李 科，魏義勇，劉 云，曹 嵩，劉興奎，王海英，喻 田

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099； 2. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099；3. 遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

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技術(shù)與方法

Nycodenz密度梯度離心法提取及純化大鼠心肌線粒體

李 科1，魏義勇2，劉 云3，曹 嵩2，劉興奎2，王海英2，喻 田2

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099； 2. 遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099；3. 遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

目的 建立一種利用Nycodenz密度梯度離心法提取組織線粒體的方法。方法 傳統(tǒng)離心方法得到粗提線粒體后，在Nycodenz密度梯度介質(zhì)中超高速離心得到純化線粒體，進(jìn)一步在經(jīng)改良的線粒體分離介質(zhì)中重復(fù)離心2次，得到高純度的線粒體。利用透射電鏡和Western Blot檢測線粒體純度。結(jié)果 使用Nycodenz密度梯度離心法和線粒體分離介質(zhì)提純的線粒體量多、純度較高(COX Ⅳ含量純化組：粗提組=220%±26%vs.160%±34%，P<0.05)，且電鏡照片顯示結(jié)構(gòu)完整。結(jié)論 使用Nycodenz密度梯度離心法可獲得高純度且結(jié)構(gòu)較完整的線粒體。

線粒體；密度梯度離心法；Nycodenz;大鼠

線粒體作為機(jī)體主要能量來源的細(xì)胞器，歷來是細(xì)胞和分子生物學(xué)研究的焦點。近年來，隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對線粒體的研究領(lǐng)域也不斷拓寬，其中包括線粒體蛋白組學(xué)[1-2]、線粒體表觀遺傳學(xué)[3]、自噬[4]，線粒體的進(jìn)化生物學(xué)[5]，線粒體分子病[6]等。線粒體在許多疾病中扮演著重要角色，因此，從動物或人體組織中提取線粒體作為研究的基礎(chǔ)模型很有現(xiàn)實意義。從動物組織或細(xì)胞系中提取線粒體的方法報道較少[7-9]，國內(nèi)更是鮮有報道[10]，因此各實驗室提取條件不盡相同，尤其是提取液成分各異，或細(xì)節(jié)注意不夠，這就使得提取的線粒體的數(shù)量和質(zhì)量得不到保證，最終還會影響依賴線粒體進(jìn)行的下一步研究結(jié)果?，F(xiàn)以從成年大鼠心肌細(xì)胞提取線粒體的提取方法為例，討論如何從動物組織中提取并純化線粒體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性SD大鼠，重250～300 g，4～5月齡(由第三軍醫(yī)大學(xué)提供)。

1.1.2 主要試劑 K-H液，成分(單位mmol/L)：NaCl 118.00、NaHCO324.80、KCl 4.75、CaCl22.50、MgCl2·6H2O 1.19、KH2PO41.19、葡萄糖11.1、線粒體分離介質(zhì)(210 mmol/L mannitol、5 mmol/L Tris-HCl、70 mmol/L sucrose、1 mmol/L EDTA，pH =7.4)、Nycodenz密度梯度介質(zhì)(20%～34%，溶于線粒體分離介質(zhì))、裂解液(7 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、5 mmol/L EGTA、4% CHAPS、65 mmol/L DTT，pH =7.4)等[11]。以上試劑購自Sigma公司或Amresco公司。BCA蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天公司。

1.1.3 主要儀器 垂直凝膠電泳儀(Bio-Rad，美國)、高速離心機(jī)(Thermo Fisher，美國)、超速離心機(jī)(Beckman，美國)、透射電鏡(HITACHI，日本)、Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)(Licor，美國)。

1.2 方法

1.2.1 心肌取材 腹腔給予40 mg/kg異戊巴比妥鈉麻醉大鼠，迅速打開胸腔，剪下心臟，放入4 °C預(yù)冷且置于冰上的K-H液中[11- 12]，剪下心室肌，洗凈。

