孫捷 賀楚峰 牛志杰 文杰 馮永 陳紅勝

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)（長沙41000）

2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)（烏魯木齊83000）

·臨床研究·

一噪聲相關(guān)常染色體顯性遺傳耳聾家系遺傳性分析

孫捷1，2賀楚峰1牛志杰1文杰1馮永1陳紅勝1

1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)（長沙41000）

2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)（烏魯木齊83000）

目的 分析一個(gè)與噪聲接觸相關(guān)的常染色體顯性遺傳性耳聾家系的聽力學(xué)及遺傳學(xué)特征，制定致聾基因鑒定策略。方法對該常染色體顯性遺傳性耳聾家系進(jìn)行問卷調(diào)查，聽力學(xué)檢測及全身體查，繪制該耳聾家系的遺傳圖譜，分析其聽力學(xué)及遺傳學(xué)特點(diǎn)。應(yīng)用Sanger測序技術(shù)進(jìn)行候選基因鑒定。結(jié)果該家系共5代，進(jìn)行聽力學(xué)檢測者為13人，聽力下降者6人，其中3人有明顯的噪聲接觸史。聽力學(xué)表現(xiàn)為雙側(cè)遲發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾，先以高頻聽力損失為主，隨后逐漸加重累及全頻聽力下降，聽力開始下降年齡在16-37歲之間。起病后3年癥狀明顯加重。應(yīng)用Sanger測序技術(shù)進(jìn)行候選基因鑒定，未發(fā)現(xiàn)致聾突變位點(diǎn)。結(jié)論 這個(gè)家系成員為高頻聽力下降為主的遲發(fā)性感音神經(jīng)性耳聾，符合常染色體顯性遺傳非綜合征型耳聾特點(diǎn)，且懷疑有噪聲易感因素。計(jì)劃下一步通過對家系的表型分析運(yùn)用新一代測序技術(shù)希望鑒定出該家系的致聾基因。

常染色體顯性遺傳；遺傳性耳聾；表型；二代測序

We thank the patientsand the other participants who took part in this study for their collaboration.This work was supported by the National Nature Science Foundation of China(Grant No.81170923,81470705,81300833,81500803).

The authors declare that we have no competing interests.

耳聾作為一種常見的致殘性疾病，越來越多的引起社會(huì)的關(guān)注，是全球面臨的重大公共衛(wèi)生問題。在引起耳聾的眾多原因中，遺傳因素占據(jù)了主導(dǎo)地位[1-2]，有近60%的耳聾患者有遺傳背景，即遺傳性耳聾（hereditary hearing loss，HHL），而其中68%的患者一出生就有聽力損失，55%的患者從幼年時(shí)開始慢慢表現(xiàn)出聽力下降直至全聾。在美國，每年新生兒確診為遺傳性耳聾的就可達(dá)1.9‰[3]。遺傳性耳聾依據(jù)是否伴有全身其他組織疾病分為非綜合征性耳聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL）和綜合征性耳聾（syndromic hearing loss，SHL），所占比例分別是70%和30%。目前克隆出了有關(guān)NSHL的基因有92個(gè)，其中與語后聾相關(guān)的有28個(gè)。

本課題小組在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉科頭頸外科門診接診了一個(gè)來自湖南省張家界市的非綜合征性語后聾家系，并分析了該家系內(nèi)成員的聽力表型及遺傳學(xué)表型特征，應(yīng)用當(dāng)前的測序技術(shù)，制定出后續(xù)的基因篩查策略。

