饒秀麗 尹時華 侯濤 朱子昂 龍吉

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧530021)

·基礎(chǔ)研究·

反復(fù)發(fā)作性眩暈豚鼠前庭內(nèi)側(cè)核毒蕈堿受體M2、M3表達(dá)的研究

饒秀麗 尹時華 侯濤 朱子昂 龍吉

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(南寧530021)

目的 制造豚鼠迷路瘺管導(dǎo)致的反復(fù)發(fā)作的眩暈?zāi)Ｐ?，觀察不同時程豚鼠前庭內(nèi)側(cè)核（MVN）毒蕈堿受體M2、M3亞型的表達(dá)變化。以探討前庭代償?shù)目赡軝C(jī)制。方法選擇成年實(shí)驗(yàn)用豚鼠88只，并隨機(jī)分配為A組（假手術(shù)組，8只）、B組（單側(cè)迷路損毀組，40只）、C組（迷路瘺管+耳鏡鼓氣組，40只）。B、C組手術(shù)后，依據(jù)豚鼠所需不同存活時間（術(shù)后1天、3天、1周、2周、3周）隨機(jī)選取8只，A組作為對照組存活3周。所有豚鼠灌流后取腦干，用免疫組織化學(xué)染色，觀察前庭內(nèi)側(cè)核毒蕈堿受體M2、M3亞型的表達(dá)變化，并與假手術(shù)組比較。結(jié)果B、C組術(shù)后均可導(dǎo)致雙側(cè)MVN區(qū)毒蕈堿受體M2、M3亞型表達(dá)減少，術(shù)后1天表達(dá)最少，術(shù)后3天至術(shù)后7天表達(dá)有逐漸增加趨勢，術(shù)后7天時B組和假手術(shù)組比較表達(dá)無差異，而C組和假手術(shù)組比較表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。直到術(shù)后2周，C組和假手術(shù)組比較表達(dá)無差異。B、C組術(shù)后各時期（術(shù)后2周前）相比，C組的表達(dá)弱于B組。各組對側(cè)的變化趨勢和術(shù)側(cè)相同。結(jié)論1.豚鼠MVN存在毒蕈堿受體M2、M3亞型，且M3受體的表達(dá)可能不及M2受體的豐富。它們可能在前庭代償?shù)脑缙诖龠M(jìn)了前庭代償?shù)恼＿M(jìn)行。2.前庭代償除膽堿能系統(tǒng)參與外，可能還涉及到其他神經(jīng)遞質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)的參與。3.進(jìn)一步證明迷路瘺管導(dǎo)致的反復(fù)發(fā)作性眩暈?zāi)Ｐ偷脑炷Ｊ浅晒Φ摹?/p>

反復(fù)發(fā)作性眩暈；迷路瘺管；前庭代償；前庭內(nèi)側(cè)核；毒蕈堿受體；豚鼠

Fund Project：Natural Science Foundation of Guangxi（the number of fund commitments：2015GXNSFAA414004）;Natural Science Foundation of Guangxi（the number of fund commitments：2016GXNSFAA380150）.

The fund does not have any conflicts of interest

眩暈是臨床的常見病癥，涉及臨床多學(xué)科[1]，外周前庭病變所引發(fā)的大部分眩暈患者可通過藥物、物理治療或手術(shù)得到康復(fù)。但是部分外周前庭病變所引發(fā)的眩暈患者反復(fù)發(fā)作呈現(xiàn)慢性過程，且不能通過藥物、物理或手術(shù)治療使其康復(fù)，給患者的生活和工作帶來極大的困擾，同時也使患者出現(xiàn)焦慮、抑郁。因此反復(fù)發(fā)作性眩暈是臨床一大難以解決的問題之一，中樞前庭代償是這部分患者癥狀得到緩解和疾病最終得以康復(fù)的重要途徑，但這種代償?shù)闹袠袡C(jī)制不清。一側(cè)外周前庭部分或完全受損會使受損側(cè)前庭輸入下降或缺失并引起靜態(tài)癥狀和動態(tài)癥狀。靜態(tài)癥狀包括為自發(fā)性眼震，受損側(cè)頭位偏斜和，動態(tài)癥狀則依賴于評價前庭功能時的刺激，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重組下,癥狀逐漸減輕直至消失，前庭功能全部或部分恢復(fù),這一過程稱為前庭代償。本實(shí)驗(yàn)通過制造迷路瘺管，使動物出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的眩暈，通過觀察反復(fù)發(fā)作性眩暈豚鼠前庭內(nèi)側(cè)核(me?dial vestibular nucleus，MVN)中毒蕈堿受體M2、M3亞型的表達(dá)變化，探討前庭代償?shù)目赡軝C(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)相關(guān)準(zhǔn)備

