竇玥瑩，劉衡，張娜，劉璐，鄧洪斌

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注射用腦蛋白水解物對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖與MPP+誘導(dǎo)的氧化損傷的影響

竇玥瑩，劉衡，張娜，劉璐，鄧洪斌

目的 探究注射用腦蛋白水解物對(duì)大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤（PC12）細(xì)胞增殖與 1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的影響，為建立評(píng)價(jià)腦蛋白水解物活力檢測(cè)方法提供科學(xué)依據(jù)。方法 通過(guò) MPP+損傷 PC12 細(xì)胞后，采用 MTT 法測(cè)定不同廠家、不同濃度的注射用腦蛋白水解物對(duì) PC12 細(xì)胞的修復(fù)作用，通過(guò)測(cè)定其吸光度與正常細(xì)胞吸光度的比值來(lái)計(jì)算樣品對(duì) PC12 細(xì)胞損傷的修復(fù)率，以此作為注射用腦蛋白水解物活力考察的指標(biāo)。同時(shí)還對(duì)注射用腦蛋白水解物對(duì)于 MPP+損傷的不同亞型的PC12 細(xì)胞作用進(jìn)行了研究。結(jié)果 注射用腦蛋白水解物作用時(shí)間為 48 h、濃度為60 μg/ml 時(shí)對(duì) MPP+誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞的氧化損傷具有較好保護(hù)作用，并且對(duì)低分化型的 PC12 細(xì)胞具有更明顯的保護(hù)作用。結(jié)論 注射用腦蛋白水解物可促進(jìn)低分化型 PC12 細(xì)胞的增殖，并減輕 MPP+的損傷作用。研究建立的活力測(cè)定方法已經(jīng)被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采納。

PC12 細(xì)胞； MPP+； MTT； 注射用腦蛋白水解物

腦蛋白水解物是從健康的豬腦中提取得到的一種活性肽類水解物，含有多種氨基酸、卵磷脂及腦磷脂等，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的保護(hù)作用。腦蛋白水解物能夠顯著提高使用者的記憶力及注意力，因而臨床上常用于阿爾茨海默癥（老年癡呆）等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。目前國(guó)內(nèi)生產(chǎn)注射用腦蛋白水解物的廠家較多，因此需要建立合適的活性檢測(cè)指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量考察[1]。PC12 細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化的細(xì)胞株，其受體及合成的遞質(zhì)均與中腦多巴胺能神經(jīng)元十分接近，具有典型的神經(jīng)細(xì)胞特征，因此廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞死亡方式和神經(jīng)毒性損害的研究。目前，在具有神經(jīng)保護(hù)作用的藥物篩選中，PC12 細(xì)胞模型已得到廣泛應(yīng)用[2]。

目前文獻(xiàn)報(bào)道較多的 PC12 細(xì)胞損傷模型有 H2O2損傷模型和 1-甲基-4-苯基吡啶（MPP+）損傷模型。H2O2化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光、熱以及長(zhǎng)期存放都容易降解。我們前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，用 H2O2損傷模型評(píng)價(jià)注射用腦蛋白水解物活力的結(jié)果重現(xiàn)性較差，因此本研究中我們采用 MPP+損傷模型。MPP+為 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）經(jīng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的單胺氧化酶 B 催化后產(chǎn)生的有毒陽(yáng)離子，它可殺死大腦中黑質(zhì)致密部產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細(xì)胞[3]。MPP+在引發(fā)產(chǎn)生多巴胺神經(jīng)細(xì)胞死亡上具有高度選擇性，PC12 細(xì)胞上的多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可將 MPP+轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，引起線粒體功能的損傷。同時(shí)，MPP+還誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧簇（ROS），會(huì)進(jìn)一步損傷線粒體并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，MPP+損傷 PC12 細(xì)胞模型已成為篩選具有神經(jīng)保護(hù)作用藥物的常用模型之一[4]。

