeneration by Fal-002-2 occursmainly through theblockadeof the p21-activated kinaseand protein kinase C signaling pathways in ratneutrophils[J].European Journalof Pharmacology,2013, 701(1-3)：114-123.

Detection of Betaine in Tartary BuckwheatW ineand its Antioxidant Activity

DONG Xiaoyuan,YU Bin,WU Hao,XIBangm in and LILiang
(Wuhan Huanghelou Distillery Co.Ltd.,Wuhan,Hubei430050,China)

Betaine content in tartary buckwheatw ine was detected by HPLC.Meanwhile,in vitro antioxidant activity of tartary buckwheat w inewas studied.The optimum detection conditionsof betainewere summed up as follows:NH2column,acetonitrile∶water=90∶10 as themobile phase,flow ing rate was 0.7m L/m in,the detection wavelength was 195 nm,column temperature was at30℃,the operating timewas 40min,sample injection quantity was 20μL.Good linear relation presented between 5.0～200mg/L concentration range,and the adding standard recoverywasbetween 98.23%and 102.56%.Suchmethod was suitable for detecting betaine in tartary buckwheatw ine and ithad the advantages including simple operation andgood repeatability.In in vitro antioxidant experiment,Vc and BHT were used as the control.The results showed that,the EC50values of scavenging DPPH,·OH and·O2-were 37.29mg/L,66.49mg/L,107.00mg/L respectively;in the controlgroupsof Vc/BHT,the EC50valuesof scavenging DPPH,·OH and·O2-were 76%,75%and 91%/132%,102%and 115%of thatof tartary buckwheatw ine.This study proved that,the scavenging capacity of tartary buckwheatw ine is superior to BHT but inferior to Vc,and tartary buckwheatw inehasgood antioxidantactivities.

tartary buckwheatw ine;betaine;buckwheat flavonoid;antioxidantactivity

TS262.3；TS261.7；TS261.4

A

1001-9286（2016）11-0037-04

10.13746/j.njkj.2016251

湖北省武漢市漢陽英才計劃。

2016-08-10

董孝元（1988-），男，碩士研究生，研究方向：配制酒研究與開發(fā)，Email：h-dongxiaoyuan@gujing.com.cn。

李良（1982-），男，工程師，碩士研究生，研究方向：白酒研究與開發(fā)，Email：h-liliang@gujing.com.cn。

優(yōu)先數(shù)字出版時間：2016-10-12；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20161012.1511.017.htm l。