選擇健康成年實(shí)驗(yàn)用豚鼠(250～300g)88只，雌雄不限。電耳鏡檢查外耳道通暢、鼓膜標(biāo)志清晰、中耳無感染、耳廓反射正常，無自發(fā)性眼震。豚鼠隨機(jī)分為三組，即A組為假手術(shù)組（8只）、B組單側(cè)迷路損毀組（40只），C組為迷路瘺管+耳鏡鼓氣組（40只），動物由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。免疫組化試劑盒(聚合物輔助試劑1、二氨基聯(lián)苯胺( DAB)顯色劑、山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶標(biāo)記物)由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，抗M2受體抗體和抗M3受體抗體由美國Abnova公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模

三組豚鼠均以左耳為手術(shù)耳，均以1%戊巴比妥鈉(4ml/kg)腹腔注射麻醉，均剪毛后固定于自制豚鼠手術(shù)操作臺，均消毒后沿耳后溝中下部做長約1～ 2cm的弧形切口。此后三組豚鼠的手術(shù)方式有區(qū)別：B組暴露聽泡，并用顱鉆磨開，用顯微剝離子及吸引器打開前庭，吸除耳石器及壺腹嵴等以達(dá)到破壞前庭，將浸有無水乙醇的明膠海綿置入前庭，縫合切口。A組（假手術(shù)組）打開聽泡后不破壞前庭。直接縫合切口。C組手術(shù)包括兩部分：分離皮膚筋膜及其肌肉，暴露顳線，用直徑為1.2mm顱鉆鉆頭在顳線下方鉆孔，擴(kuò)大該孔直至暴露外、上半規(guī)管。用直徑為0.8mm的顱鉆鉆頭分別在外、上半規(guī)管鉆下長約2mm的裂隙，術(shù)中可見到清亮的淋巴液漏出來，術(shù)中應(yīng)輕柔操作以防鉆頭將半規(guī)管整段磨除。在半規(guī)管裂隙周圍置入適當(dāng)?shù)乃幟?，并滴?～2滴地塞米松磷酸鈉注射液。②在如上的手術(shù)留下的孔后方約2cm的位置就是聽泡，用顱鉆磨開聽泡，尋找到圓窗，用針灸針挑開圓窗膜，并將長度適宜消毒過的篩孔狀的PE管置入圓窗內(nèi)，輕輕轉(zhuǎn)動一兩圈以破壞圓窗膜。同樣以適量的藥棉覆蓋孔的周圍，滴入1～2滴地塞米松磷酸鈉注射液。三組豚鼠均在縫合切口后消毒皮膚切口，切口周圍涂上紅霉素軟膏，術(shù)后7天內(nèi)每天給予切口消毒，切口周圍涂上適量紅霉素軟膏。B、C組豚鼠術(shù)后按所需存活時間（術(shù)后1天、3天、1周、2周、3周）每個時間段隨機(jī)取8只。C組豚鼠清醒后用鼓氣耳鏡適當(dāng)?shù)脑黾有g(shù)耳外耳道內(nèi)的壓力，每天1次，B組和A組不做此處理。

1.2.2 前庭代償指標(biāo)的記錄

豚鼠清醒后出現(xiàn)急性單側(cè)前庭功能失衡癥狀記為零時,觀察并記錄動物術(shù)后所需存活時間點(diǎn)的自發(fā)性眼震、頭偏斜及失衡行為評分的動態(tài)變化過程。

