周嘉彬，呂鈺冰，韓澤平，何金花，黎毓光，朱劍霞

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生物信息學(xué)分析mircoRNA在乳腺癌中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

周嘉彬，呂鈺冰，韓澤平，何金花，黎毓光，朱劍霞

生物信息學(xué)是指綜合應(yīng)用信息科學(xué)、數(shù)學(xué)的理論、方法和技術(shù)來(lái)管理、分析和利用生物分子數(shù)據(jù)的一門科學(xué)?？茖W(xué)地利用生物分子數(shù)據(jù)及其分析結(jié)果，可以大大提高研究和開(kāi)發(fā)的科學(xué)性及效率[1]。miRNA（mircoRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度為 20 ~ 24 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子 RNA。miRNA 能夠與靶信使 RNAs（mRNAs）3'-端非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，阻礙 mRNA 翻譯或使其穩(wěn)定性降低而被降解，從而參與到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[2]。近年許多研究表明，miRNA 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[3-4]。乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是發(fā)達(dá)國(guó)家中引起女性死亡的第二大癌癥（在發(fā)展中國(guó)家位居第一）[5]。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，多種 miRNAs 在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤的治療過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[6-8]。因此，探討 miRNA 在乳腺癌細(xì)胞中的分子調(diào)控機(jī)制，能夠?yàn)榭拱┎呗蕴峁┬碌乃悸贰?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

目前生物學(xué)信息軟件分為單機(jī)分析軟件、在線分析軟件和生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，利用生物信息學(xué)軟件能夠提示、指導(dǎo)、替代實(shí)驗(yàn)操作，利用對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析所得的結(jié)論設(shè)計(jì)下一階段的實(shí)驗(yàn)，本次論文所用到的生物學(xué)信息軟件如下：

①人類 miRNA 疾病數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDD v2.0，http://www. cuilab.cn/hmdd）

②miRwalk 2.0（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/ zmf/mirwalk2/）

③PubMed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）

④lncRNA 疾病數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.cuilab.cn/ lncrnadisease）

⑤starBase v2.0（http://starbase.sysu.edu.cn/）

⑥TransmiR（http://www.cuilab.cn/transmir）

⑦Cytoscape 軟件

1.2 方法

1.2.1 通過(guò) HMDD v2.0 查詢已證實(shí)與乳腺癌相關(guān)的 miRNAs，并將所有 miRNAs 進(jìn)行匯總，篩選出有 14 篇或以上文獻(xiàn)報(bào)道與乳腺癌相關(guān)的 miRNAs 作為研究對(duì)象。

1.2.2 運(yùn)用 miRwalk 2.0 在線軟件對(duì)上述 miRNAs 進(jìn)行分析研究，篩選出各個(gè) miRNAs 的共同的靶基因。

1.2.3 運(yùn)用 PubMed 搜索上述靶基因與乳腺癌之間關(guān)系的論文，并篩選出與乳腺癌密切相關(guān)的 miRNA 的靶基因。

1.2.4 通過(guò) lncRNA 疾病數(shù)據(jù)庫(kù)查詢與乳腺癌相關(guān)的 lncRNAs（long noncoding RNAs），并運(yùn)用 starBase v2.0 對(duì)所得到的 miRNAs 和 lncRNAs 進(jìn)行綜合分析，得到與上述 miRNAs 相互作用的且與乳腺癌相關(guān)的 lncRNAs。

1.2.5 運(yùn)用 TransmiR 在線軟件查詢上述 miRNAs 的轉(zhuǎn)錄因子并進(jìn)行分析研究，篩選出 miRNAs 共同的轉(zhuǎn)錄因子，并通過(guò) PubMed 查詢所得轉(zhuǎn)錄因子與乳腺癌的關(guān)系，篩選出與乳腺癌相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。

1.2.6 運(yùn)用 Cytoscape 軟件繪制出 miRNA 在乳腺癌中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 與乳腺癌相關(guān)的 miRNAs

通過(guò) HMDD v2.0 查詢已證實(shí)與乳腺癌相關(guān)的 miRNAs共 243 個(gè)，其中有 14 篇或以上文獻(xiàn)報(bào)道的 miRNA 有 hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和 hsa-mir-21。其中 hsa-mir-155、hsa-mir-21 在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到促進(jìn)作用[9-10]，而 hsa-mir-200b、hsa-mir-200c[11-12]起到抑制作用（表 1）。

表 1 HMDD v2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)中與乳腺癌相關(guān)的 miRNAs

