曾 玉，吳 畏，姚 輝，嚴(yán)忠亞，鐘天鷹

(江蘇省南京市婦幼保健院檢驗(yàn)科 210004)

?

·臨床研究·

羅氏公司Cobas E602電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)抗繆勒管激素的方法學(xué)評(píng)價(jià)

曾 玉，吳 畏，姚 輝，嚴(yán)忠亞，鐘天鷹

(江蘇省南京市婦幼保健院檢驗(yàn)科 210004)

目的 對(duì)羅氏公司Cobas E602電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)抗繆勒管激素(AMH)進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。方法 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)的EP文件要求，制訂定量檢測(cè)方法的方法學(xué)評(píng)價(jià)方案，即通過(guò)在羅氏公司Cobas E602電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)AMH的精密度、準(zhǔn)確度、分析測(cè)量范圍和攜帶污染率來(lái)評(píng)價(jià)其性能。結(jié)果 AMH低、中和高濃度時(shí)，批內(nèi)精密度CV分別是1.971%、1.540%和1.707%，批間精密度CV分別為3.508%、3.072%和3.199%，均符合要求；多個(gè)不同濃度定值校準(zhǔn)品的檢測(cè)結(jié)果與靶值的相對(duì)偏倚均在±5%之內(nèi)，且將已知濃度的AMH標(biāo)本加入到健康人血清中，測(cè)得的添加回收率為97.05%～102.52%，準(zhǔn)確度滿足判斷標(biāo)準(zhǔn)；分析測(cè)量線性范圍為0.083～22.398 ng/mL，相關(guān)方程Y=0.987 7X+0.100 6(a值在0.95～1.05，r2≥0.95)；攜帶污染率為0.769%(≤2.0%)。結(jié)論 羅氏公司Cobas E602電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)AMH的精密度高、準(zhǔn)確度好，具有良好的線性測(cè)量范圍及攜帶污染率低，驗(yàn)證和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)符合，可為臨床檢測(cè)工作提供準(zhǔn)確的參考依據(jù)。

Cobas E602； 電化學(xué)發(fā)光； 抗繆勒管激素； 方法學(xué)評(píng)價(jià)

抗繆勒管激素(AMH)是Jost于1947年首先在睪丸支持細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。AMH是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的生長(zhǎng)和分化的反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的一個(gè)成員，在卵巢功能方面發(fā)揮著極其重要的作用，如評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能，預(yù)測(cè)絕經(jīng)年齡等。此外，AMH可為輔助生殖技術(shù)的個(gè)性化治療提供可靠證據(jù)，可對(duì)卵泡池中的卵子數(shù)量與質(zhì)量及卵巢反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)估并預(yù)測(cè)卵巢過(guò)度刺激綜合征的發(fā)生，在生殖領(lǐng)域中也有著廣闊的應(yīng)用前景。AMH正作為臨床常用的生化指標(biāo)，受到極度關(guān)注與應(yīng)用[1-2]。德國(guó)羅氏公司研制的電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)AMH為新近批準(zhǔn)項(xiàng)目可進(jìn)入臨床應(yīng)用，本科室最近引進(jìn)該檢測(cè)項(xiàng)目，現(xiàn)就羅氏公司Cobas E602電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)血清AMH的方法學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2015年10～12月門、急診及住院患者的新鮮血清標(biāo)本，分別混合低、中、高3種濃度水平血清用于批內(nèi)和批間精密度、準(zhǔn)確度、添加回收率、分析測(cè)量范圍以及攜帶污染率評(píng)價(jià)。