1 資料與方法

1.1 家系資料

本研究的家系信息調(diào)查取樣工作在事先取得了湘雅醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理認(rèn)證及認(rèn)可后，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)耳科組成員完成。該家系位于湖南省，命名為HN-HL03。2015年11月，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)耳組成員到當(dāng)?shù)貙Υ思蚁党蓡T的疾病發(fā)展情況進(jìn)行了調(diào)查。本次調(diào)查取樣原則上盡可能收集所有在世家系成員，包括正常人和耳聾患者,以便對照研究。無論有無聽力下降主訴，均進(jìn)行聽力測試以獲得準(zhǔn)確的聽力學(xué)資料。調(diào)查過程中簽署耳聾基因篩查知情同意書，填寫問卷調(diào)查，有一名教授負(fù)責(zé)全身體格檢查及詳細(xì)的耳科專科檢查，一名副教授進(jìn)行聽力學(xué)檢測，保證數(shù)據(jù)可靠、準(zhǔn)確。采取每一位參與調(diào)查者外周血3-8ml，冰盒保存。于第二日統(tǒng)一送中南大學(xué)國家遺傳實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行外周血DNA提取，并-20°保存，同時(shí)運(yùn)用淋巴母細(xì)胞法建株，收集家系成員細(xì)胞并永久保存，日后可以復(fù)蘇解凍細(xì)胞，反復(fù)提取DNA。

1.2 表型判斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)聽力損失性質(zhì)分為感音神經(jīng)性耳聾、傳導(dǎo)性耳聾及混合性耳聾，依據(jù)發(fā)病時(shí)間出生前后分為先天性聾和后天性聾，又以語言功能發(fā)育程度劃分為語前聾和語后聾。按NIH＆WHO（2000）標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)聽力損失的頻率將耳聾表型分為：高頻聽力損失型（2－8kHz聽力下降為主），低頻聽力損失型（0.25－1.00kHz聽力下降為主），中頻聽力損失型（0.25－2.00kHz聽力下降為主），全頻聽力損失型（0.25－4.00kHz聽力下降）。聽力損失的評定：以相對好耳0.5、1.0、2.0、4.0Hz頻率的氣導(dǎo)平均值為基準(zhǔn)評定聽力損失的程度：20－40dBHL為輕度聽力損失，＞40－70dBHL為中度聽力損失，＞70-95dBHL重度聽力損失，＞95dBHL為極重度聽力損失。詳細(xì)詢問病史、聽力學(xué)檢查進(jìn)行聽力損失分型有助于判斷不同表型的耳聾類別，進(jìn)一步指導(dǎo)相應(yīng)的遺傳學(xué)檢測工作。

1.3 聽力學(xué)檢測

應(yīng)用Madsen 502便攜式聽力計(jì)（丹麥）及EAR-3A插入式耳機(jī)（美國）對家系成員進(jìn)行純音測聽檢查（檢測環(huán)境盡量做到密閉、安靜），初步了解該家系聽力情況及病變性質(zhì)。

1.4 耳聾基因芯片測試結(jié)果

運(yùn)用中南大學(xué)湘雅醫(yī)院研制開發(fā)的耳聾基因芯片檢測 3個(gè)基因 8個(gè)位點(diǎn)（GJB2 c.235delC、c.299-300delAT、c.176del16bp、c.35delG、SLC26A4基因的IVS7-2A＞G、2168A＞G、線粒體、12SrRNA基因1555A＞G、1494C＞T）。

1.5 應(yīng)用Sanger測序技術(shù)在候選基因中進(jìn)行致聾基因突變位點(diǎn)鑒定

通過對家系病人臨床聽力學(xué)特征分析考慮為語后高頻下降為主的常染色體顯性遺傳，依據(jù)本家系耳聾臨床特征，在已知常染色體顯性遺傳耳聾基因（http://hereditaryhearingloss.org/）中篩選有與本家系耳聾特征相似報(bào)道的基因作為候選基因篩選候選基因?yàn)椋珼FNA3A(GJB2)是我國常見耳聾致病基因、DF?NA2B（GJB3）、DFNA9（COCH）都有過常染色體顯性語后聾案例報(bào)道，且也表現(xiàn)為高頻下降為主，呈進(jìn)行性加重表現(xiàn)[4]。