1.2.2 線粒體提取及純化 以下步驟均在冰浴條件下操作。按圖1所示流程，心室肌置于線粒體分離介質(zhì)，剪去結(jié)締組織，在50 mL離心管中剪碎成1 mm3左右的組織塊，使用電動勻漿器(IKEA，Sweden)進(jìn)行組織勻漿，勻漿10 s，間隔10 s，直至無肉眼可見的組織塊；4 °C，1 000g，離心勻漿10 min，轉(zhuǎn)移上清液至另一離心管中，4 °C，1 000g，離心 10 min，沉淀即為粗提線粒體。將1.2 mL 25% Nycodenz 密度梯度介質(zhì)加入粗提線粒體中，在冰浴中充分吹打均勻， 5 mL離心管，按圖2A 所示的順序及體積，將密度梯度介質(zhì)鋪層，4 °C，100 000g，離心 60 min；密度梯度離心結(jié)束后，將線粒體層的混合物轉(zhuǎn)移至1.5 mL Ep管，用1倍體積的線粒體分離介質(zhì)液渦旋混勻，4 °C，15 000g，離心 10 min，沉淀即為純化的線粒體[11]。

圖1 Nycodenz密度梯度離心法分離提純線粒體流程圖

1.2.3 Western Blot檢測線粒體純度 線粒體裂解液冰浴純化線粒體，超聲破碎3 min，4 °C、20 000g，離心30 min，上清即線粒體蛋白。BCA蛋白定量試劑盒行線粒體總蛋白定量。Western Blot法測定每組各亞細(xì)胞器標(biāo)志性蛋白(COX Ⅳ，線粒體內(nèi)膜標(biāo)志物)、(β-actin，細(xì)胞膜標(biāo)志物)、(Calnexin，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物)和(GADPH，細(xì)胞漿蛋白標(biāo)志物)的含量。參照文獻(xiàn)[13- 14]，行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，一抗、熒光二抗孵育，Odyssey熒光成像系統(tǒng)曝光，統(tǒng)計熒光值。

1.2.4 透射電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu) 3%戊二醛和1%鋨酸固定線粒體后70%酒精和醋酸雙氧過飽和溶液浸泡過夜，在接受90%酒精和90%丙酮浸泡、100%丙酮洗滌、100%丙酮、包膜脂按照1∶1的比例混合后35 °C包埋過夜。行超薄切片，檸檬酸鉛染色后透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 線粒體的提取 Nycodenz密度梯度介質(zhì)在離心管中的鋪層(見圖2A)，初次離心后可得到粗提線粒體(見圖2B)；進(jìn)一步Nycodenz密度梯度離心后粗提線粒體成分分為兩部分：溶于23%～25%密度層的較純線粒體(見圖2C)和溶于25%～30%層的細(xì)胞碎片和線粒體雜質(zhì)(見圖2D)。

A：Nycodenz密度梯度介質(zhì)在離心管中的鋪層示意圖；B：粗提線粒體；C～D：Nycodenz密度梯度介質(zhì)中離心后的線粒體和細(xì)胞碎片及線粒體雜質(zhì)的分層及電鏡圖像。 圖2 Nycodenz密度梯度離心法分離及提純線粒體

2.2 線粒體純度的驗證 使用Western Blot法檢測心肌細(xì)胞各亞細(xì)胞器標(biāo)志蛋白的表達(dá)(見圖3A)。以組織勻漿組作為參照(100%)，純化組COX Ⅳ的含量明顯高于粗提組(220%±26% vs.160%±34%，P<0.05)。純化組β-actin、Calnexin和GADPH的含量明顯低于粗提組(P<0.05，見圖3B)。

A：Western Blot檢測線粒體純度；B：熒光定量，n=3，*：P<0.05。 圖3 各亞細(xì)胞器標(biāo)志蛋白表達(dá)的免疫印跡圖及熒光值定量

3 討論

線粒體對滲透壓非常敏感，因此分離介質(zhì)的滲透壓必需接近在體水平以保持線粒體結(jié)構(gòu)的完整性。據(jù)報道，最佳的線粒體分離介質(zhì)是蔗糖與甘露醇的混合溶液。離體線粒體保存液中的Mg2+、Ca2+等離子滲透入線粒體會造成線粒體的腫脹甚至裂解。在線粒體分離介質(zhì)中加入EDTA可以鰲合溶液中的金屬離子，有助于保持線粒體的完整。此外，pH是另一影響線粒體穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。本實驗使用到的線粒體分離介質(zhì)經(jīng)過了優(yōu)化改進(jìn)，其滲透壓在體范圍(290～310 mOsm/L)，可以最大程度地保持線粒體結(jié)構(gòu)與功能的完整。