本研究采用 MTT 法測(cè)定正常組、損傷組及實(shí)驗(yàn)組的吸光度值并計(jì)算樣品對(duì) PC12 細(xì)胞損傷的修復(fù)率，來(lái)研究注射用腦蛋白水解物對(duì) MPP+損傷的 PC12 細(xì)胞的保護(hù)作用，并以此作為注射用腦蛋白水解物活力考察的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤懸浮型、低分化型及高分化型 PC12 細(xì)胞株均來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 藥物與試劑 注射用腦蛋白水解物樣品為隨機(jī)購(gòu)買的各生產(chǎn)企業(yè)的市售商品：施普善（進(jìn)口腦蛋白水解物，批號(hào) 224066 、CR9497）；河北智同（批號(hào) 0131012、0131202、0131216）；海南通用（批號(hào) 20130814-3、20130906-1）；哈爾濱三聯(lián)（批號(hào) 120202D1）；山西普德（批號(hào)20131014、20131214）；廣東百科（批號(hào)1309042、1309051）；廣東隆賦（批號(hào) 20130712-1）；北京四環(huán)科寶（批號(hào)13102028、13092023）；DMEM 培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液和青霉素/鏈霉素溶液均購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；馬血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；新生胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；MPP+和 MTT 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 器材及儀器 3111 型 CO2培養(yǎng)箱為美國(guó) Thermo 公司產(chǎn)品；生物安全柜為新加坡 Esco 公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為日本 Olympus 公司產(chǎn)品；iMark 多波長(zhǎng)酶標(biāo)儀為美國(guó) Bio-Rad 公司產(chǎn)品；單道和多道移液器為德國(guó) Eppendorf 公司產(chǎn)品；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板為美國(guó)康寧公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分組 ①空白對(duì)照組，僅加入 DMEM 或 RPMI 1640 完全培養(yǎng)液；②正常細(xì)胞組，僅加入 PC12 細(xì)胞；③損傷組，在細(xì)胞培養(yǎng)體系中僅加入 MPP+；④實(shí)驗(yàn)組，在細(xì)胞培養(yǎng)體系中先后加入注射用腦蛋白水解物及 MPP+。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤低分化型 PC12 細(xì)胞株，使用含 5% 馬血清和 5% 胎牛血清的 DMEM 完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)；高分化型 PC12 細(xì)胞株，使用含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)；懸浮型 PC12 細(xì)胞株，使用含 2.5% 馬血清和 15% 胎牛血清的 RPMI 1640 完全培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。

1.2.3 不同濃度 MPP+對(duì)細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 PC12 細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以 5 × 104個(gè)/ml 的濃度接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔 100 μl，設(shè)置空白對(duì)照組、正常細(xì)胞組及損傷組，每組3 個(gè)復(fù)孔。置 37 ℃，5% CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h 后，于損傷組中加入MPP+，使其終濃度分別為 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mmol/L。以培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，于無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)結(jié)束前 4 h，每孔加入5 mg/ml MTT 溶液 20 μl。結(jié)束培養(yǎng)后用 2 ml 注射器吸去上清，每孔加入 150 μl 二甲基亞砜，振蕩 10 min 后，于 570 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.2.4 不同濃度注射用腦蛋白水解物對(duì) MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響 接種細(xì)胞時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、正常細(xì)胞組、損傷組及實(shí)驗(yàn)組，每組 3 個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞接種方法如 1.2.3。置入 37 ℃，5% CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h 后，實(shí)驗(yàn)組中分別加入新鮮配制的不同濃度的注射用腦蛋白水解物（10、30、60、90、120、240 μg/ml）各 100 μl[5]，以 DMEM 完全培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，置于無(wú)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 h 后，于實(shí)驗(yàn)組和損傷組中加入 3.75 mmol/L 濃度的 MPP+50 μl，使 MPP+的終濃度為 0.75 mmol/L，同時(shí)以培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)結(jié)束前 4 h，每孔加入5 mg/ml MTT 溶液 20 μl。培養(yǎng)結(jié)束后用 2 ml 注射器吸去上清，每孔加入 150 μl 二甲基亞砜，振蕩 10 min 后，于 570 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.2.5 注射用腦蛋白水解物作用時(shí)間的確定 接種細(xì)胞時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、正常細(xì)胞組、損傷組及實(shí)驗(yàn)組，每組 3 個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞接種方法如 1.2.3。置入 37 ℃，5% CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h 后，實(shí)驗(yàn)組中加入新鮮配制的注射用腦蛋白水解物（60 μg/ml）100 μl，以 DMEM 完全培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，置于無(wú)菌培養(yǎng)箱分別培養(yǎng) 24 和 48 h 后，于實(shí)驗(yàn)組和損傷組中加入 3.75 mmol/L 濃度的 MPP+50 μl，使 MPP+的終濃度為 0.75 mmol/L，同時(shí)以培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)結(jié)束前 4 h，每孔加入 5 mg/ml MTT 溶液 20 μl。培養(yǎng)結(jié)束后用 2 ml 注射器吸去上清，每孔加入 150 μl 二甲基亞砜，振蕩 10 min 后，于 570 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.2.6 注射用腦蛋白水解物對(duì) MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響 接種細(xì)胞時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、正常細(xì)胞組、損傷組及實(shí)驗(yàn)組，每組 3 個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞接種方法如 1.2.3。置入 37 ℃，5% CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h 后，實(shí)驗(yàn)組中加入新鮮配制的不同廠家、不同批次的 60 μg/ml 的注射用腦蛋白水解物 100 μl，以 DMEM 完全培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。置于無(wú)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 h 后，于實(shí)驗(yàn)組和損傷組中加入 3.75 mmol/L 濃度的 MPP+50 μl，使 MPP+的終濃度為 0.75 mmol/L，同時(shí)以培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)結(jié)束前 4 h，每孔加入 5 mg/ml MTT 溶液 20 μl。結(jié)束培養(yǎng)后用 2 ml 注射器吸去上清，每孔加入 150 μl 二甲基亞砜，振蕩 10 min 后，于 570 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.2.7 不同 PC12 細(xì)胞亞型對(duì)注射用腦蛋白水解物活力測(cè)定的影響 12000 個(gè)/孔接種懸浮型和高分化型 PC12 于 96 孔板中。置入 37 ℃，5% CO2的無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h 后，實(shí)驗(yàn)組中加入新鮮配制的 60 μg/ml 的注射用腦蛋白水解物 100 μl，以 RPMI 1640 完全培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。置于無(wú)菌培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48 h 后，于實(shí)驗(yàn)組和損傷組中加入 3.75 mmol/L 濃度的 MPP+50 μl，使 MPP+的終濃度為 0.75 mmol/L，同時(shí)以培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于無(wú)菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24 h。培養(yǎng)結(jié)束前 4 h，對(duì)于懸浮型 PC12，每孔加入 5 mg/ml MTS 溶液 20 μl，結(jié)束培養(yǎng)后振蕩混勻于 570 nm 處測(cè)定吸光度值；對(duì)于高分化型 PC12，每孔加入 5 mg/ml MTT 溶液 20 μl。結(jié)束培養(yǎng)后用 2 ml 注射器吸去上清，每孔加入 150 μl 二甲基亞砜，振蕩 10 min 后，于 570 nm處測(cè)定吸光度值。