2 結(jié)果

2.1 家系基本資料

HN-HL03家系遺傳圖譜（見圖1），本研究家系現(xiàn)存成員5代32人，年齡最長者63歲，最小者4歲。其中有耳聾病史者9人；能調(diào)查到的有13人，除離世1人，失聯(lián)2人，確定患有感音神經(jīng)性耳聾者6人。接受聽力檢測者13人，平均年齡43.6歲，其中女性5例，男性8例。先證者（IVⅢ：4）為女性，37歲，全頻聽力下降，高頻為主，陡降型，伴有間斷高調(diào)蟬鳴樣耳鳴3年，無眩暈發(fā)作。所有受檢者均無眩暈病史、外傷史及耳毒性藥物接觸史，全身系統(tǒng)檢查未見其他明顯異常，3例伴有不同程度、不同性質(zhì)耳鳴。6例耳聾患者均明確記得出現(xiàn)耳聾的年齡，而且是聽力下降癥狀早于耳鳴癥狀出現(xiàn)。起病年齡16-37歲不等，呈現(xiàn)逐漸加重趨勢。值得注意的是：6例耳聾患者中有3例有明顯噪聲接觸史，ⅢⅡ：5，有兩年炮兵經(jīng)歷史經(jīng)歷，當(dāng)兵前聽力基本正常（19歲參軍，25歲發(fā)?。颍?長期在戲院工作至今（23歲入職，28歲發(fā)?。螅?在電廠車間工作（28歲入職，30歲發(fā)病），機(jī)器轟鳴聲較大，說話需大聲呼喊。

圖1 HN-HL03家系遺傳圖譜Fig.1 Pedigree of family HN-HL03

2.2 家系聽力學(xué)特征及遺傳學(xué)特點(diǎn)

本家系能追溯到的僅有5代成員，因Ⅰ代成員去世或失去聯(lián)系多年，所以無法考證上一輩家人聽力情況，第ⅡⅠ代有3名女性成員發(fā)病，第ⅢⅡ代6名成員中有4名發(fā)病，其中3男1女；第IVⅢ代8名成員中現(xiàn)已有兩名30歲以上成員發(fā)病，其余年齡低于30歲。（見表1）

家系成員中連續(xù)3代均有發(fā)病，起病年齡16-37歲不等，但6例患者均能準(zhǔn)確地回憶出聽力開始下降的年齡，隨后病例呈現(xiàn)逐漸加重趨勢。發(fā)病時(shí)間3年以內(nèi)的，聽力檢測表現(xiàn)為高頻陡降型，伴有低頻緩降。IVⅢ：4是先證者，以發(fā)現(xiàn)聽力下降3年伴有耳鳴為主訴就診，其聽力言語辨別能力明顯下降，伴有間歇性高調(diào)蟬鳴。家系譜圖中最初患者為女性，結(jié)過兩次婚，與前夫后裔這里標(biāo)記為A支家系，第二代只育有一名男性（ⅢⅡ：1）為所有后裔中年長者，至今聽力正常，第IV三代兩名男性，聽力未見異常。而二婚后代標(biāo)記為B支家系，第Ⅲ二代有五個(gè)子女（三男兩女），4個(gè)患?。ㄈ幸慌?，患病率達(dá)80%，第IV三代子女有6人，三男三女，現(xiàn)有兩名年齡超過30者出現(xiàn)聽力下降癥狀，發(fā)病率33.3%，其余年齡低于30歲，未出現(xiàn)聽力異常情況。該家系每一代都有耳聾患者，男女各有患病，發(fā)病年齡在16-37歲之間，有延后趨勢。

此家系遺傳特點(diǎn)如下：⑴連續(xù)三代發(fā)??；⑵男女均有發(fā)?。虎钦Z后聾；⑷遲發(fā)性耳聾（16歲以后發(fā)病）；⑸聽力下降最初以高頻下降為主，最終發(fā)展為全頻損失；⑹呈逐漸下降趨勢；（7）6例耳聾患者中有3例有明顯噪聲接觸史；是典型的常染色體顯性遺傳的非綜合征性語后聾家系，高度懷疑與噪聲有關(guān)。

2.3 耳聾基因芯片檢測結(jié)果

3個(gè)基因8個(gè)位點(diǎn)（GJB2 c.235delC、299-300de?lAT、176del16bp、35delG、SLC26A4基因的IVS7-2A＞G、2168A＞G、線粒體12SrRNA基因1555A＞G、1494C＞GT）的檢測為陰性，除外以上基因位點(diǎn)致聾可能。