采用機(jī)械方法裂解細(xì)胞獲得的線粒體結(jié)構(gòu)較完整。相比化學(xué)裂解，機(jī)械破碎線粒體排除了反復(fù)凍融、裂解用的有機(jī)溶劑等對線粒體造成的損傷，因此本研究中采用內(nèi)切式高速勻漿機(jī)進(jìn)行心肌組織裂解。

差速離心法分離線粒體是基于線粒體的重量、密度與形狀與其他細(xì)胞組分的不同。差速離心去除了細(xì)胞核、未破裂細(xì)胞與其他亞細(xì)胞成分，但差速離心沉淀線粒體的同時伴有細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體等密度與線粒體相近的其他細(xì)胞組分的混入。本研究在差速離心的基礎(chǔ)上加入不連續(xù)Nycodenz密度梯度離心。不同密度的亞細(xì)胞器能在不同濃度的密度梯度介質(zhì)里穩(wěn)定在某一位置從而將不同密度的細(xì)胞成分區(qū)分開來。Nycodenz密度梯度介質(zhì)為目前分離純化線粒體的良好介質(zhì)，我們在文獻(xiàn)[15]基礎(chǔ)上稍作改進(jìn)，在Nycodenz的溶劑選擇上，使用了線粒體分離介質(zhì)取代0.25 mol/L蔗糖，因為和蔗糖溶液相比，線粒體分離介質(zhì)的成分更接近在體條件，進(jìn)一步保持了線粒體的完整性。

我們從細(xì)胞各組分生物標(biāo)識物的角度出發(fā)，利用各亞細(xì)胞器特異的標(biāo)識蛋白，輔以Western Blot來驗證線粒體的純度。以細(xì)胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(COX Ⅳ)作為線粒體內(nèi)膜標(biāo)志物，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、骨架/質(zhì)膜及胞漿特異標(biāo)志物證實了純化線粒體所含其它亞細(xì)胞器成分較少，說明線粒體純度較高。

本實驗介紹的Nycodenz 不連續(xù)密度梯度離心法可以提取并純化大鼠心肌線粒體，純化的線粒體將為以線粒體為模型的研究提供基本保障。

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[收稿2016-08-08;修回2016-09-10]

(編輯：王 靜)

Isolation and purification of rat myocardial mitochondria with Nycodenz density gradient centrifugation

LiKe1,WeiYiyong2,LiuYun3,CaoSong2,LiuXingkui2,WangHaiying2,YuTian2

(1.Department of Anesthesiology,Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China；2.Department of Anesthesiology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China；3.Research Center for Medicine & Biology,Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To introduce a tissue mitochondria isolation and purification method with Nycodenz density gradient centrifugation. Methods Mitochondria obtained by traditional centrifugation method were subjected to super-centrifugation in different density Nycodenz layers before centrifugation twice in modified mitochondrial isolation media. Electron microscopy and Western Blot were employed to test the purity of mitochondria. Results Mitochondria obtained with Nycodenz density gradient centrifugation and our modified mitochondrial isolation media were more abundant and purer than that from the traditional method. Conclusion Nycodenz density gradient centrifugation is an optimal method to get pure and structural integrity mitochondria.

mitochondria; density gradient centrifugation; Nycodenz;rat

衛(wèi)生部公益性行業(yè)科研專項(NO：200802173)；貴州省科技廳、遵義市科技局、遵義醫(yī)學(xué)院聯(lián)合基金資助項目(NO:黔科合J字LKZ[2013]31)。

喻田，女，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：全身麻醉機(jī)制、疼痛相關(guān)機(jī)制、心肌保護(hù)，E-mail:zunyiyutian@163.com。

R363

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1000-2715(2016)05-0525-04