胡敏娜，羅萍，顏家朝，李傳課，李波，龍達(dá)

·論著：實(shí)驗(yàn)研究·

滋陰明目丸對(duì)大鼠視網(wǎng)膜光損傷后細(xì)胞凋亡的影響

胡敏娜1，羅萍2，顏家朝2，李傳課2，李波2，龍達(dá)2

目的觀察滋陰明目丸對(duì)Sprague-Dawley（SD）大鼠視網(wǎng)膜光損傷后視細(xì)胞凋亡的影響。方法SD大鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、滋陰明目丸低劑量組、滋陰明目丸中劑量組、滋陰明目丸高劑量組，每組10只。除空白對(duì)照組外，其余5組大鼠均建立視網(wǎng)膜光損傷模型，光損傷處理后3 d開始灌胃給藥。滋陰明目丸低、中、高劑量組予滋陰明目丸，劑量分別相當(dāng)于成人1/3倍（2.6 g/kg，0.052g/ml）、成人等效劑量（7.8 g/kg，0.156 g/ml）、成人3倍劑量（23.4 g/kg，0.46 g/ml），陽性對(duì)照組予杞菊地黃丸成人等效劑量（1.62 g/kg，0.081 g/ml），空白對(duì)照組及模型對(duì)照組予生理鹽水。各組給藥15 d后處死，制作視網(wǎng)膜石蠟切片，TUNEL染色，光學(xué)顯微鏡觀察計(jì)算視細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果空白對(duì)照組的AI值為1.5439%±1.5154%，模型對(duì)照組AI值遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組（P＜0.01），為63.3077%±4.7531%。低劑量組AI值60.8298±5.9315%，與模型對(duì)照組數(shù)值接近（P=0.095）；中、高劑量組及陽性對(duì)照組AI值明顯低于模型對(duì)照組（P值均＜0.01），數(shù)值分別23.2864%±7.0224%，22.5674%±5.8763%，23.0666%±5.5213%，該三組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（中劑量組與高劑量組比較，P=0.639；中劑量組與陽性對(duì)照組比較，P=0.886；高劑量組與陽性對(duì)照組比較，P=0.733）。結(jié)論一定劑量的滋陰明目丸可以抑制光損傷模型大鼠的視細(xì)胞凋亡，對(duì)光損傷后大鼠的視細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡；視網(wǎng)膜光損傷；滋陰明目丸

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們?cè)谏畹姆椒矫婷媾c光源密不可分，與損傷性光源的接觸也越來越頻繁，環(huán)境和人造光源都可能是潛在危險(xiǎn)因素〔1〕。近年來，對(duì)視網(wǎng)膜光損傷的損傷防御機(jī)制及防治的研究成為普遍關(guān)注的問題，流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜光損傷與視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性等疾病有關(guān)〔2〕。國內(nèi)外大量臨床基礎(chǔ)研究表明，細(xì)胞凋亡是視網(wǎng)膜細(xì)胞光損傷的主要表現(xiàn)形式之一〔3〕。本實(shí)驗(yàn)擬通過建立大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型，觀察滋陰明目丸對(duì)視網(wǎng)膜光損傷后凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取6～8周齡健康Sprague-Dawley（SD）大鼠（雌雄不論，湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，SPF級(jí)）60只，每只體質(zhì)量150～180 g左右。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組、滋陰明目丸低劑量組（低劑量組）、滋陰明目丸中劑量組（中劑量組）、滋陰明目丸高劑量組（高劑量組）。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均在12 h明（20～50 lx）以及12 h暗（0～12 lx）的循環(huán)光環(huán)境下適應(yīng)10 d。

1.1.2實(shí)驗(yàn)用藥滋陰明目丸（湘藥制字Z20080745，規(guī)格120 g/瓶），湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。主要藥物組成：熟地黃、黃精、枸杞子、菟絲子、山茱萸、山藥、茯苓、楮實(shí)子、牡丹皮、三七、丹參、牛膝、當(dāng)歸、石決明、川芎、羌活、石菖蒲等。杞菊地黃丸（批號(hào)201310038，長沙九芝堂集團(tuán)有限公司），湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供，主要藥物組成：枸杞子、菊花、熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉等。復(fù)方托吡卡胺滴眼液（美多麗，規(guī)格10 ml，批號(hào)M484351，日本參天制藥），湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。滋陰明目丸和杞菊地黃丸均按比例制備成混懸液。