1.2 儀器與試劑 儀器采用德國(guó)羅氏公司Cobas E602電化學(xué)發(fā)光分析儀，使用配套AMH試劑。

1.3 評(píng)價(jià)方案與實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 精密度評(píng)價(jià) 參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(NCCLS)的EP-5A評(píng)價(jià)方案[3]，使用Elecsys試劑、標(biāo)本和質(zhì)控品確定精密度。具體為常規(guī)IQC在控后按標(biāo)本檢測(cè)程序進(jìn)行測(cè)定，選擇收集的低、中和高3種濃度混合血清標(biāo)本，1 d內(nèi)連續(xù)重復(fù)測(cè)定20次，分別計(jì)算出批內(nèi)精密度的標(biāo)準(zhǔn)差(S批內(nèi)) 和變異系數(shù)(CV批內(nèi))；另將上述3種濃度的混合血清連續(xù)重復(fù)測(cè)定20 d，每天上下午各測(cè)定1次，分別計(jì)算出批間精密度的標(biāo)準(zhǔn)差(S批間)和變異系數(shù)(CV批間)。

1.3.2 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià) 參照NCCLS的EP15-A[4]評(píng)價(jià)方案，按照檢測(cè)定值的參考物質(zhì)計(jì)算偏差來(lái)驗(yàn)證：即將AMH校準(zhǔn)品稀釋至5個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度校準(zhǔn)品連續(xù)測(cè)定2次，計(jì)算結(jié)果均值，對(duì)檢測(cè)結(jié)果與已知的“靶值”進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算檢測(cè)值與靶值的相對(duì)偏倚(%)，計(jì)算公式：偏倚=(測(cè)定值-靶值)/靶值×100%，偏倚應(yīng)小于或等于5.0%。將一定濃度的AMH標(biāo)本加入到正常人血清中，計(jì)算添加回收率。

1.3.3 分析測(cè)量范圍(AMR)評(píng)價(jià) 按照NCCLS的EP6-A文件[5]，先確定實(shí)驗(yàn)室AMH測(cè)定的重復(fù)性和線性的允許誤差范圍分別為2%和5%；再選擇AMH濃度靠近廠家提供線性范圍上限的患者血清標(biāo)本作為高濃度血清(H)，AMH濃度低的患者血清標(biāo)本作為低濃度血清(L)，按5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L和5L的關(guān)系各自配制，形成系列濃度檢測(cè)標(biāo)本，用Cobas E602對(duì)系列濃度標(biāo)本進(jìn)行AMH檢測(cè)，每個(gè)濃度水平測(cè)定2次，記錄結(jié)果，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的均值和理論值進(jìn)行直線回歸統(tǒng)計(jì)。實(shí)測(cè)值與理論值作比較(偏離應(yīng)小于10%)，以稀釋后的理論值為橫坐標(biāo)X，實(shí)測(cè)值的平均濃度為縱坐標(biāo)Y，數(shù)據(jù)采用直線回歸統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)算回歸方程：Y=aX+b和相關(guān)系數(shù)r2，若a值在1±0.05范圍內(nèi)，且r2≥0.950，則可為真實(shí)的測(cè)量分析范圍，作臨床參考依據(jù)。

1.3.4 攜帶污染率的評(píng)價(jià) 取高濃度AMH血清標(biāo)本連續(xù)測(cè)定3次，測(cè)定值分別為H1、H2、H3；再取低濃度HE4血清標(biāo)本連續(xù)測(cè)定3次，測(cè)定值分別為L(zhǎng)1、L2、L3，按公式計(jì)算攜帶污染率。攜帶污染率=(L1-L3)/(H3-L3)×100%。攜帶污染率應(yīng)小于等于2.0%。

2 結(jié) 果

2.1 AMH精密度評(píng)價(jià)結(jié)果 參考NCCLS的EP-5A文件，用收集的低、中、高3種濃度混合血清做批內(nèi)精密度和批間精密度，見(jiàn)表1。

表1 Cobas E602測(cè)定AMH的精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2 AMH準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)結(jié)果 參考NCCLS EP15-A文件，與AMH校準(zhǔn)品的標(biāo)定值相比，驗(yàn)證值的相對(duì)偏倚在±5%之間，見(jiàn)表2。

表2 Cobas E602測(cè)定AMH的準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)結(jié)果

