于鵬程，閆江泓，吳未辰，由淑貞，陶曉燕，朱武洋，紀(jì) 軍△

(1.中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206；2.北京博雅晟康醫(yī)學(xué)科技有限公司 100872)

?

·臨床研究·

狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒的效果評(píng)價(jià)*

于鵬程1，閆江泓1，吳未辰1，由淑貞2，陶曉燕1，朱武洋1，紀(jì) 軍2△

(1.中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所，北京 102206；2.北京博雅晟康醫(yī)學(xué)科技有限公司 100872)

目的 應(yīng)用快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)對(duì)狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒的檢測效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法 用RFFIT和狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒分別對(duì)135份人血清和164份動(dòng)物血清進(jìn)行狂犬病病毒中和抗體(RVNA)效價(jià)檢測，應(yīng)用SPSS22.0分析兩種檢測方法所得結(jié)果的相關(guān)性和一致性。結(jié)果 兩種方法所得結(jié)果的陽性檢出符合率為99.33%(297/299)；兩種方法對(duì)動(dòng)物血清和人血清的檢測結(jié)果之間有較好的直線相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.897和0.941；同一份標(biāo)本的重復(fù)性檢驗(yàn)顯示，試劑盒檢測方法具有較好的穩(wěn)定性。結(jié)論 狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒可以用于人和動(dòng)物血清狂犬病病毒中和抗體的檢測。

狂犬病病毒； 中和抗體； 快速熒光灶抑制試驗(yàn)

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一種人獸共患傳染病，病死率幾乎100%。中國是狂犬病的高發(fā)區(qū)，目前每年仍有近千人死于狂犬病。疫苗免疫接種是預(yù)防該病發(fā)生的唯一途徑，按世界衛(wèi)生組織(WHO)及國際獸疫局(OIE)的要求，人或動(dòng)物接種狂犬病疫苗后，需測定其血清內(nèi)的抗狂犬病病毒中和抗體效價(jià)，不低于 0.5 IU/mL時(shí)，方可認(rèn)為達(dá)到有效保護(hù)，否則應(yīng)予加強(qiáng)免疫，直至達(dá)到保護(hù)水平[1-2]?？焖贌晒庠钜种圃囼?yàn)(RFFIT)是WHO推薦的檢測狂犬病病毒中和抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法，也是2015年版《中華人民共和國藥典》第四部規(guī)定的檢測人免疫球蛋白效價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)方法。北京博雅晟康醫(yī)學(xué)科技有限公司研制的狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒以RFFIT為基礎(chǔ)，以自主制備的FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白熒光抗體為亮點(diǎn)，可應(yīng)用于人和動(dòng)物血清狂犬病病毒中和抗體效價(jià)的檢測。商品化試劑盒可解決RFFIT操作中熒光抗體、CVS毒株及所用BSR細(xì)胞株的標(biāo)準(zhǔn)化問題，有利于RFFIT的推廣使用，但其檢測效能需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)。鑒于此，本研究分別以人和動(dòng)物臨床血清標(biāo)本為檢測對(duì)象，運(yùn)用本科室所建立的標(biāo)準(zhǔn)RFFIT對(duì)該狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒的檢測效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 材料來源 動(dòng)物血清為鼠血清，共164份，為狂犬病疫苗免疫前或免疫后采集的試驗(yàn)標(biāo)本，由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。人血清135份，為狂犬病疫苗免疫前或免疫后采集的標(biāo)本，由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 儀器與試劑 RFFIT所用試劑：DMEM高糖培養(yǎng)液、胰酶、雙抗、胎牛血清均購自Gibico公司；抗狂犬病病毒核蛋白熒光抗體，購自美國FDI Fujirebio Diagnostics公司；倒置顯微鏡為日本奧林巴斯CXX41型；熒光顯微鏡為日本奧林巴斯IX51型?？袢《綜VS-11標(biāo)準(zhǔn)攻擊毒株，由本實(shí)驗(yàn)室(中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所狂犬病室)保存；BSR細(xì)胞，為倉鼠腎細(xì)胞BHK-21的克隆，由本實(shí)驗(yàn)室保存。WHO標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)為30 IU/mL，購自英國國立生物制品和控制標(biāo)準(zhǔn)品研究所?？袢〔《局泻涂贵w檢測試劑盒由北京博雅晟康醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。

1.3 方法 RFFIT方法操作程序：將待測血清于56 ℃滅活30 min，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于96孔板做3倍系列稀釋；標(biāo)準(zhǔn)血清、強(qiáng)陽性血清、弱陽性血清和陰性血清用同樣方法進(jìn)行系列稀釋；病毒對(duì)照孔做連續(xù)的倍比稀釋；除病毒對(duì)照孔外，其他各孔均加入50 μL最適攻擊量病毒，于37 ℃ 5% CO2孵箱孵育1 h進(jìn)行中和后，每孔加入50 μL濃度為 1×106cells/mL 的細(xì)胞懸液；于37 ℃ 5% CO2孵箱孵育24 h。將96孔板從孵箱內(nèi)取出，于P2實(shí)驗(yàn)室安全柜內(nèi)，丟棄培養(yǎng)上清液，磷酸鹽緩沖液(PBS)液洗1遍；用80%冷丙酮4 ℃固定30 min；將丙酮棄去，加入50 μL抗狂犬病毒核蛋白熒光抗體染色液，37 ℃孵育 30 min后用PBS液洗3遍；加入60%甘油，在熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光灶讀數(shù)。以應(yīng)用軟件 Microsoft Excel為基礎(chǔ)，根據(jù)操作程序中確定的稀釋梯度，結(jié)合Reed & Muench法公式，以血清標(biāo)準(zhǔn)品滴度為參照系數(shù)，被測標(biāo)本50%感染孔前后稀釋倍數(shù)為變量的中和抗體滴度計(jì)算公式計(jì)算中和抗體滴度。應(yīng)用狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒進(jìn)行平行檢測時(shí)嚴(yán)格遵守試劑盒的操作規(guī)程。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)一的Excel記錄標(biāo)本的檢測信息，采用SPSS22.0軟件進(jìn)行檢測結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，包括兩種檢測方法所得檢測結(jié)果的陽性檢出符合率的比較、相關(guān)性分析以及重復(fù)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 陽性檢出符合率分析 按照達(dá)到或超過0.5 IU/mL者為陽性結(jié)果，低于0.5 IU/mL者為陰性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。全部299份標(biāo)本中，兩種檢測方法的陽性檢出符合率為99.33%(297/299)。