1.1.3主要儀器及試劑TSAI-8720型數(shù)字照度計(jì)（蘇州特安斯電子有限公司）；羅氏公司凋亡試劑盒（貨號(hào)：11684817910）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1視網(wǎng)膜光損傷模型制作自制光照箱作為光損傷裝置，箱體規(guī)格1 m×35 cm×35 cm，箱內(nèi)垂直4個(gè)面和箱底分別安裝4根15 W的白色熒光燈管，燈管內(nèi)側(cè)放置玻璃隔板，上方安裝多個(gè)排風(fēng)孔。光照箱中心向各方向的平均照度為（1 900±106.9）lx，相當(dāng)于大鼠眼球水平正?；顒?dòng)時(shí)各箱壁的照度為2000lx，光照箱內(nèi)的平均溫度維持在22～24℃。除空白對(duì)照組外，其余組SD大鼠造模前暗適應(yīng)24 h后均置于乙醚麻醉缸中吸入麻醉約5 min，縫線開瞼，并予復(fù)方托吡卡胺滴眼液行雙眼散瞳處理后，接受3 h持續(xù)光照射。光照后立即拆除開瞼縫線，送回暗環(huán)境中，之后均在12 h明及12 h暗的循環(huán)光環(huán)境下生活。

1.2.2分組給藥造模動(dòng)物在前述光損傷處理后3d開始給藥。根據(jù)體表面積計(jì)算法，計(jì)算出相當(dāng)于成人的等效治療量。低劑量組予以滋陰明目丸相當(dāng)于成人的1/3倍劑量2.6g/kg的混懸液（0.052 g/ml）、中劑量組予成人等效劑量7.8 g/kg的混懸液（0.156 g/ml）、高劑量組予以成人3倍劑量23.4g/kg的混懸液（0.46g/ml）灌胃，陽性對(duì)照組予杞菊地黃丸成人等效劑量1.62g/kg的混懸液（0.081 g/ml）灌胃，空白對(duì)照組及模型對(duì)照組同期予以生理鹽水（與成人劑量等容）灌胃。每天上下午分別灌胃1次，每次劑量是全日量的1/2。灌胃后15 d處死大鼠，取眼球送檢。

1.2.3制作石蠟切片（1）4%多聚甲醛固定24 h，去掉眼前節(jié)及玻璃體，固定大鼠視網(wǎng)膜。（2）組織按常規(guī)進(jìn)行固定、脫水、浸蠟、石蠟包埋。每只眼球經(jīng)視盤顳上方旁開1 mm縱向切片，切片厚度4 μm。

1.2.4TUNEL法染色（1）石蠟切片脫蠟至水。（2）加蛋白酶K工作液做酶修復(fù)，室溫孵育15 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH=7.4）洗3次，每次5 min。（3）加破膜工作液常溫下孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。按片子數(shù)量和組織大小取適量試劑1（TdT）：試劑2（dUTP）=1∶9混合，加到組織上，37℃水浴鍋孵育60 min，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。（4）PBS沖洗3次，每次5 min，組織上加入3%新鮮配制的甲醇雙氧水，常溫避光孵育15 min。（5）PBS沖洗3次，每次5 min。甩去PBS液，每張切片加適量試劑3（converter-POD），37℃水浴鍋孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min。（6）甩去PBS液，每張切片加50～100 μl新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡控制顯色。（7）顯色完全后，蒸餾水或自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化（1 s），自來水洗，氨水返藍(lán)，自來水洗，鏡下觀察。（8）切片經(jīng)過兩道100%乙醇，每道5～10 min，脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.5光學(xué)顯微鏡觀察視細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）光學(xué)顯微鏡下觀察經(jīng)TUNEL法標(biāo)記的凋亡視細(xì)胞的切片，切片上的組織為一細(xì)長條帶，選取這條帶的橫截中線，在高倍鏡（×400）下隨機(jī)觀察中線附近10個(gè)視野，計(jì)算出這10個(gè)視野的總面積和這10個(gè)視野內(nèi)凋亡視細(xì)胞的總數(shù)，將這一總數(shù)作為每張切片的視細(xì)胞凋亡數(shù)，取5張連續(xù)切片視細(xì)胞凋亡數(shù)的均數(shù)作為該眼的視細(xì)胞凋亡數(shù)，取每只大鼠兩眼球視細(xì)胞凋亡數(shù)的均數(shù)作為該大鼠的視細(xì)胞凋亡數(shù)，用該大鼠的視細(xì)胞凋亡數(shù)除以10個(gè)高倍鏡視野的總面積即為該大鼠的視細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料都采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1石蠟切片TUNEL法標(biāo)記光學(xué)顯微鏡觀察

