楊傳玉 胡珺 譚丹 陳思穎 楊暢 孫佳 劉亭 王愛民

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004；3.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004；)

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黔產(chǎn)鐵皮石斛對阿司匹林誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1損傷的保護(hù)作用研究

楊傳玉1,2胡珺1,2譚丹1,2陳思穎1,3楊暢1,3孫佳1,3劉亭1,3王愛民1, 2△

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004；3.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州 貴陽 550004；)

目的 探討鐵皮石斛全提物對阿司匹林誘導(dǎo)人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞損傷的藥效作用。方法 體外培養(yǎng)人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1細(xì)胞，經(jīng)阿司匹林處理后，建立阿司匹林誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞損傷模型；以阿司匹林聯(lián)合鐵皮石斛全提物各濃度預(yù)處理GES-1細(xì)胞為鐵皮石斛組，以阿司匹林聯(lián)合奧美拉唑預(yù)處理細(xì)胞為陽性組，并設(shè)立陰性對照組，采用MTS法檢測細(xì)胞存活率,并通過比色法測定細(xì)胞上清液中LDH含量。結(jié)果 當(dāng)阿司匹林的濃度為18.5 mmol/L處理GES-1細(xì)胞24 h時，細(xì)胞的抑制率為40%；鐵皮石斛濃度范圍0～500 μg/mL內(nèi)，受損細(xì)胞存活率隨鐵皮石斛劑量增加而升高，LDH釋放量逐漸降低(P<0.05)。結(jié)論 鐵皮石斛對于阿司匹林誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

鐵皮石斛； GES-1細(xì)胞; 阿司匹林; MTS方法; LDH含量測定

鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)的干燥莖，又名黑節(jié)草，為我國傳統(tǒng)名貴藥材，有味甘、質(zhì)重、黏性大等特點，享有“中華九大仙草之首”的美譽(yù)；《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，有滋陰清熱、益胃生津，潤肺止咳等功效。鐵皮石斛化學(xué)成分多樣，主要含有生物堿、多糖、氨基酸、菲類等化合物，藥理研究表明，鐵皮石斛具有明顯的抗氧化、抗腫瘤、降低血糖以及提高免疫力等作用，在治療惡性腫瘤、糖尿病、白內(nèi)障、關(guān)節(jié)炎等疾病方面具有較好的療效[1]。歷代中醫(yī)認(rèn)為，石斛性寒，味甘、淡、微咸，入胃、腎經(jīng)，具有益胃生津、滋陰清熱功效，石斛入胃經(jīng)從而使胃津充足，受納腐熟水谷、厚腸胃[2]，這提示鐵皮石斛有一定保護(hù)胃損傷的作用。因此，本研究擬采用人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1[3]分別與阿司匹林[4]、鐵皮石斛體外共培養(yǎng)，通過MTS法檢測細(xì)胞存活率和比色法檢測細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶(LDH)含量，共同探討鐵皮石斛對阿司匹林誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞GES-l損傷的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料 GES-1細(xì)胞：來源于人永生化胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)，購于上海中科院細(xì)胞庫。鐵皮石斛藥材：貴州羅甸鐵皮石斛種植基地(貴州醫(yī)科大學(xué)生藥教研室龍慶德副教授鑒定)。主要試劑及儀器試劑材料：優(yōu)質(zhì)胎牛血清(澳洲Gibco)；胰蛋白酶(美國Hyclon)；磷酸鹽緩沖液(美國HycAlon)；DMEM-H(澳洲Gibco)；LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所)、MTS試劑盒(美國Promega)；二甲基亞砜(科秘歐化學(xué)試劑有限公司)；雙抗(美國Hyclon)；阿司匹林(貴州圣都藥業(yè)有限公司，A1507002)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo)；酶標(biāo)儀(上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)，倒置顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 鐵皮石斛全提物的制備 鐵皮石斛粉末300 g，加10倍量85%乙醇回流提取3次，2 h/次，紗布過濾，得濾液A；藥渣揮干乙醇，加入30倍量水，95 ℃浸泡提取3次，2 h/次，紗布過濾，得濾液B，合并2次濾液，濃縮至浸膏，4 ℃密封保存。

1.3 方法

1.3.1 胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1的培養(yǎng) 人胃黏膜細(xì)胞系GES-1細(xì)胞復(fù)蘇后置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，以DMEM高糖培養(yǎng)基 為培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，1%雙抗)，在37 ℃、5% CO2、相對濕度90%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液，每3 d按1∶3比例傳代。

