柳光芬

(重慶市消防總隊醫(yī)院 401120)

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·論 著·

二甲雙胍對人絨毛膜癌細胞凋亡的影響

柳光芬

(重慶市消防總隊醫(yī)院 401120)

目的 觀察二甲雙胍對人絨毛膜癌細胞凋亡的影響和可能的作用機制。方法 選用人絨毛膜癌細胞系JEG-3，分為對照組和二甲雙胍組(終濃度為5、10、20、40 mmol/L)處理48 h后，使用流式細胞術和免疫熒光檢測細胞凋亡情況，分別采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)和免疫蛋白印跡檢測凋亡相關基因半胱天冬酶-3(Caspase-3)、Bcl-2和凋亡調節(jié)蛋白(Bax)的mRNA及蛋白變化趨勢。結果 和對照組相比，二甲雙胍組的JEG-3細胞早晚期凋亡率顯著上升，同時Caspase-3和Bax的mRNA及蛋白表達水平顯著增加，但Bcl-2的mRNA和蛋白表達顯著降低。結論 二甲雙胍可以通過Caspase-3及Bcl-2/Bax通路誘導JEG-3細胞發(fā)生凋亡。

人絨毛膜癌細胞； 二甲雙胍； 細胞凋亡

絨毛膜癌是一種較為罕見的婦產科腫瘤，其來源于滋養(yǎng)層細胞具有高度的增殖力和侵襲性。絨癌通常繼發(fā)于葡萄胎、流產或分娩后的育齡期婦女，偶發(fā)于兒童或男性。目前的治療手段主要采取5-氟尿嘧啶等化療為主的方法，盡量保留患者的子宮和卵巢。二甲雙胍是常用的糖尿病降糖藥，也可以用于妊娠期糖尿病；近期有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以抑制宮頸癌、食管癌、肝癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞的生長和發(fā)展，是潛在治療腫瘤的新型藥物[1-5]。目前，二甲雙胍對絨癌細胞的抑制能力和機制尚不清楚，因此本研究擬以人絨癌細胞系JEG-3為模型，初步探討二甲雙胍處理對JEG-3細胞凋亡的影響和可能的作用機制，為其臨床應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源 人絨毛膜癌細胞株JEG-3購于上海細胞所；胎牛血清(杭州四季清公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；二甲雙胍(美國Sigma公司)；流式細胞凋亡檢測試劑盒(北京凱基公司)，細胞增殖和活性檢測試劑盒(CCK-8)和末端脫氧核苷?；D移酶介導性dUTP切口末端標記試劑盒(TUNEL)(碧云天公司)，半胱天冬酶-3(Caspase-3)、β-肌動蛋白(β-actin)、Bcl-2和凋亡調節(jié)蛋白(Bax)抗體(美國Abcam公司)。

1.2 細胞培養(yǎng) JEG-3細胞株使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中分別加入100 U/mL的青鏈霉素。置于37 ℃、5%的CO2濃度濕度飽和的CO2培養(yǎng)箱中，當細胞密度達到80%～90%時進行傳代。

1.3 細胞分組及藥物濃度篩選 取對數(shù)生長期的JEG-3細胞消化重懸后接種于96孔板中，接種密度為3 000細胞/孔。培養(yǎng)過夜后，分別用終濃度為5、10、20、40 mmol/L的二甲雙胍處理(二甲雙胍組)，每組設6個復孔并以未處理組為對照組。處理48 h后吸去孔中培養(yǎng)基，加入預混有CCK-8溶液的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀490 nm波長下測定各孔的吸光度值(OD490)，并減去空白孔的讀數(shù)以消除本底，計算藥物對細胞增殖的抑制率。抑制率=(對照組OD490-二甲雙胍組OD490)/對照組OD490×100%。選取接近50%抑制率的藥物濃度進行下面的干預實驗。

1.4 TUNEL 取對數(shù)生長期的JEG-3細胞，以每孔2×104接種于預先放置有1 cm×1 cm玻璃片的24孔板中，按照二甲雙胍組干預培養(yǎng)48 h。4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌后使用0.1%的Triton X-100冰上孵育2 min，加入50 μL的TUNEL檢測液37 ℃避光孵育60 min，DAPI染色30 min，PBS洗滌后抗淬滅封片劑封片后使用激光共聚焦顯微鏡照相，每組隨機取8個視野統(tǒng)計平均陽性細胞數(shù)。