以下面兩式計(jì)算 MPP+損傷率和注射用腦蛋白水解物修復(fù)率：

損傷率 =（c–i）/c× 100%

修復(fù)率 =（x–i）/（c–i）× 100%。

其中：c為正常細(xì)胞組平均吸光度 – 空白對(duì)照組平均吸光度；

i為損傷細(xì)胞組平均吸光度 – 空白對(duì)照組平均吸光度；

x為供試品組平均吸光度 – 空白對(duì)照組平均吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每次實(shí)驗(yàn)至少設(shè)置三個(gè)重復(fù)組，各組內(nèi)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)不超過(guò) 15%，以此評(píng)價(jià)系統(tǒng)適用性。如果檢測(cè)到一個(gè)異常值，只要其他組相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差符合計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)，該異常值可以刪除。損傷率為 20% ~ 50% 時(shí)，試驗(yàn)成立。

2 結(jié)果

2.1 MPP+對(duì)細(xì)胞增殖的影響

為確定 MPP+損傷 PC12 細(xì)胞的最佳濃度，我們?cè)?PC12 細(xì)胞中加入不同濃度的 MPP+后，用 MTT 法測(cè)定細(xì)胞的存活率。由圖 1 可知，0.75 mmol/L 濃度的 MPP+溶液作用 PC12 細(xì)胞24 h 后，對(duì) PC12 細(xì)胞的損傷作用已達(dá)最大，損傷率為 50.82%，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用該濃度的 MPP+進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

損傷率（%）Damage rate (%)6050403020100 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 MPP+（mmol/L）

Figure 1 Different concentration of MPP+-induced reductions in PC12 cell viability

2.2 注射用腦蛋白水解物對(duì)細(xì)胞增殖的影響

為確定注射用腦蛋白水解物發(fā)揮作用的最佳濃度，我們用不同濃度的腦蛋白水解物處理 PC12 細(xì)胞后，加入終濃度為 0.75 mmol/L 的 MPP+，用 MTT 法測(cè)定細(xì)胞的存活率。由圖 2 的結(jié)果可知，注射用腦蛋白水解物對(duì) MPP+所致 PC12 細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用，且當(dāng)藥物濃度為 60 μg/ml 時(shí)，對(duì)損傷的 PC12 修復(fù)作用最為明顯，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取 60 μg/ml 的腦蛋白水解物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