將已知濃度的AMH標(biāo)本加入到健康人血清中，測(cè)得的添加回收率為97.05%～102.52%。

2.3 AMH分析測(cè)量范圍評(píng)價(jià)結(jié)果 選取AMH高濃度(22.398 ng/mL)和低濃度(0.083 ng/mL)血清，根據(jù)配制關(guān)系稀釋并計(jì)算出6例標(biāo)本的AMH水平，作為這些標(biāo)本的理論預(yù)期值，以預(yù)期值為橫坐標(biāo)，實(shí)測(cè)均值為縱坐標(biāo)，將實(shí)測(cè)值與理論值作比較(偏離應(yīng)小于10%)，進(jìn)行直線回歸分析，觀察其線性范圍，計(jì)算Y=aX+b，結(jié)果顯示a=0.987 7，r2=0.999 6，滿足要求(a值在1±0.05范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r2≥0.95)，見(jiàn)表2，散點(diǎn)圖見(jiàn)圖1。因此，AMH濃度在0.083～22.398 ng/mL范圍內(nèi)線性良好。

表3 AMH分析測(cè)量范圍評(píng)價(jià)

圖1 AMH線性范圍驗(yàn)證

2.4 AMH攜帶污染率結(jié)果 AMH的H1、H2、H3測(cè)定值分別是22.429、22.391和22.763 ng/mL；L1、L2、L3測(cè)定值分別是0.409、0.285和0.237 ng/mL。攜帶污染率=(L1-L3)/(H3-L3)×100%，計(jì)算得0.769%，攜帶污染率滿足要求。

3 討 論

AMH檢測(cè)是在羅氏公司Cobas e602型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行檢測(cè)，該試劑盒為羅氏公司研發(fā)的采用電化學(xué)發(fā)光免疫法(ECLIA)測(cè)定。ECLIA是在電場(chǎng)作用下發(fā)生的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，是電化學(xué)和免疫測(cè)定技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是目前全球最先進(jìn)的免疫標(biāo)記分析技術(shù)之一。ECLIA基本原理為電化學(xué)發(fā)光過(guò)程產(chǎn)生的光信號(hào)強(qiáng)度與二價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕[Rubpy3]2+的濃度呈線性關(guān)系。將二價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕[Rubpy3]2+與免疫反應(yīng)體系中的一種物質(zhì)結(jié)合，經(jīng)免疫反應(yīng)、分離后，檢測(cè)免疫反應(yīng)體系中剩余二價(jià)的三氯聯(lián)吡啶釕[Rubpy3]2+經(jīng)上述過(guò)程后所發(fā)出的光，即可得知待檢物的濃度。ECLIA技術(shù)是目前最先進(jìn)的標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)之一，具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、穩(wěn)定性好、無(wú)放射性污染，而且操作簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化，檢測(cè)速度快等特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比具有無(wú)可比擬的優(yōu)越性[6]。

雖然Cobas E601檢測(cè)系統(tǒng)為封閉系統(tǒng)，采用配套的試劑、質(zhì)控品和標(biāo)準(zhǔn)品，但是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室在水質(zhì)、電壓穩(wěn)定性、實(shí)驗(yàn)室溫濕度和人員操作習(xí)慣等條件方面存在差異，實(shí)際分析性能與廠家提供的性能參數(shù)不一定一致。因此，根據(jù)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理方法》和《ISO15189:2008 醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則》對(duì)目前臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量要求[7]，臨床實(shí)驗(yàn)室在開(kāi)展新的檢測(cè)項(xiàng)目之前需對(duì)新檢測(cè)系統(tǒng)(儀器、試劑、校準(zhǔn)品等)進(jìn)行必要的性能驗(yàn)證，確保檢驗(yàn)系統(tǒng)可對(duì)臨床應(yīng)用滿意，確?？煽啃裕椒▽W(xué)評(píng)價(jià)內(nèi)容在操作過(guò)程中通常包括可報(bào)告的精密度、準(zhǔn)確度、攜帶污染率等，其中準(zhǔn)確度和精密度的測(cè)定為最主要的驗(yàn)證指標(biāo)[3-4]。本研究通過(guò)Cobas E602檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定AMH的相關(guān)性能指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證廠家給定的AMH性能參數(shù)并評(píng)估AMH作為新的檢測(cè)項(xiàng)目在臨床應(yīng)用的可行性。