1.3.2 GES-1細(xì)胞損傷模型的建立 將GES-1細(xì)胞用含不同濃度阿司匹林的培養(yǎng)液作用24 h，造成GES-1細(xì)胞損傷，運(yùn)用MTS法進(jìn)行檢測，結(jié)果最佳細(xì)胞模型為細(xì)胞抑制率為40%左右，以下實驗均以此阿司匹林濃度為細(xì)胞損傷模型濃度[5-6]。

1.3.3 細(xì)胞的分組和處理 將細(xì)胞分為鐵皮石斛不同濃度組，奧美拉唑陽性組、阿司匹林模型組、正常組。處理：取對數(shù)生長期的GES-1細(xì)胞按1×105個/mL接種于96孔培養(yǎng)板，常規(guī)放置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，吸取上清液，用PBS洗2次。模型組加入含40%抑制濃度阿司匹林的培養(yǎng)液100 μL，鐵皮石斛組分別以不同濃度鐵皮石斛全提物預(yù)處理6，12，24，36 h，再加入阿司匹林，使培養(yǎng)液中阿司匹林濃度為40%抑制濃度；奧美拉唑陽性組處理方法同鐵皮石斛組，每組設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)定不予藥物干預(yù)的陰性對照組。MTS法檢測細(xì)胞存活率 取各組細(xì)胞給予阿司匹林后培養(yǎng)24 h, 吸取上清液，用PBS洗2次，加入完全培養(yǎng)基，每孔加入MTS試劑5 μL，搖勻，繼續(xù)放置37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)培養(yǎng)3 h，以空白孔調(diào)零，于酶標(biāo)儀490 nm波長處讀取OD值。細(xì)胞存活率(%)=(OD樣品/OD空白)×100%。LDH含量測定 取各測試孔上清液，按照試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞上清液中LDH含量。LDH (U/L)=(測定OD值-對照OD值) / (標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值) ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.2 mmol/L) ×1 000

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 正常GES-1細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察，其細(xì)胞生長旺盛、狀態(tài)良好，細(xì)胞多數(shù)呈多邊形或三角形，部分呈梭形，可見少量單個懸浮細(xì)胞，貼壁生長。阿司匹林損傷后，細(xì)胞皺縮，變圓，懸浮，部分細(xì)胞核固縮，部分細(xì)胞可見小空泡，隨著阿司匹林濃度加大，死亡細(xì)胞逐漸增多。

2.2 阿司匹林誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞損傷模型的建立 空白組細(xì)胞存活率(100±2.83)%，阿司匹林不同濃度作用GES-1細(xì)胞24 h后，12 mmol/L, 細(xì)胞存活率(82.18±4.40) %；16 mmol/L, 細(xì)胞存活率(78.50±3.91) %；18 mmol/L, 細(xì)胞存活率(76.50±5.99)%；18.5 mmol/L, 細(xì)胞存活率(61.88±3.21)%；20 mmol/L, 細(xì)胞存活率(38.18±2.13) %。各濃度均對細(xì)胞有損傷，隨阿司匹林濃度增加，細(xì)胞的存活率降低，當(dāng)其濃度為18.5 mmol/L時，其細(xì)胞抑制率達(dá)40%。2.3 不同濃度鐵皮石斛對阿司匹林誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞的影響 不同濃度鐵皮石斛作用阿司匹林誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞損傷24 h后，與模型組比較，各鐵皮石斛給藥組的存活率明顯增加，LDH釋放量隨鐵皮石斛提取物濃度加大而降低，以臨床常用的奧美拉唑作20 μg/mL為陽性對照，評價鐵皮石斛不同濃度對于胃黏膜損傷的相關(guān)性，濃度為100 μg/mL的鐵皮石斛與奧美拉唑藥效相當(dāng)。結(jié)果見表1～2。與模型組相比，鐵皮石斛作用阿司匹林損傷的細(xì)胞6，12，36 h，其細(xì)胞存活率均有增加，LDH釋放量減少，鐵皮石斛對阿司匹林作用時間在24 h以內(nèi)時，隨時間延長，細(xì)胞存活率呈遞增，LDH釋放量逐漸減少；但超過24 h后，其作用效果與作用24 h差異不大。