1.2.3 標(biāo)本取材及制備

豚鼠飼養(yǎng)到預(yù)期時間后，用能使豚鼠處于深麻醉的的1%戊巴比妥鈉（約2ml）腹腔注射麻醉豚鼠。將豚鼠仰臥位固定好，做腹部切口，分離開腹腔臟器暴露下腔靜脈，用血管鉗夾閉下腔靜脈。切開橫隔，暴露跳動的心臟，小心撕開心包膜，用灌注針頭從心尖插入一直到升主動脈，用血管鉗夾閉針頭固定。先用生理鹽水進(jìn)行快速灌注，當(dāng)看到肺臟逐漸發(fā)白且灌流出來的液體沒有血色后換上新鮮配制的4%多聚甲醛(pH7.4)快速灌注，待豚鼠身體逐漸僵硬，緩慢灌注20min后結(jié)束,豚鼠斷頭,剝除顱骨，小心取下腦干，迅速放入新鮮配制的4%多聚甲醛液（pH7.4）中過夜固定，次日借助豚鼠腦干立體圖譜進(jìn)行取材，石蠟包埋后切片。切片厚度為4μm，放置于防脫載玻片上，切片放入65℃恒溫烤箱烤片3小時，常溫封存。

1.2.4 免疫組化方法

將切片置于65℃恒溫烤箱約10 min后拿出；二甲苯脫蠟（四次）和酒精水化（依次100%，90%，80%，70%）；蒸餾水沖洗，切片置于0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)放入高壓鍋高壓修復(fù)30 min，0.01 mol /L磷酸鹽緩沖液浸洗3次×3 min；3%H2O2去離子水室溫孵育10 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗3次×3 min；拭去多余液體，禁止干片，標(biāo)本上滴加適量一抗(美國Abnova公司，抗M2一抗用一抗稀釋液按1:200稀釋，抗M3一抗用一抗稀釋液按1:150稀釋)放入濕盒內(nèi)并4℃過夜；37℃復(fù)溫20min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗3次×3 min；滴加聚合物輔助試劑1, 37℃孵育20min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液浸洗3次×3min；滴加山羊抗兔IgG/辣根過氧化物酶標(biāo)記物，37℃孵育20 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液3次×3 min；DAB溶液顯微鏡下顯色約1min，蒸餾水沖洗；蘇木素復(fù)染約2min，蒸餾水沖洗，用1%的鹽酸酒精分化，二甲苯透明，待干，中性樹脂封片。

對照實(shí)驗(yàn)：一抗用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液( pH 7.4)替代。

1.2.4 采用olympus圖像采集系統(tǒng)和Image-pro plus6.0圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個視野，以細(xì)胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，測定每個視野下染色的平均光密度值（IOD）。IOD=總光密度值/陽性面積。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，術(shù)側(cè)與對側(cè)比較采用配對t檢驗(yàn)，A、B、C三組術(shù)后組間及組內(nèi)各時間段比較采用方差分析。以±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察的結(jié)果

豚鼠在手術(shù)后1～2h從麻醉中清醒。A組豚鼠清醒后與手術(shù)前（正常）相比無任何異常，B、C組出現(xiàn)術(shù)側(cè)急性前庭功能紊亂的癥狀，主要有快相向健側(cè)的自發(fā)性眼震，并伴向術(shù)側(cè)的頭眼震樣擺動(Head nys?tagmus)，又稱頭震；頭明顯偏向術(shù)側(cè)。偏斜度甚至超過與軀體縱軸的垂直線；沿軀體縱軸向術(shù)側(cè)翻滾；術(shù)側(cè)肢體向外伸展，以地面垂直軸為中心向術(shù)側(cè)環(huán)形轉(zhuǎn)圈。B、C組豚鼠術(shù)后的各種失衡癥狀隨時間的推移逐漸減輕并消失,這一過程存在著個體差異，同一時段內(nèi)失衡癥狀的減輕程度C組＜B組，如術(shù)后48h B組豚鼠已無自發(fā)性眼震，C組用鼓氣耳鏡給術(shù)耳外耳道適當(dāng)鼓氣仍可出現(xiàn)（5～6次/15秒）的眼震。術(shù)后2周和3周，B組各失衡癥狀均已不存在，C組仍存在頭偏斜等失衡癥狀，且用鼓氣耳鏡給術(shù)耳外耳道適當(dāng)鼓氣仍可出現(xiàn)（5～6次/15秒）的眼震。