空白對(duì)照組，外核層無細(xì)胞核被標(biāo)記（圖1A）。模型對(duì)照組，SD大鼠視網(wǎng)膜外核層中有陽性細(xì)胞核被標(biāo)記。被標(biāo)記的陽性細(xì)胞核呈棕黃色，核著色不均勻，細(xì)胞膜完整，染色質(zhì)邊聚成“新月形核”或“環(huán)形核”，核染色質(zhì)濃縮在中央形成“眼球形核”（圖1B）。低劑量組，SD大鼠視網(wǎng)膜外核層中被標(biāo)記的細(xì)胞核減少（圖1C）。中、高劑量組及陽性對(duì)照組，外核層中被標(biāo)記的細(xì)胞核明顯減少，但三組間并無明顯組織病理學(xué)差異（圖1D～圖1F）。

2.2視細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）

模型對(duì)照組的AI值遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組（63.3077%＞1.5439%，P＜0.01），低劑量組AI值略低于模型對(duì)照組，但二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.095）；中、高劑量組及陽性對(duì)照組AI值明顯低于模型對(duì)照組（P值均＜0.01），該三組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（中劑量組與高劑量組比較，P=0.639；中劑量組與陽性對(duì)照組比較，P=0.886；高劑量組與陽性對(duì)照組比較，P=0.733）（表1）。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜視細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（x±s）

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜石蠟切片光學(xué)顯微鏡像（TUNEL法標(biāo)記，×400）。1A.空白對(duì)照組，外核層未見細(xì)胞核標(biāo)記；1B.模型對(duì)照組，外核層可見陽性細(xì)胞核（棕黃色）；1C.滋陰明目丸低劑量組，外核層陽性細(xì)胞較模型對(duì)照組減少；1D.滋陰明目丸中劑量組，外核層陽性細(xì)胞較模型對(duì)照組明顯減少；1E.滋陰明目丸高劑量組，外核層陽性細(xì)胞較模型對(duì)照組明顯減少；1F.陽性對(duì)照組，外核層陽性細(xì)胞較模型對(duì)照組明顯減少

3 討論

視網(wǎng)膜是人體產(chǎn)生視覺的重要器官，也極易受到內(nèi)外致病因素的影響。過強(qiáng)的光照或長時(shí)間直視光源會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜造成損害。光化學(xué)損傷是導(dǎo)致視網(wǎng)膜光損傷最主要的損傷因素，光感受器細(xì)胞的死亡途徑有三種，分別是凋亡、壞死和自噬，其中，凋亡是主要途徑〔4〕。細(xì)胞凋亡，又被稱為程序性細(xì)胞死亡，是指在體內(nèi)外因素誘導(dǎo)下，由基因嚴(yán)格調(diào)控而發(fā)生的自主性細(xì)胞有序死亡，是生物體內(nèi)普遍存在的一種不同于壞死的生理調(diào)節(jié)性的細(xì)胞死亡，具有特殊的形態(tài)學(xué)改變。凋亡蛋白酶（Caspase）是白介素-1轉(zhuǎn)化酶樣蛋白酶，為線蟲死亡基因CED-3在哺乳動(dòng)物中的對(duì)應(yīng)產(chǎn)物。大量研究表明，Caspase可成為細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡的特異性標(biāo)志，凋亡的主要通路分別是Caspase依賴型細(xì)胞凋亡通路和Caspase非依賴型細(xì)胞凋亡通路。Caspase依據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，可分為三類：Caspase2，8，9，10為起始凋亡蛋白酶〔5〕；Caspase3，6，7為效應(yīng)凋亡蛋白酶〔6，7〕；Caspase1，4，5為與炎癥相關(guān)的凋亡蛋白酶〔8〕。Caspase依賴型凋亡通路主要是起始凋亡蛋白酶和效應(yīng)凋亡蛋白酶參與，Caspase非依賴型凋亡通路主要以鈣蛋白酶或組織蛋白酶介導(dǎo)為主。

中國古代對(duì)光損害性眼病即有描述，唐代孫思邈的《備急千金要方》云：“數(shù)看日月、夜視星火……并是喪明之本”；《外臺(tái)秘要》中也提到“數(shù)向日月輪看”“雪山巨晴視日”都是“喪明之由”。又根據(jù)其“目內(nèi)外無癥候，但自視昏渺矇眛不清”（《審視瑤函》）的臨床表現(xiàn)，將其歸于“視瞻昏渺”范疇。《證治準(zhǔn)繩·雜病·七竅門》指出此癥：“有勞神，有血少，有元?dú)馊?，有元精虧而昏渺者?！备伍_竅于目，肝受血而能視，腎精充足，上榮于目，則視物清晰。持續(xù)的光損害，易傷陰耗血，目竅失養(yǎng)，久之肝腎同虧，精血不足，血運(yùn)不暢，瘀血阻滯。因此我們認(rèn)為此類眼病的病機(jī)與肝腎陰虛，目絡(luò)瘀滯有關(guān)，中醫(yī)治法可予以滋陰活血之劑。