1.5 流式細胞檢測凋亡 收集處理完成的二甲雙胍組和對照組細胞，按照膜聯(lián)蛋白(Annexin V/PI)凋亡檢測試劑盒說明書進行染色。離心去上清液后加入500 μL的固定液重懸細胞，隨后加入Annexin V和PI染液各5 μL，混勻后避光反應10 min后上機進行流式檢測。

1.6 實時定量熒光聚合酶鏈反應(PCR) 取處理完成的二甲雙胍組和對照組細胞，胰酶消化后去上清液加入500 μL裂解液，采用離心柱法提取細胞總RNA。隨后根據(jù)反轉錄試劑盒說明合成cDNA，采用Syber-green法檢測Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表達水平，并用β-actin為內參。實時熒光定量PCR的引物見表1。

表1 實時熒光PCR各基因的引物序列

1.7 免疫印跡試驗 二甲雙胍處理細胞48 h后，胰酶消化離心棄上清液，加入適量的細胞裂解液裂解細胞，冰上振蕩7 min再用超聲破碎儀低檔處理5 min，4 ℃，15 000 r/min離心10 min獲取上清液中的總蛋白。BCA試劑盒對總蛋白定量，蛋白上樣量為40 μg，SDS電泳后轉膜，一抗4 ℃過夜二抗室溫1 h后化學發(fā)光法顯色，并使用Quantity One軟件分析各條帶的灰度值。

2 結 果

2.1 二甲雙胍抑制JEG-3細胞的最佳藥物濃度 CCK-8結果顯示，5、10、20、40 mmol/L濃度的二甲雙胍處理均對ABC細胞的增殖有抑制作用。并且在5、10、20、40 mmol/L濃度時表現(xiàn)為劑量依耐性，抑制率隨著藥物濃度的增加而依次遞增，見圖1。20 mmol/L二甲雙胍對JEG-3的抑制率為46.10%，而40 mmol/L的抑制率為58.98%超過50%，表明20 mmol/L的二甲雙胍是JEG-3細胞的最佳藥物濃度。

圖1 不同濃度二甲雙胍對JEG-3細胞的抑制率

2.2 二甲雙胍促進JEG-3細胞凋亡 二甲雙胍作用48 h后，流式細胞檢測細胞早期凋亡的比率為25.86%，而對照組僅為4.32%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TUNEL實驗顯示，二甲雙胍組中平均每視野陽性細胞數(shù)(19.00±4.86)高于對照組(3.83±2.82)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明，二甲雙胍可以同時促進JEG-3細胞的早/晚期凋亡發(fā)生。

2.3 二甲雙胍對細胞凋亡相關基因的影響 二甲雙胍作用48 h后，使用熒光定量PCR檢測細胞凋亡相關基因的mRNA變化水平發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理后促凋亡基因Caspase-3和Bax表達增加，同時下調抗凋亡基因Bcl-2，和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為正常JEG-3細胞；B為二甲雙胍處理后的JEG-3細胞；C為兩組細胞凋亡數(shù)統(tǒng)計結果。

圖2 TUNEL法檢測二甲雙胍對JEG-3細胞凋亡的影響

圖3 二甲雙胍對凋亡相關基因mRNA表達水平的影響

注：A為Western bolt圖；B為Caspase-3，Bcl-2和Bax蛋白相對表達量分析；C為Bcl-2和Bax蛋白相對表達量比。

圖4 二甲雙胍對凋亡相關蛋白表達水平的影響

2.4 二甲雙胍對細胞凋亡相關蛋白的影響 二甲雙胍處理JEG-3細胞后通過檢測細胞凋亡相關基因的蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)其和mRNA變化程度類似，二甲雙胍可以降低抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表達同時上調Bax和Caspase-3，并且導致Bcl-2/Bax比值上調，和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3、4。