2.2 前庭內(nèi)側(cè)核中毒蕈堿受體M2和M3亞型免疫組化結(jié)果毒蕈堿受體M2和M3亞型在各組豚鼠的MVN中均有表達(dá)（見圖1），表現(xiàn)為細(xì)胞膜呈棕黃色，B、C組術(shù)后均可誘導(dǎo)術(shù)側(cè)MVN區(qū)毒蕈堿受體M2、M3亞型免疫反應(yīng)性表達(dá)減少，術(shù)后1天表達(dá)最少，術(shù)后3天至術(shù)后7天表達(dá)處于上升趨勢，術(shù)后7天時B組和假手術(shù)組比較表達(dá)無差異，而C組和假手術(shù)組比較表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），直到術(shù)后2周，C組和假手術(shù)組比較表達(dá)無差異。B、C組術(shù)后各時期（術(shù)后2周前）相比，C組的表達(dá)弱于B組。各組對側(cè)的變化趨勢和術(shù)側(cè)相同。見表1-4。

圖1 （A-P）豚鼠術(shù)后前庭內(nèi)側(cè)核毒蕈堿受體的表達(dá)×400，A:假手術(shù)組,M2;B:B組術(shù)后1天,M2;C：B組術(shù)后3天，M2;D:B組術(shù)后1w，M2;E:C組術(shù)后1天，M2;F；C組術(shù)后3天，M2;G:C組術(shù)后1w，M2;H:C組術(shù)后2w，M2;I:假手術(shù)組，M3;J:B組術(shù)后1天，M3; K:B組術(shù)后3天，M3;L:B組術(shù)后1w，M3;M:C組術(shù)后1天，M3;N: C組術(shù)后3天，M3;O：C組術(shù)后1w，M3;P:C組術(shù)后2w，M3.Fig.1 （A-P）The expression of muscarinic receptors in the medial vestibular nucleus of guinea pigs after operation.A：the sham—operated group，M2;B：1days after Operation in group B，M2;C:3days after operation in group B,M2;D:1weeks after operation in group B,M2;E:1days after Operation in group C, M2;F:3days after Operation in group C,M2;G:1weeks after Operation in group C,M2;H:2weeks after Operation in groupC,M2; I:the sham—operated group，M3;J:1days after Operation in group B，M3;K:3days after Operation in group B，M3;L: 1weeks after Operation in group B，M3;M:1days after Operation in group C，M3;N:3days after Operation in group C，M3; O:1weeks after Operation in group C，M3;P:2weeks after Operation in group C，M3.

3 討論

迷路瘺管也稱之為局限性迷路炎或迷路周圍炎，即指骨迷路的骨質(zhì)甚至骨內(nèi)膜因膽脂瘤基質(zhì)或肉芽組織等其他病變的侵襲造成缺損所致[2,3]。瘺管大多位于外半規(guī)管（75%以上），也可發(fā)生于上、后半規(guī)管，前庭，耳蝸，或整個迷路，但以發(fā)生于半規(guī)管較多見。迷路瘺管可引起發(fā)作性或激發(fā)性眩暈，眩暈多在快速轉(zhuǎn)身、屈體、受到震動、耳內(nèi)操作（如挖耳等）或壓迫耳屏?xí)r發(fā)作。有文獻(xiàn)報道，在有外淋巴瘺存在的情況下，用鼓氣耳鏡適當(dāng)?shù)脑黾踊驕p少患耳外耳道的壓力可引起眩暈及自發(fā)性眼震[4,5]。

正常平衡功能的保持，有賴于完整的前庭覺、本體覺和視覺，以及它們在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Ner?vous System，CNS）內(nèi)不斷被整合的功能。任何一處的病變或功能障礙都將引起平衡紊亂或影響前庭疾病的恢復(fù)。其中又以神經(jīng)元交換較少和信息傳遞環(huán)路較快的前庭系統(tǒng)對維持平衡最為重要。前庭系統(tǒng)的主要功能是對不同的運(yùn)動狀態(tài)或頭部位置產(chǎn)生位置覺和運(yùn)動覺的同時，還可以通過調(diào)控不同部位肌緊張和軀體運(yùn)動，使機(jī)體盡可能的保持在原有空間位置上，維持一定姿勢，保持身體平衡。