杞菊地黃丸出自《醫(yī)級(jí)·卷八》，由六味地黃丸加枸杞子、菊花而成，功效為補(bǔ)益肝腎，主治肝腎虧虛，常用于干眼、屈光不正及年齡相關(guān)性白內(nèi)障、年齡相關(guān)性黃斑變性等眼底疾病，是眼科的常用方。滋陰明目丸是李傳課教授根據(jù)數(shù)十年的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，臨床應(yīng)用多年。在提高視力、擴(kuò)大視野、消散瘀血、改善功能、減輕癥狀等方面獲得了較好療效。此方主要由熟地黃、黃精、枸杞子、菟絲子、山茱萸、山藥、茯苓、楮實(shí)子、牡丹皮、三七、丹參、牛膝、當(dāng)歸、石決明、川芎、羌活、石菖蒲等藥物組成，方中熟地黃滋補(bǔ)肝腎、填精益髓為君；枸杞子、菟絲子、山藥、茯苓、楮實(shí)子、黃精、山茱萸為臣，協(xié)助君藥補(bǔ)腎養(yǎng)陰、益肝明目；牡丹皮、三七、丹參、牛膝、當(dāng)歸止血養(yǎng)血、活血化瘀；石決明平肝除障為佐；羌活辛散防滯，引藥上行；石菖蒲開竅宣通為使。諸藥合用，共奏滋補(bǔ)肝腎，活血化瘀名目之功。本實(shí)驗(yàn)通過建立視網(wǎng)膜光損傷模型，使用光學(xué)顯微鏡觀察視細(xì)胞凋亡指數(shù)，研究顯示一定劑量的滋陰明目丸可以抑制光損傷模型大鼠的視細(xì)胞凋亡，對(duì)光損傷后大鼠的視細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。但由于視網(wǎng)膜光損傷機(jī)制較復(fù)雜，光感受器細(xì)胞凋亡不是單一因素或某一環(huán)節(jié)導(dǎo)致，仍需進(jìn)一步研究。此外，滋陰明目丸是中藥制劑，其成分的多樣性，作用的多向性導(dǎo)致藥理作用的研究欠完善，因此僅以此探討該藥的作用機(jī)制稍顯不足，有待在今后的研究中進(jìn)一步完善。

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Effect of Ziyin Mingmu pill on apoptosis of retinal damage in rats

HU Minna,LUO Ping,YAN Jiazhao,et al.Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha 410007,China

OBJECTIVETo observe effect of Ziyin Mingmu pill on optic cell apoptosis after retinal light injury in Sprague-Dawley(SD)rat.METHODSA total of 60 SD rats were randomly divided into control group, model control group,positive control group as well as low dose,medium dose and high dose of Ziyin Mingmu pill groups,which meant 10 rats in each group.Except control group,rats it the other 5 groups were made into model of retinal light injury,3 days after light injury medication began by gastric.Low,medium and high dose of Ziyin Mingmu pills were equivalent to 1/3 of adult dose(2.6 g/kg,0.052g/ml),the human equivalent dose(7.8 g/kg,0.156 g/ml),tripple adult dosage(23.4 g/kg,0.46g/ml)respectively,positive control group was treated with Qiju Dihuang pill with adult equivalent dose(1.62g/kg.0.081g/ml),blank control group and model control group were given saline. Fifteen days after medication,rats of each group were sacrificed,while the paraffin sections of the retina were made, and TUNEL staining was used to observe the apoptotic index(AI).RESULTSCompared with blank control group, AI of model control group was significant high(63.3077%±4.7531%VS 63.3077%±4.7531%,P<0.001);AI of low dose group was 60.8298±5.9315%which was similar to that of model control group;AI of middle,high dose group and positive control group were all obviously lower than model control group(P<0.001);among these groups, comparisons between each two groups showed no difference at all.Specifically,P value of comparison between medium dose group and high dose group,medium dose group and positive control group,high dose group and positive control group were 0.639,0.886 and 0.733 respectively.CONCLUSIONSA certain dose of Ziyin Mingmu pillcould inhibit cell apoptosis in rat model of light damage,and it had a protective effect on retinal cells after light damage in rats.

apoptosis;retinal light damage;Ziyin Mingmu pill

R285.5

：A

：1002-4379（2016）04-0211-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.04.001

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81303007/H2713）；全國名老中醫(yī)藥專家李傳課傳承工作室[國中醫(yī)藥人教發(fā)2013（47）號(hào)]

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙410208；

2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙410007

羅萍，E-mail：1216718845@qq.com