對(duì)比圖2和圖3可以看出，經(jīng)過(guò)ARIMA模型修正后的預(yù)測(cè)結(jié)果較與單一的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)值具有更高的精度，且洪峰值更接近于徑流量的觀測(cè)值。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)精度，選用納什效率系數(shù)(NSE)、洪峰誤差百分比以及峰現(xiàn)時(shí)差作為模型對(duì)徑流量模擬的評(píng)價(jià)指標(biāo)，其具體公式如下：

修復(fù)率（%）Repair rate (%)6040200–20 腦蛋白水解物濃度（μg/ml）Concentration of cerebroprotein hydrolysate (μg/ml)

Figure 2 Effect of cerebroprotein hydrolysate with different concentration against MPP+-induced reductions in PC12 cell viability

2.3 注射用腦蛋白水解物作用時(shí)間的確定

為確定注射用腦蛋白水解物發(fā)揮作用的最佳時(shí)間，我們用 60 μg/ml 的腦蛋白水解物處理 PC12 細(xì)胞 24 或 48 h 后，加入終濃度為 0.75 mmol/L 的 MPP+，用 MTT 法測(cè)定細(xì)胞的存活率。由圖 3 結(jié)果可知，注射用腦蛋白水解物作用 48 h 后，對(duì) MPP+損傷 PC12 細(xì)胞的修復(fù)率要明顯好于 24 h 的修復(fù)率。因此，我們將腦蛋白水解物對(duì) PC12 細(xì)胞修復(fù)作用的最佳作用時(shí)間確定為 48 h。

修復(fù)率（%）Repair rate (%)100500 A1 A2 A3 B1 腦蛋白水解物Cerebroprotein hydrolysate

Figure 3 Effect of cerebroprotein hydrolysate from different time against MPP+-induced reductions in PC12 cell viability

2.4 注射用腦蛋白水解物對(duì) MPP+損傷細(xì)胞的影響

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)我們確定了注射用腦蛋白水解物活力測(cè)定方法中的幾個(gè)關(guān)鍵影響因素：MPP+的使用濃度為 0.75 mmol/L，注射用腦蛋白水解物的使用濃度為 60 μg/ml，作用時(shí)間為 48 h。按照上述條件，我們對(duì)不同廠家，不同批次的注射用腦蛋白水解物的活力進(jìn)行了測(cè)定。

圖 4 的結(jié)果說(shuō)明，MPP+損傷模型可用于評(píng)價(jià)不同廠家注射用腦蛋白水解物的活性。本次實(shí)驗(yàn)采用的是復(fù)蘇后傳至第 3 代的 PC12 細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)尚未到最佳狀態(tài)，但大多數(shù)廠家的注射用腦蛋白水解物對(duì) MPP+損傷 PC12 細(xì)胞的修復(fù)率都在 30% 以上，而復(fù)方氨基酸溶液則沒(méi)有修復(fù)作用。以后隨著 PC12 細(xì)胞狀態(tài)的回升，注射用腦蛋白水解物的修復(fù)率會(huì)進(jìn)一步上升。

修復(fù)率（%）Repair rate (%)806040200–20 腦蛋白水解物Cerebroprotein hydrolysate

Figure 4 Effect of cerebroprotein hydrolysate from different manufacturers against MPP+-induced reductions in PC12 cell viability

2.5 不同 PC12 細(xì)胞亞型對(duì)注射用腦蛋白水解物活力測(cè)定的影響

PC12 細(xì)胞除了低分化型外，還有懸浮型和高分化型兩種亞型。為了考察后兩種 PC12 細(xì)胞亞型是否適用于注射用腦蛋白水解物活力評(píng)價(jià)，我們進(jìn)行了注射用腦蛋白水解物對(duì)懸浮型和高分化型 PC12 細(xì)胞損傷修復(fù)作用的研究。

由圖 5 和圖 6結(jié)果可知，不同廠家腦蛋白水解物對(duì)懸浮型和高分化型的 PC12 細(xì)胞的修復(fù)率均不理想，因此不宜用于注射用腦蛋白水解物活力測(cè)定。

修復(fù)率（%）Repair rate (%)151050–5–10–15 腦蛋白水解物Cerebroprotein hydrolysate

Figure 5 Effect of cerebroprotein hydrolysate from different manufacturers against MPP+-induced reductions in floating PC12 cell viability