根據(jù)NCCLS的EP-5A文件對(duì)批內(nèi)和批間精密度的評(píng)估，結(jié)果顯示AMH低、中和高濃度時(shí)，批內(nèi)精密度CV分別是1.971%、1.540%和1.707%，批間精密度CV分別為3.508%、3.072%和3.199%，與羅氏廠家說(shuō)明書(shū)提供的參數(shù)基本相同，且符合CLSI的EP-5A文件標(biāo)準(zhǔn)，表明該方法穩(wěn)定性和重復(fù)性均很好，精密度屬于可接受范圍。根據(jù)EP15-A文件，選擇AMH校準(zhǔn)品的不同稀釋濃度作為參考物質(zhì)，每個(gè)濃度校準(zhǔn)品連續(xù)測(cè)定2次，計(jì)算結(jié)果均值，對(duì)檢測(cè)結(jié)果與已知的“靶值”進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算檢測(cè)值與“理論靶值”的相對(duì)偏倚(%)，結(jié)果5個(gè)不同濃度的AMH樣品相對(duì)偏倚均在±5.0%之內(nèi)，滿足要求，表明準(zhǔn)確度可接受。

按照NCCLS EP6-A文件評(píng)價(jià)AMH的分析測(cè)量范圍，用以驗(yàn)證該方法的高、低檢測(cè)值之間是否呈線性關(guān)系，將高值和低值A(chǔ)MH標(biāo)本按不同關(guān)系各自配制并根據(jù)各稀釋點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行直線回歸統(tǒng)計(jì)方法處理，得方程Y=0.990 3X+0.018 9，r2=0.999 6，可見(jiàn)a值在規(guī)定的0.95～1.05范圍內(nèi)，且r2≥0.95，表明AMH在0.083～22.398 ng/mL范圍呈較好的線性相關(guān)，此可為真實(shí)實(shí)施的測(cè)量分析范圍，為臨床提供參考依據(jù)。但此線性范圍的低值為0.083 ng/mL，略高于羅氏公司給予的AMH低值0.01 ng/mL，亦表明不同實(shí)驗(yàn)室之間存在差異。本研究將已知濃度的AMH標(biāo)本加入到正常人血清中，測(cè)得的添加回收率為97.05%～102.52%，符合要求。另外，由于羅氏公司Cobas E602采用一次性加樣系統(tǒng)，大大減少了攜帶污染，檢測(cè)結(jié)果顯示該系統(tǒng)攜帶污染率僅為0.769%。

綜上所述，應(yīng)用羅氏公司Cobas E602電化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)AMH，精密度和準(zhǔn)確度高，具有良好的線性測(cè)量范圍及攜帶污染率低，驗(yàn)證和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)符合，可為臨床檢測(cè)工作提供準(zhǔn)確的參考依據(jù)。

[1]王巧麗，舒婷婷，陳曉紅，等．抗苗勒管激素與卵巢儲(chǔ)備功能關(guān)系的研究進(jìn)展[J]．國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，36(1)：104-105．

[2]Jamil Z,Fatima SS,Ahmed K,et al.Anti-Mullerian hormone:above and beyond conventional ovarian reserve markers[J].Dis Markers,2016，2016(3):1-9.

[3]NCCLS.EP5-A Evaluation of precision performance of clinical chemistry devices:approved guideline[S].Wayne,PA,USA:NCCLS,1999.

[4]NCCLS.EP15-A User demonstration of performance for precision and accuracy:approved guideline[S].Wayne,PA,USA:NCCLS,2001.

[5]NCCLS.EP6-A Evaluation of linearity of quantitative measurement procedures:a statistical approach approved guideline[S].Wayne,PA,USA:NCCLS,2003.

[6]田潤(rùn)華，鄭春喜，王士珍．電化學(xué)發(fā)光免疫分析與臨床應(yīng)用[J]．齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2004，19(5)：464-465．

[7] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法[S].北京:衛(wèi)生部,2006:6．

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.039

A

1673-4130(2016)23-3338-03

2016-06-18

2016-09-08)