突發(fā)雙側(cè)或單側(cè)前庭功能喪失后，患者立即嚴(yán)重共濟(jì)失調(diào)，步態(tài)不穩(wěn)，受損側(cè)前庭輸入下降或缺失引起靜態(tài)癥狀和動態(tài)癥狀，表現(xiàn)為眩暈、嘔吐和快相向健側(cè)的眼震[6-8]，頭偏向同側(cè)、站立不穩(wěn)和向患側(cè)傾倒等平衡障礙[9-12]。在中樞系統(tǒng)的重組下,癥狀逐漸減輕直至消失，前庭功能部分或全部恢復(fù)，這一過程稱為前庭代償（vestibular compensation）[13,14]。一側(cè)前庭終末器受到破壞后不能再生,前庭代償是兩側(cè)前庭中樞共同調(diào)節(jié)的結(jié)果,是中樞性過程。目前己證實(shí)參與前庭代償?shù)慕Y(jié)構(gòu)有[15]:對側(cè)前庭終末器、兩側(cè)前庭神經(jīng)核、視覺系統(tǒng)、本體感覺系統(tǒng)、脊髓、小腦、大腦、下橄欖核、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及聯(lián)合纖維通路等。其中前庭神經(jīng)核在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的代償性重組中發(fā)揮重要的作用，它不僅是一個傳入平衡沖動信號的中繼站，也是一個將身體各處不斷傳來的平衡沖動信息進(jìn)行綜合分析和處理的場所。前庭神經(jīng)核位于腦橋和延髓部分，每側(cè)共有4個，即前庭神經(jīng)上核、外側(cè)核、內(nèi)側(cè)核和下核。上核接受來自壺腹嵴的傳入神經(jīng)纖維，外核與內(nèi)側(cè)核主要接受來自橢圓囊斑及壺腹嵴的傳入神經(jīng)纖維，下核接受所有前庭終器的傳入神經(jīng)纖維。前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核（MVN）的神經(jīng)元密度很大，是前庭神經(jīng)核的四個核團(tuán)中最大的一個，其內(nèi)有多種神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)，對調(diào)節(jié)前庭神經(jīng)核神經(jīng)元電活動中有不可替代的作用，并且前庭神經(jīng)內(nèi)側(cè)核對前庭代償有著重要的意義。

許多研究結(jié)果表明，體內(nèi)某些神經(jīng)遞質(zhì)或化學(xué)受體參與了前庭代償?shù)陌l(fā)生，如組胺能受體、膽堿能受體等。膽堿能受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中均發(fā)揮著重要的生理作用，研究證實(shí)膽堿能參與調(diào)控前庭神經(jīng)核的活動，并且可能與前庭代償有關(guān)[16,17]，Kong等的研究表明，乙酰膽堿存在于前庭神經(jīng)系統(tǒng)[18]。有研究表明在前庭神經(jīng)核中，存在大量的毒蕈堿受體，其可能對前庭神經(jīng)元的活動有著一定的調(diào)控作用[19]。文獻(xiàn)證實(shí)M2和M3可能是前庭內(nèi)側(cè)核表達(dá)量最多的毒蕈堿受體[20]。Calza的研究證實(shí)毒蕈堿受體參與了前庭代償?shù)倪M(jìn)行，但沒有具體闡述是哪種亞型在前庭代償中起了作用[21]。Kirsten的研究證實(shí)前庭內(nèi)側(cè)核和前庭外側(cè)核均有膽堿能受體和組胺受體的存在[22]，Waller等用細(xì)胞外記錄的方法研究出大鼠前庭內(nèi)側(cè)核存在毒蕈堿受體和尼古丁受體，但毒蕈堿受體的表達(dá)量更突出；乙酰膽堿受體激動劑可引起前庭內(nèi)側(cè)核、前庭上核、前庭下核的神經(jīng)元平均放電率的變化[23]。Phelan等的研究結(jié)果表明：盡管前庭內(nèi)側(cè)核（MVN）的初級傳入不是由乙酰膽堿調(diào)控的，但膽堿能機(jī)制對前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元興奮性的調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。這種調(diào)節(jié)可以直接毒蕈堿受體或尼古丁受體介導(dǎo)的突觸前興奮的形式，也可以毒蕈堿受體作用于突觸前GABA能成分而發(fā)揮作用的間接形式[24]。Bienhold等人通過對林蛙進(jìn)行單側(cè)迷路切除后待其失衡癥狀恢復(fù)，全身或淋巴管內(nèi)應(yīng)用膽堿酯酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)林蛙單側(cè)迷路切除后的失衡癥狀再度重復(fù)出現(xiàn)，該研究得出結(jié)論一側(cè)前庭功能喪失后，前庭系統(tǒng)的代償重組涉及到膽堿能突觸的修飾[25]。Ishikawa通過對進(jìn)行單側(cè)迷路切除術(shù)后的松鼠猴注射阿托品發(fā)現(xiàn)可明顯降低自發(fā)性眼震的慢相眼速，也可降低減幅擺動旋轉(zhuǎn)性眼震的最大慢相眼速，而注射卡巴膽堿則會出現(xiàn)相反的結(jié)果，該研究得出結(jié)論單側(cè)迷路切除后阿托品的主要作用位點(diǎn)在前庭神經(jīng)核的完整側(cè)[26]。Abeln等人通過對單側(cè)迷路切除后完全或部分代償?shù)牧滞苋砘蝻B內(nèi)應(yīng)用擬膽堿類藥或抗膽堿酯酶藥，發(fā)現(xiàn)動物立即出現(xiàn)單側(cè)迷路切除后所有失代償?shù)陌Y狀，得出結(jié)論前庭系統(tǒng)的代償性重組涉及到腦干膽堿能突觸的修飾，且它們的量和靈敏性是非對稱性分布的[27]。Ujihara等人通過細(xì)胞外記錄發(fā)現(xiàn)前庭內(nèi)側(cè)核神經(jīng)元自發(fā)活動的放電頻率受毒蕈堿受體的調(diào)節(jié)，ACh和毒蕈堿均能劑量依賴性的增加MVN神經(jīng)元的自發(fā)放電[28]。