2.4 應(yīng)用Sanger測序技術(shù)在候選基因中進(jìn)行致聾基因突變位點(diǎn)鑒定

選取了最常見的顯性遺傳基因COCH,GJB3和GJB2基因?qū)ο茸C者IVⅢ：4進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切純化、測序分析，沒有發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。

圖2 HN-HL03家部分成員系聽力圖Fig.2 audiogram of HN-HL03

3 討論

針對本研究報(bào)道的家系，具有典型的常染色體顯性遺傳的非綜合征性語后聾遺傳學(xué)特征，臨床聽力學(xué)表現(xiàn)為雙耳對稱性、語后進(jìn)行性感音神經(jīng)性耳聾，發(fā)病年齡16-37歲之間，始發(fā)以高頻聽力減退為主，3年后逐漸發(fā)展為全頻聽力損失，嚴(yán)重的呈孤島型聽力曲線，可伴有高調(diào)耳鳴，無前庭功能障礙。三例患者有明確的長期噪聲接觸史，且分析噪聲強(qiáng)度達(dá)80分貝這里高度懷疑是因噪聲環(huán)境因素誘發(fā)相關(guān)的遺傳性耳聾。

目前國內(nèi)大規(guī)模聾病基因篩查已經(jīng)得到大量熱點(diǎn)突變數(shù)據(jù)，本文針對GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA 3個(gè)常見耳聾基因的8個(gè)熱點(diǎn)（235delC、299-300delAT、176del16bp、35delG、IVS7-2A＞G、2168A＞G、12SrRNA基因1555A＞G、1494C＞T）檢測均為陰性，常見常染色體顯性遺傳耳聾基因GJB2、GJB3、COCH外顯子測序檢測未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)[5-6]?；蛐酒Y查受限于分子雜交的局限性，近期目標(biāo)區(qū)域富集結(jié)合二代測序新技術(shù)的出現(xiàn)[7-8]，給基因診斷甚至未知基因的鑒定帶來了新機(jī)遇，可以實(shí)現(xiàn)覆蓋了所有已知耳聾基因的完整分析[9-10]，應(yīng)用目標(biāo)序列捕獲二代測序技術(shù)全面、高效的排除已知耳聾基因的診斷后，再補(bǔ)充連鎖分析結(jié)合全外顯子組測序，可以鑒定克隆出耳聾家系致病基因[11]。因此本家系研究下一步將先選取兩名血緣關(guān)系較遠(yuǎn)的患者DNA模板和一位關(guān)系較近的正常者DNA模板進(jìn)行全基因組測序，依據(jù)結(jié)果分析候選致病基因，然后進(jìn)行家系所有成員的候選基因篩查，確定候選基因與耳聾在家系中共分離，最終確定耳聾致病基因。

表1 HN-HL03家系聽力損失特點(diǎn)Table 1 Family Characteristics of Hearing Loss

表2 COCH基因編碼區(qū)突變檢測引物一覽表Table 2 primer List of COCH gene

表3 GJB2基因編碼區(qū)突變檢測引物一覽表Table 3 primer of GJB2

表4 GJB3基因編碼區(qū)突變檢測引物一覽表Table 4 primer of GJB3

1] C.C.Morton,Genetics,genomics and gene discovery in the auditory system,Hum Mol Genet,2002,11(10):1229-1240.

2 T.B.Friedman,A.J.Griffith,Human nonsyndromic sensorineural deafness,Annual review of genomics and human genetics,2003,4（4）:341-402.

3 C.C.Morton,W.E.Nance,Newborn hearing screening--a silent rev?olution,The New England journal of medicine,2006,354(20): 2151-2164.

4 J.Cheng,X.Zhou,Y.Lu,J.Chen,B.Han,Y.Zhu,L.Liu,K.W. Choy,D.Han,P.C.Sham,M.Q.Zhang,X.Zhang,H.Yuan,Exome sequencing identifies a novel frameshift mutation of MYO6 as the cause of autosomal dominant nonsyndromic hearing loss in a Chi?nese family,Annals of human genetics,2014,78(6):410-423.