修復(fù)率（%）Repair rate (%)1050–5–10 腦蛋白水解物Cerebroprotein hydrolysate

Figure 6 Effect of cerebroprotein hydrolysate from different manufacturers against MPP+-induced reductions in highly differentiated PC12 cell viability

3 討論

腦蛋白水解物作為特異性氨基酸及小分子肽復(fù)合物，可以通過(guò)多種方式改善神經(jīng)元的代謝，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損害[8]。腦蛋白水解物可以穿透血腦屏障，促進(jìn)神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)呼吸鏈來(lái)抵抗細(xì)胞的氧化損傷，從而改善腦部細(xì)胞的代謝，起到治療神經(jīng)退行性疾病的作用[9]。

本研究中我們分別考察了注射用腦蛋白水解物活力測(cè)定方法中 MPP+的濃度、腦蛋白水解物的濃度以及作用時(shí)間等關(guān)鍵因素，確定了 MPP+損傷模型的具體條件為：PC12 細(xì)胞按 5000 個(gè)/孔接種至 96 孔板培養(yǎng) 24 h 后，加入 60 μg/ml 的注射用腦蛋白水解物作用 48 h，之后加入終濃度為 0.75 mmol/L 的 MPP+溶液，作用 24 h。同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，我們的研究結(jié)果表明，注射用腦蛋白水解物對(duì)低分化型 PC12 細(xì)胞的活力要明顯好于懸浮型或高分化型的 PC12 細(xì)胞，可能由于高分化型的 PC12 細(xì)胞對(duì)于 MPP+有著更高的敏感性，因此活力測(cè)定方法模型選用低分化型的 PC12 細(xì)胞。本方法選用的低分化型 PC12 細(xì)胞來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，為防止其向高分化型轉(zhuǎn)變，培養(yǎng)液中需加入 5% 的馬血清[10]。PC12 細(xì)胞的狀態(tài)仍是影響活力測(cè)定結(jié)果的主要因素之一。剛復(fù)蘇 2 代內(nèi)的 PC12 細(xì)胞不可用于活力測(cè)定，應(yīng)將細(xì)胞多傳代幾次，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后再進(jìn)行活力測(cè)定。同時(shí)每次實(shí)驗(yàn)時(shí)建議最好加入陽(yáng)性藥物（如施普善）作為對(duì)照，以增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[11]。

本研究建立的活力測(cè)定方法已經(jīng)被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采納[注射用腦蛋白水解物（I），標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)：WS1-XH-017-2016]。

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Effects of cerebroprotein hydrolysate injection on PC12 pheochromocytoma cells proliferation and MPP+induced damages

DOU Yue-ying, LIU Heng, ZHANG Na, LIU Lu, DENG Hong-bin

Gj

Objective To study the effects of cerebroprotein hydrolysate injection on the proliferation and MPP+induced damages in rat pheochromocytoma cells (PC12).Methods Cerebroprotein hydrolysate injection was used to protect PC12 cells from MPP+induced damages. The bioactivity of cerebroprotein hydrolysate injection on different PC12 cell subtypes was determined by MTT assay, and the ratio of absorbance denoted its rehabilitation rate. Results With cerebroprotein hydrolysate injection 48 hours pre-treatment, the survival rate of MPP+damaged PC12 cells was increased, and the optimal concentration was 60 μg/ml. Cerebroprotein hydrolysate injection reached better result for poorly differentiated PC12 cells.Conclusion Cerebroprotein hydrolysate injection protects against MPP+-induced reductions in PC12 cell viability and increased proliferation of PC12 cells. Our method has been adopted by Chinese Pharmacopoeia Commission (WS1-XH-017-2016).

PC12 cells; MPP+; MTT; Cerebroprotein hydrolysate for injection

DENG Hong-bin, Email: hdeng@imb.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.06.006

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新基金（2015-1007-23）

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所生化室（竇玥瑩、張娜、劉璐、鄧洪斌）；072656 保定，河北智同生物制藥有限公司（劉衡）

鄧洪斌，Email：hdeng@imb.pumc.edu.cn

2016-09-29

Author Affiliations: Department of Biochemistry, The Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (DOU Yue-ying, ZHANG Na, LIU Lu, DENG Hong-bin); Hebei Zhitong Pharmaceutical Group Co., Ltd., Baoding 072656, China (LIU Heng)