表1 同一時段ABC三組之間術(shù)側(cè)M2表達(dá)及組內(nèi)不同時段M2表達(dá)(±s)Table 1 The expression of M2 receptor in the operative side among three groups at the same time period and in each group ofABC at the different time periods(±s)

表1 同一時段ABC三組之間術(shù)側(cè)M2表達(dá)及組內(nèi)不同時段M2表達(dá)(±s)Table 1 The expression of M2 receptor in the operative side among three groups at the same time period and in each group ofABC at the different time periods(±s)

Time 1 day 3 day 1 week 2 week 3 week F value P value AGroup 121.00±6.54 121.00±6.54 121.00±6.54 121.00±6.54 121.00±6.54 F value 82.873 44.544 26.657 0.018 0.052 P value 0.000 0.000 0.000 0.983 0.950——B Group 78.25±5.63*104.38±7.85*121.13±8.44 121.12±7.12 120.63±6.72 53.749 0.000 C Group 75.54±10.68*88.25±6.32*99.35±6.56*120.63±6.89 121.75±8.05 54.058 0.000

表2 同一時段ABC三組之間術(shù)側(cè)M3表達(dá)及組內(nèi)不同時段M3表達(dá)(±s)Table 2 The expression of M3 receptor in the operative side among three groups at the same time period and in each group ofABC at the different time periods(±s)

表2 同一時段ABC三組之間術(shù)側(cè)M3表達(dá)及組內(nèi)不同時段M3表達(dá)(±s)Table 2 The expression of M3 receptor in the operative side among three groups at the same time period and in each group ofABC at the different time periods(±s)

Time 1 day 3 day 1 week 2 week 3 week F value P value AGroup 101.00±4.75 101.00±4.75 101.00±4.75 101.00±4.75 101.00±4.75 F value 201.598 62.700 18.141 0.201 0.202 P value 0.000 0.000 0.000 0.820 0.819——B Group 52.13±4.16*85.88±7.38*101.38±7.89 102.88±7.55 102.12±6.51 80.885 0.000 C Group 54.50±7.11*65.88±6.47*85.13±5.38*102.13±5.19 102.86±6.40 98.584 0.000

表3 ABC三組術(shù)后各時段術(shù)側(cè)和對側(cè)M2受體的表達(dá)(±s)Table 3 The expression of M2 receptor in the operative side and the contralateral side inABC three groups at different time periods after operation(±s)

表3 ABC三組術(shù)后各時段術(shù)側(cè)和對側(cè)M2受體的表達(dá)(±s)Table 3 The expression of M2 receptor in the operative side and the contralateral side inABC three groups at different time periods after operation(±s)