2.2 檢測結(jié)果相關(guān)性分析 對(duì)164份動(dòng)物血清和135份人血清分別采用兩種檢測方法進(jìn)行檢測，并對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行回歸分析。針對(duì)動(dòng)物血清標(biāo)本，兩種方法的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(R=0.897，P<0.01)，但二者直線相關(guān)關(guān)系良好(R2=0.804)(圖1)。針對(duì)人血清標(biāo)本，兩種方法的檢測結(jié)果具有更好的直線相關(guān)關(guān)系(R2=0.886)(圖2)。

圖1 動(dòng)物血清檢測結(jié)果的相關(guān)性分析

圖2 人血清檢測結(jié)果相關(guān)性分析

圖3 兩種方法檢測結(jié)果的重復(fù)性比較

2.3 檢測試劑盒穩(wěn)定性分析對(duì)同一血清標(biāo)本分別采用RFFIT方法和狂犬病病毒中和抗體檢測試劑盒兩種方法進(jìn)行檢測12次。RFFIT的檢測值在1.32～2.06 IU/mL，最大差值0.74 IU/mL，GMT=1.58 IU/mL，SD=0.20；狂犬病中和抗體檢測試劑盒的檢測值在1.32～2.09 IU/mL，最大差值0.77 IU/mL，GMT=1.57 IU/mL，SD=0.25(圖3)。該結(jié)果顯示，中和抗體檢測試劑盒具有良好的穩(wěn)定性。

3 討 論

目前，WHO 和 OIE 推薦的應(yīng)用于狂犬病病毒中和抗體檢測的方法主要有小鼠中和試驗(yàn)(MNT)、RFFIT和狂犬病病毒熒光抗體中和試驗(yàn)(FAVN)；2016版《狂犬病預(yù)防控制技術(shù)指南》、2014版《狂犬病監(jiān)測方案》及2009版《狂犬病暴露預(yù)防處置工作規(guī)范》明確指出，如需檢測狂犬病酶中和抗體水平，應(yīng)當(dāng)采取中和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測，主要包括RFFIT及MNT 兩種方法。本實(shí)驗(yàn)室于2009年建立RFFIT方法至今，已檢測上萬份人或動(dòng)物血清標(biāo)本，以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本實(shí)驗(yàn)室的RFFIT方法具有良好的穩(wěn)定性、敏感性及重復(fù)性[3]。但由于RFFIT需要使用狂犬病固定毒株CVS-11，以及價(jià)格昂貴的FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白熒光抗體，因此即便每年的《狂犬病監(jiān)測與檢測培訓(xùn)班》均會(huì)對(duì)該方法進(jìn)行培訓(xùn)與推廣，但僅有少數(shù)幾家省級(jí)疾控中心能建成該實(shí)驗(yàn)方法并進(jìn)行應(yīng)用。為此，國內(nèi)外部分機(jī)構(gòu)和企業(yè)研制了狂犬病中和抗體或抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒、膠體金檢測試劑盒等[4-5]。但這些方法所包被的抗原多為狂犬病全病毒、狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白或者其他抗原成分，測定的抗體不只是狂犬病中和抗體，因此只能用于中和抗體的定性檢測。

狂犬病中和抗體檢測試劑盒在RFFIT原理上建立，自主制備FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒核蛋白熒光抗體的狂犬病中和抗體檢測試劑盒。應(yīng)用RFFIT和狂犬病中和抗體試劑盒同時(shí)檢測人和動(dòng)物血清標(biāo)本299份，對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該試劑盒具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，能夠用于人和動(dòng)物血清標(biāo)本狂犬病中和抗體的檢測。

[1]俞永新．狂犬病和狂犬病疫苗[M]．2版．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2009．

[2]WHO.WHO Expert Consultation on Rabies，second report[R].Geneva:2013.

[3]Yu P,Lv X,Shen X,et al.Establishment and preliminary application of a rapid fluorescent focus inhibition test(RFFIT) for rabies virus[J].Virol Sin,2013,28(4):223-227.

[4]呂新軍，王偉偉，李云云，等．采用快速熒光灶抑制試驗(yàn)對(duì)一種狂犬病病毒抗體競爭性ELISA檢測法的評(píng)價(jià)[J]．國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32(6)：640-641．

[5]范曉娟，李剛，邱文英，等．膠體金免疫層析檢測犬、貓抗狂犬病病毒IgG抗體的研究[J]．中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2010，26(8)：753-757．

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31500152);國家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2014BAI13B04)；艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2014ZX10004-002)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.035

A

1673-4130(2016)23-3331-02

2016-06-13

2016-09-03)

△通訊作者，E-mail:boyask@bj_boyask.com。