3 討 論

二甲雙胍療效確切，不良反應小，是臨床上常用的降糖藥。有流行病學研究發(fā)現(xiàn)長期使用二甲雙胍控制血糖的腫瘤患者的生存率要高于未服用患者，提示其對腫瘤可能有一定的治療作用。有研究者對10 309例2型糖尿病患者隨訪調查發(fā)現(xiàn)，合并腫瘤的患者中使用二甲雙胍的病死率要明顯低于使用胰島素和磺脲類藥物的患者[6]。近年來，越來越多的實驗證實其對腫瘤細胞的周期、代謝、增殖都有抑制作用，可能是潛在的腫瘤治療藥物[7]。

細胞凋亡受到促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類蛋白的共同調節(jié)，是一個動態(tài)平衡的過程。Bcl-2家族在線粒體介導的細胞凋亡中起關鍵作用，該家族包括Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w等抗凋亡蛋白以及Bax、Bak和Bid等促凋亡蛋白[8-10]。Bcl-2/Bax是衡量細胞凋亡程度的重要指標，通常在惡性腫瘤細胞中Bcl-2高表達而Bax低表達，兩者的比值較高[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍處理絨癌細胞JEG-3后，具有抗凋亡功能的Bcl-2受到抑制而能夠促進細胞凋亡的Bax則表達增加，Bcl-2/Bax比值下降和未處理組相比差異有統(tǒng)計學意義。有報道指出二甲雙胍可以通過AMPK和mTOR等信號通路，動態(tài)調節(jié)Bcl-2和Bax的表達水平從而參與調控腫瘤細胞的凋亡[14]，這將在本實驗的后續(xù)研究中展開。

經(jīng)過二甲雙胍處理的JEG-3細胞早晚期凋亡率上升，并且凋亡相關蛋白Caspase-3升高。當細胞啟動凋亡進程后，激活Caspase-3參與多種凋亡發(fā)生途徑促使細胞凋亡發(fā)生。Caspase-3可以抑制Bcl-2的功能，而Bcl-2/Bax比率下調，結合細胞水平上早/晚期凋亡率的增加，提示二甲雙胍是通過抑制抗凋亡基因Bcl-2、上調促凋亡基因Bax及Caspase-3，從而激活線粒體凋亡途徑，促使JEG-3細胞發(fā)生凋亡[15-18]。

本研究采用人絨毛膜癌細胞系JEG-3為對象，探討了二甲雙胍對JEG-3細胞凋亡的影響及作用機制。通過藥物抑制率實驗發(fā)現(xiàn)二甲雙胍的最佳作用濃度，并且使用流式細胞術和TUNEL實驗從兩方面證實，二甲雙胍處理48 h可以顯著提高絨癌細胞的早/晚期凋亡率，其可能是上調Caspase-3和Bax同時抑制Bcl-2以促進腫瘤細胞凋亡的發(fā)生。

但是，本實驗所采用的二甲雙胍濃度顯著高于其作為降糖藥時的血藥濃度，其作為腫瘤治療藥物的應用還需要大量嚴謹?shù)呐R床前研究來加以證明。

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Effect of metformin on human choriocarcinoma cell apoptosis

LIUGuangfen

(ChongqingMunicipalFireCorpsHospital,Chonqing401120,China)

Objective To investigate the effects of metformin on apoptosis of human choriocarcinoma cell and its possible action mechanism.Methods The human choriocarcinoma cell line JEG-3 was selected and divided into the control group and metformin groups(final concentrations of 5,10,20,40 mmol/L).Flow cytometry and immunofluorescence assay were adopted to detect cell apoptosis at 48 h after treatment.The mRNA and protein change trend of Caspase-3，Bcl-2 and Bax were measured by Real-time PCR and Western Bolt.Results Compared with the control group,the early and late apoptosis rate of JEG-3 cells in the metefomin groups were remarkably increased,meanwhile mRNA and protein expression levels of Caspase-3 and Bax were significantly increased，but Bcl-2 mRNA and protein expression were significantly decreased.Conclusion Metformin induces the JEG-3 cells to generate apoptosis by the Caspase-3 and Bcl-2/Bax pathways.

human choriocarcinoma; metformin; cell apoptosis

柳光芬，女，主任技師，主要從事臨床檢驗研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.015

A

1673-4130(2016)23-3280-03

2016-02-28

2016-05-18)