GROUP A Group 1 day（B group）3 day（B group）1 week（B group）2 week（B group）3 week（B group）1 day（C group）3 day（C group）1 week（C group）2 week（C group）3 week（C group）IOD of operation side 121.00±6.54 78.25±5.63 104.38±7.85 121.13±8.44 121.12±7.12 120.63±6.72 75.54±10.68 88.25±6.32 99.35±6.56 120.63±6.89 121.75±8.05 IOD of contralateral side 121.25±4.71 79.38±5.21 104.88±8.09 121.25±9.79 119.25±10.88 121.88±5.22 76.13±10.10 87.63±7.88 99.38±7.35 121.25±6.69 122.63±7.04 T Value 0.088 0.415 0.746 0.125 0.398 0.416 0.12 0.175 0.036 0.11 0.231 P Value 0.931 0.684 0.468 0.902 0.697 0.684 0.906 0.863 0.972 0.914 0.82

綜上前人的研究，本實(shí)驗(yàn)通過制造迷路瘺管，使動物出現(xiàn)反復(fù)發(fā)作的眩暈，通過觀察反復(fù)發(fā)作性眩暈豚鼠前庭內(nèi)側(cè)核(medial vestibular nucleus，MVN)中毒蕈堿受體M2、M3亞型的表達(dá)變化，探討其在前庭代償?shù)目赡軝C(jī)制有一定的意義。我們的研究結(jié)果表明，B、C組術(shù)后均可導(dǎo)致雙側(cè)MVN區(qū)毒蕈堿受體M2、M3亞型表達(dá)減少，術(shù)后1天表達(dá)最少，術(shù)后3天至術(shù)后7天表達(dá)處于上升趨勢，各組對側(cè)的變化趨勢和術(shù)側(cè)相同。術(shù)后7天時B組和假手術(shù)組比較表達(dá)無差異，B組的免疫組化結(jié)果與前庭代償過程中豚鼠的行為學(xué)變化是一致的。術(shù)后7天時C組和假手術(shù)比較表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），直到術(shù)后2周，C組和假手術(shù)組比較表達(dá)無差異。而動物行為學(xué)上，術(shù)后2周和3周，B組各失衡癥狀均已不存在，C組仍存在頭偏斜等失衡癥狀，且用鼓氣耳鏡給術(shù)耳外耳道適當(dāng)鼓氣仍可出現(xiàn)（5～6次/15秒）的眼震。因此推斷C組免疫組化結(jié)果與前庭代償早期過程中豚鼠的行為學(xué)變化是一致的，后期并不一致，我們可得出結(jié)論：毒蕈堿受體M2、M3亞型可能在前庭代償?shù)脑缙诖龠M(jìn)了前庭代償?shù)恼＿M(jìn)行，前庭代償除可能涉及到膽堿能系統(tǒng)的參與外，可能還涉及到其他神經(jīng)遞質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)的參與。從B、C組各時期動物行為學(xué)和免疫組化結(jié)果相比較可進(jìn)一步證明迷路瘺管導(dǎo)致的反復(fù)發(fā)作性眩暈?zāi)Ｐ偷脑炷Ｊ浅晒Φ摹腂、C組的免疫組化結(jié)果我們可得出結(jié)論：豚鼠MVN存在毒蕈堿受體M2和M3，且M3受體的表達(dá)可能不及M2受體的豐富。前庭代償是一個中樞過程，其發(fā)生機(jī)制很復(fù)雜，學(xué)者們還需要不斷地從神經(jīng)生理學(xué)、神經(jīng)化學(xué)及神經(jīng)藥理學(xué)等方面來研究其機(jī)制。

表4 ABC三組術(shù)后各時段術(shù)側(cè)和對側(cè)M3受體的表達(dá)(±s)Table 4 The expression of M3 receptor in the operative side and the contralateral side inABC three groups at different time periods after operation(±s)

表4 ABC三組術(shù)后各時段術(shù)側(cè)和對側(cè)M3受體的表達(dá)(±s)Table 4 The expression of M3 receptor in the operative side and the contralateral side inABC three groups at different time periods after operation(±s)