2.2 與乳腺癌密切相關(guān)的 miRNA 的靶基因

運(yùn)用 miRwalk 2.0 分析上述 4 個(gè) miRNAs 的靶基因，其中 hsa-mir-155 共有 932 個(gè)靶基因，hsa-mir-200b 共有 202 個(gè)靶基因，hsa-mir-200c 共有 212 個(gè)靶基因，hsa-mir-21 共有 634 個(gè)靶基因。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn) SP1（Sp1 transcription factors）、SUZ12（suppressor of zeste 12 homolog）和 KLHL42（kelch like family member 42）為 hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和 hsa-mir-21 共同的靶基因。通過(guò) PubMed 查詢上述三個(gè)靶基因與乳腺癌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng) SP1[13-15]和SUZ12[16-18]表達(dá)缺失時(shí)可抑制乳腺癌的生長(zhǎng)（表 2），然而未找到 KLHL42 與乳腺癌的相關(guān)報(bào)道。

表 2 與乳腺癌密切相關(guān)的 miRNA 的靶基因

注：*表達(dá)缺失時(shí)可抑制乳腺癌生長(zhǎng)。

2.3 與 miRNA 相互作用的乳腺癌相關(guān)的 lncRNA

通過(guò) lncRNA 疾病數(shù)據(jù)庫(kù)查詢與乳腺癌相關(guān)的 lncRNAs 有 17 個(gè)，運(yùn)用 starBase v2.0 對(duì)所得到的 miRNAs 和 lncRNAs 進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn) lncRNA XIST（X inactive-specific transcript）與 hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和hsa-mir-21 相互作用（圖1）。其中XIST 在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到促進(jìn)作用[19]。

圖 1 與 miRNA 相互作用的乳腺癌相關(guān)的 lncRNA

2.4 與乳腺癌密切相關(guān)的 miRNA 轉(zhuǎn)錄因子

運(yùn)用 TransmiR 查詢上述 miRNAs 的轉(zhuǎn)錄因子，其中 hsa-mir-155 有 16 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，hsa-mir-200b 有 13 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，hsa-mir-200c 有 14 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，hsa-mir-21 有 16 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。然而只有 TGFB1（transforming growth factor beta 1）是 hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和 hsa-mir-21 唯一共同轉(zhuǎn)錄因子（圖 2）。通過(guò) PubMed 查詢發(fā)現(xiàn)，TGFB1 在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到促進(jìn)作用[20-21]。

2.5 運(yùn)用 Cytoscape 軟件繪制出 miRNA 在乳腺癌中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

從上述結(jié)果可知，hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和 hsa-mir-21 這四個(gè) miRNAs 可與其下游靶基因 KLHL42、SP1 和 SUZ12 的 mRNA 的 3'-UTR 配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控其表達(dá)。其中 SP1 和SUZ12 與乳腺癌的密切相關(guān)。而進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，hsa-mir-155、hsa-mir-200b、hsa-mir-200c 和 hsa-mir-21 亦受其上游的轉(zhuǎn)錄因子 TGFB1 調(diào)控，并且能夠與 lncRNA XIST 相互作用，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。如此所有的相關(guān)基因構(gòu)成了一個(gè) miRNA 在乳腺癌中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖 3）。

圖 2 與乳腺癌密切相關(guān)的 miRNA 的轉(zhuǎn)錄因子

3 討論

miRNA 是一類進(jìn)化上保守的，具有強(qiáng)大調(diào)控作用，與高等植物、動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)密切相關(guān)的單鏈非編碼小 RNA。Lee 等[22]在線蟲發(fā)育時(shí)鑒定了第一個(gè) miRNA lin-4，隨后許多生物學(xué)家開(kāi)始重新思考細(xì)胞遺傳調(diào)控方面的重要問(wèn)題。由于 miRNA 序列、結(jié)構(gòu)、豐度和表達(dá)方式具有多樣性，使其有成為 mRNA 編碼蛋白質(zhì)強(qiáng)有力調(diào)節(jié)子的可能，因此 miRNA 的出現(xiàn)豐富了人們對(duì)蛋白質(zhì)合成調(diào)控的認(rèn)識(shí)。隨著 miRNA 分析技術(shù)的不斷成熟，許多 miRNAs的作用已被人所了解。目前認(rèn)為 miRNA 是通過(guò)蛋白翻譯水平的調(diào)控影響基因的表達(dá)，從而參與到造血、發(fā)育、病毒防御、器官形成、細(xì)胞增殖和凋亡等調(diào)節(jié)途徑中。許多研究表明，miRNA 在糖尿病[23]、心血管疾病[24]、腫瘤[25]等眾多疾病中發(fā)揮著重要的作用。目前的研究主要致力于探索miRNA 在腫瘤治療中的作用[26]，以及如何通過(guò)抑制或促進(jìn) miRNAs 的表達(dá)來(lái)控制腫瘤細(xì)胞的增殖[27]。