5 張秀菊,程靜,盧宇,王燕,張蕾,袁慧軍,韓東一,一個(gè)常染色體顯性遺傳非綜合征型聾家系分析,中華耳科學(xué)雜志,2014,12(1): 61-67. Zhangxiu Ju,Cheng Jing,Lu Yu,Wang Yan,Zhang Lei,Yuan Hui?jun,a Han Dong,an autosomal dominant non-syndromic deaf pedi?gree analysis,Chinese Journal of Otology,2014,12(1):61-67.

6 馮永，賀楚峰，肖健云；方儉生；趙素萍；田湘娥；梅凌云；夏昆；湯熙翔，一個(gè)遺傳性耳聾大家系的基因突變檢測，臨床耳鼻咽喉科雜志，2002,16(7):61-67. Y.Feng,C.He,J.Xiao,J.Fang,S.Zhao,X.Tian,L.Mei,K.Xia,X. Tang,[An analysis of a large hereditary postlingually deaf families and detecting mutation of the deafness genes],Lin chuang er bi yan hou ke za zhi=Journal of clinical otorhinolaryngology,2002,16(7): 61-67.

7 T.Walsh,H.Shahin,T.Elkan-Miller,M.K.Lee,A.M.Thornton,W. Roeb,A.Abu Rayyan,S.Loulus,K.B.Avraham,M.C.King,M. Kanaan,Whole exome sequencing and homozygosity mapping identi?fy mutation in the cell polarity protein GPSM2 as the cause of non?syndromic hearing loss DFNB82,American journal of human genet?ics,2010,87(1)90-94.

8 S.B.Ng,K.J.Buckingham,C.Lee,A.W.Bigham,H.K.Tabor,K.M. Dent,C.D.Huff,P.T.Shannon,E.W.Jabs,D.A.Nickerson,J.Shen?dure,M.J.Bamshad,Exome sequencing identifies the cause of a mendelian disorder,Nature genetics,2010,42(1):30-35.

9 P.Kothiyal,S.Cox,J.Ebert,A.Husami,M.A.Kenna,J.H.Grein?wald,B.J.Aronow,H.L.Rehm,High-throughput detection of muta?tions responsible for childhood hearing loss using resequencing mi?croarrays,BMC biotechnology,2010,10（1）:10-21.

10 A.E.Shearer,M.S.Hildebrand,C.M.Sloan,R.J.Smith,Deafness in the genomics era,Hearing research,2011,282(11):1-9.

11 T.Yang,X.Wei,Y.Chai,L.Li,H.Wu,Genetic etiology study of the non-syndromic deafness in Chinese Hans by targeted next-genera?tion sequencing,Orphanet journal of rare diseases,2013,8(1):1-8.

Audiologic and genetic features of a Chinese family with nonsydromic autosomal dominant hearing loss associated with noise exposure

SUN Jie1,2,HE Chufeng1,NIU Zhijie1,WEN Jie1,FENG Yong1,CHEN Hongsheng1
1 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Xiangya Hospital,Central south University, Changsha,410008,China
2.Department of Otorhinolaryngology,First Affilicated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi,830011,China

Objective To report audiologic and genetic features of a Chinese family with nonsydromic autosomal dominant hearing loss associated with noise exposure and establish the identification strategy of induced deafness.Method A pedigree with autosomal-dominant inherited postlingual progressive bilateral sensorineural hearing loss was investigated.Medical and detailed audiological examination were completed in all study participants.Candidate genes were tested by Sanger sequencing.Results Thirteen members of the family participated in this study,and 6 showed hearing impairment,which mainly affected high frequencies initially,with lower frequencies becoming involved with increasing age,gradually progressing to all frequency hearing loss.The age of onset varied from 16 to 37 years.Candidate genes were preliminary excluded by Sanger sequencing.Conclusion Pedigree analysis suggests an autosomal dominant inheritance pattern in this family.

autosomal-dominant;hearing loss;hereditary;NGS

R764.43

A

1672-2922（2016）04-535-5

2016-1-18審核人：翟所強(qiáng)）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.04.021

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Grant No.81170923，81470705，81300833）國家青年科學(xué)基金81500803

孫捷，博士，職稱:副主任醫(yī)師，研究方向:遺傳性聾為主的耳科學(xué)基礎(chǔ)與臨床研究

馮永，Email:fengyong_hn@hotmail.com