表1 不同濃度鐵皮石斛對阿司匹林損傷GES-1細(xì)胞存活率與LDH水平影響

注：與模型組比較，*P<0.05，△P<0.01。

表2 不同濃度鐵皮石斛對阿司匹林損傷GES-1細(xì)胞LDH水平的影響

注：與模型組比較，*P<0.05,△P<0.01。

3 討 論

傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為鐵皮石斛能夠“厚腸胃”[2]，顯示鐵皮石斛對胃黏膜損傷有一定的保護(hù)作用，本實驗以此為出發(fā)點，開展了一系列相關(guān)研究。隨著阿司匹林臨床應(yīng)用的日趨廣泛，其消化系統(tǒng)不良反應(yīng)被受關(guān)注，其中胃黏膜損傷突出，主要表現(xiàn)出黏膜糜爛和潰瘍，嚴(yán)重可發(fā)生出血或穿孔[7-8]。本實驗選用人永生化胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞作為體外實驗的細(xì)胞模型，在分子水平上更大程度地接近臨床實驗。實驗采用不同濃度的阿司匹林誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)阿司匹林濃為18.5 mmol/L時，細(xì)胞抑制率為40%，表明該濃度的阿司匹林是細(xì)胞損傷的最佳濃度，經(jīng)多次實驗發(fā)現(xiàn)，該方法條件穩(wěn)定，操作較為簡單，結(jié)果可靠。

在建立了穩(wěn)定的細(xì)胞損傷模型后，給予不同濃度的鐵皮石斛，通過MTS法檢測受損細(xì)胞的存活率和比色法測定LDH釋放量，當(dāng)細(xì)胞損傷時，細(xì)胞膜的通透性增加，較多的LDH從細(xì)胞中漏出，其含量越高，表明細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。初步證實了鐵皮石斛對受損的胃黏膜上皮細(xì)胞有較好的保護(hù)作用，但仍需用體內(nèi)模型進(jìn)一步確認(rèn)鐵皮石斛是否對胃黏膜具有保護(hù)作用。

本實驗觀察了鐵皮石斛不同作用時間對于受損細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在作用時間超過24 h后，細(xì)胞存活率與24 h變化無顯著性差異，其原因可能是細(xì)胞生長受抑制導(dǎo)致該現(xiàn)象。因此，后期的實驗研究將以此作用時間為參考，為本實驗室下一步開展鐵皮石斛保護(hù)胃黏膜受損活性部位篩選提供重要依據(jù)。

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Study on the protect effect of Dendrobium officinale Kimura et Migo from Guizhou on human gastric epithelial cell injury induced by aspirin

YangChuanyu1,2,HuJun1,2,TanDan1,2,ChenSiying1,3,YangChang1,3,SunJia1,3,LiuTing1,3,WangAimin1,2.

1.SchoolofPharmacy,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.2.EngineeringResearchCenterfortheDevelopmentandApplicationofEthnicMedicineandTCMofEducationMinistry,Guiyang550004,China. 3.GuizhouProvincialKeyLaboratoryofPharmaceutics,Guiyang550004,China.

Objective To investigate the protective effects of Dendrobium officinale Kimura et Migo extracts on aspirin-induced injury in human gastric mucosal epithelium cells (GES-1). Methods Human gastric epithelial cell line GES-1 was cultured in vitro. In aspirin group, GES-1 cells were treated with aspirin. GES-1 cells in Dendrobium officinale Kimura et Migo group were pretreated with different concentrations of Dendrobium officinale Kimura et Migo extracts before aspirin treatment. In omeprazole group, GES-1 cells were pretreated with omeprazole before aspirin treatment. And a negative control group was established simultaneously. MTS assay was used to detect the cell viability. The content of LDH was also determined by the LDH kit. Results Incubated at 18.5 mmol/L of aspirin for 24 h, GES-1 cell inhibitory rate reached 40% as the injury model of GES-1 cells, 0～500 μg/mL concentrations of Dendrobium officinale Kimura et Migo had a protective effect on the GES-1 cells to some extent, respectively. Moreover, these protective effects were more obvious with the increase of concentrations of Dendrobium officinale Kimura et Migo extracts. And the content of LDH was also released. Conclusion Dendrobium officinale Kimura et Migo extracts can promote proliferation to injury human gastric epithelial cell line GES-1 induced by aspirin.

Dendrobium officinale Kimura et Migo； GES-1 cells； Aspirin； MTS assay； LDH

貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目[黔科合SY字(2014)3032-2號]；民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用產(chǎn)學(xué)研基地建設(shè)[黔科合KY字(2013)122]；民族藥化學(xué)成分及活性研究[黔科合人字(2015)11號)

R285.5

A

1000-744X(2016)09-0905-03

2016-05-16)

△通信作者，E-mail：gywam100@163.com