由表1-4可知：毒蕈堿受體M2、M3亞型在各組豚鼠的MVN中均有表達(dá)，A組（假手術(shù)組）跟正常豚鼠的表達(dá)一樣，B、C組術(shù)后均可誘導(dǎo)術(shù)側(cè)MVN區(qū)毒蕈堿受體M2、M3亞型免疫反應(yīng)性表達(dá)減少，術(shù)后1天表達(dá)最少，術(shù)后3天至術(shù)后7天表達(dá)處于上升趨勢，術(shù)后7天時B組和假手術(shù)組比較表達(dá)無差異，而C組和假手術(shù)組比較表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），直到術(shù)后2周，C組和假手術(shù)組比較表達(dá)無差異。B、C組術(shù)后各時期（術(shù)后2周前）相比，C組的表達(dá)弱于B組。各組對側(cè)的變化趨勢和術(shù)側(cè)相同。。

GROUP A Group 1 day（B group）3 day（B group）1 week（B group）2 week（B group）3 week（B group）1 day（C group 3 day（C group）1 week（C group）2 week（C group）3 week（C group）IOD of operation side 101.00±4.75 52.13±4.16 85.88±7.38 101.38±7.89 102.88±7.55 102.12±6.51 54.50±7.11 65.88±6.47 85.13±5.38 102.13±5.19 102.86±6.40 IOD of contralateral side 104.25±5.78 86.38±7.35 101.63±10.09 102.25±7.74 102.25±8.24 55.63±8.21 66.63±6.69 85.75±5.65 102.38±7.78 102.75±4.13 T Value 1.229 1.135 0.136 0.055 0.062 0.034 0.974 0.228 0.227 0.453 0.046 P Value 0.239 0.235 0.894 0.957 0.915 0.974 0.774 0.823 0.824 0.657 0.964

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Expression of M2/M3 muscarinic receptors in medial vestibular nucleus in guinea pigs with recurrent vertigo

RAO Xiuli,YIN Shihua,HOU Tao,ZHU Ziang,LONG Ji
Department of Otolaryngology-Head and Neck surgery，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University

Objective To study changes in expression of M2 and M3 muscarinic receptor subtypes in the medial vestibular nucleus using a guinea pig model of recurrent vertigo caused labyrinthine fistula.Method Adult guinea pigs(n=88) were randomly divided to receive sham-operation(group A,n=8),unilateral labyrinth lesioning(group B,n=40),or labyrinthine fistula modeling and pneumatic otoscope treatment(group C,n=40).Guinea pigs in groups B and C were randomly selected to be sacrificed at 1 day,3 days,1 week,2 weeks or 3 weeks post-operatively(n=8 at each time point),while animals in group A were sacrificed at 3 weeks post-operation.Following fixative perfusion,the brain stem was harvested and expression of muscarinic receptors M2 and M3 subtypes in the MVN was examined by immunohistochemistry and compared among different groups.Results Muscarinic receptor M2/M3 subtypes decreased in MVN on both sides after operation in animals from groups B and C.Expression was the lowest at day 1,and rose from day 3 to day 7 after operation.Significant difference was seen between groups A and C at day 7 after operation(P＜0.05),but not between groups B and A.At 2 weeks after operation,there was no difference between groups C and A.M2/M3 expression in group C was also weaker than that in group B group before two weeks after operation).There was no side-to-side difference in any groups.Conclusion 1.M2 and M3 muscarinic receptor subtypes are expressed in the MVN in guinea pigs,with seemingly less M3 receptor expression than M2 receptor expression.These receptors may promote the normal process in the early stage of vestibularcompensation.2.In addition to the involvement of the cholinergic system,vestibular compensation may also involve other neurotransmitters or chemical substances.3.The data provide additional evidence supporting the successful modeling of recurrent vertigo by labyrinthine fistula.

recurrent vertigo；labyrinthine fistula；vestibular compensation、medial vestibular nucleus；muscarinic receptors；guinea pigs

R764.1

A

1672-2922（2016）05-674-7

2016-03-14審核人：于寧）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.05.024

廣西自然科學(xué)基金(基金任務(wù)書編號：2015GXNSFAA414004);廣西自然科學(xué)基金（項(xiàng)目任務(wù)書編號：2016GXNSFAA380150）

饒秀麗，碩士研究生，研究方向：眩暈中樞代償機(jī)制的研究

尹時華，Email：shihuayin@126.com