乳腺癌的發(fā)生是一個(gè)多因素參與的多階段性過(guò)程，該病的具體病因及發(fā)病機(jī)制目前仍未明確。筆者通過(guò) HMDD v2.0 查詢發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)站到 2014 年 6 月份為止一共收錄了與乳腺癌相關(guān)的 miRNAs 243 個(gè)，探討 miRNAs 與乳腺癌關(guān)系的論文一共有 319 篇。其中各種 miRNAs 在乳腺癌中的作用機(jī)制各有所異，并通過(guò)各種途徑促進(jìn)或抑制乳腺癌的發(fā)展?；谳^多人認(rèn)可的乳腺癌相關(guān)的 miRNA 的基礎(chǔ)上，本文利用生物信息學(xué)分析技術(shù)進(jìn)行綜合分析，得出了一條與乳腺癌相關(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但該分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可信度仍有賴于日后實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在該網(wǎng)絡(luò)中 SP1 和 SUZ12 在接受上游信號(hào)后是如何促進(jìn)或抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的，具體的分子調(diào)控機(jī)制有待日后實(shí)驗(yàn)解決。

此乳腺癌的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，hsa-mir-155 和 hsa-mir-21可通過(guò)抑制下游基因的表達(dá)從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖和提高乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力[9-10]，但未有文獻(xiàn)報(bào)道在乳腺癌中 hsa-mir-155 和 hsa-mir-21 是如何調(diào)控 SP1 和 SUZ12 基因的表達(dá)。研究表明，hsa-mir-200b 和 hsa-mir-200c 可作用于 SP1 和 SUZ12 mRNA 的3'-UTR 從而抑制 SP1 和 SUZ12 的表達(dá)，SP1 和 SUZ12 的表達(dá)降低可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[13, 17]。TGFB1 表達(dá)增高可提高乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，降低乳腺癌患者的 5 年生存率[21]。Neilsen 等[28]發(fā)現(xiàn)在 p53 變異的乳腺癌細(xì)胞中，鋅指蛋白652 可直接抑制 hsa-mir-155 的轉(zhuǎn)錄因子 TGFB1、TGFB2 等的表達(dá)，從而降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。Yu 等[29]的研究中發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中 TGFB1 可誘導(dǎo) hsa-mir-21 與 MSH2（mutS homolog 2）結(jié)合而抑制其表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Xu 等[30]將乳腺癌細(xì)胞與間質(zhì)干細(xì)胞混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn) TGFB1 可作用于 hsa-mir-200b 和 hsa-mir-200c 從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換。XIST 是乳腺癌治療預(yù)后的生物標(biāo)志，當(dāng) XIST 高表達(dá)時(shí)乳腺癌的化療效果差，同時(shí)影響乳腺癌患者的生存率[19]。然而 XIST 與 miRNA 相互作用的機(jī)制有待日后實(shí)驗(yàn)探討。

我們不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng) TGFB1、XIST、hsa-mir-155、hsa-mir-21、SP1 和 SUZ12 表達(dá)活躍時(shí)能促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生，而 hsa-mir-200b 和 hsa-mir-200c 表達(dá)活躍時(shí)能抑制乳腺癌的發(fā)生。因此，在今后的工作中如何利用藥物提高 hsa-mir-200b 和 hsa-mir-200c 的表達(dá)，以及降低 TGFB1、XIST、hsa-mir-155、hsa-mir-21、SP1 和 SUZ12 的表達(dá)可能成為以后治療乳腺癌的重要研究方向。

綜上所述，生物學(xué)信息分析技術(shù)是我們探討 miRNA通過(guò)何種途徑在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起調(diào)控作用必不可少的技術(shù)。生物學(xué)信息分析和實(shí)驗(yàn)論證相結(jié)合能使我們更高效地研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)靶基因治療提供更多的依據(jù)和可能。

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廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院青年基金（2014-Q-03、2014-Q-05）；廣東省建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省項(xiàng)目（20141230）；廣州市番禺區(qū)科技和信息化局項(xiàng)目（2014-Z03-65）

511400 廣東省廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科

韓澤平，Email：hanzeping1987@126.com

2016-09-12

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2016.06.014