劉志剛，付湘云，劉永芳，胡 剛，謝恒濤

武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430060

臨床相關(guān)劑量參附注射液預(yù)處理對腸缺血再灌注致急性肺損傷的影響

劉志剛，付湘云，劉永芳，胡 剛，謝恒濤

武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，湖北 武漢 430060

目的:探討臨床相關(guān)等效劑量參附注射液(SFI)預(yù)處理對大鼠腸缺血再灌注致急性肺損傷的影響。方法:建立腸缺血再灌注致急性肺損傷模型。健康大鼠40只隨機分成5組，每組8只。對照組(C組):腸系膜上動脈僅分離而不阻斷；損傷組(I/R組):腸系膜上動脈阻斷1小時后再灌注2小時，股靜脈給予等量生理鹽水進行對照；參附注射液預(yù)處理組(SFPR組):腸系膜上動脈阻斷前1小時將10 m L/kg的參附注射液從股靜脈恒速泵入；血晶素組(H em i n組):腸系膜上動脈阻斷前24小時腹腔注射H em i n 75 μm ol/kg。鋅原卟啉IX+SFPR組(ZnPPIX+SFPR組):腸系膜上動脈阻斷前24小時腹腔注射鋅原卟啉IX(20 m g/kg),后續(xù)操作同SFPR組。術(shù)前無需給藥的各組腹腔注射等劑量的生理鹽水，于再灌注2小時后頸動脈放血處死動物。觀察肺組織中血紅素加氧酶1(H O-1)的表達(dá)，丙二醛、過氧化物歧化酶(SO D)含量和肺通透性指數(shù)、動脈血氣和濕重比值的影響。結(jié)果:與I/R組比較，SFPR組和H ei m組肺組織H O-1細(xì)胞陽性表達(dá)增高；ZnPPIX+SFPR組上述陽性細(xì)胞表達(dá)降低(P＜0.05)。SFPR組和H ei m組肺通透性指數(shù)、肺組織M D A含量和濕/干重比均顯著降低，SO D值明顯升高(P＜0.05)；與C組比較，I/R組肺通透性指數(shù)與肺組織M D A含量和濕/干重比明顯增高，而SO D含量顯著降低(P＜0.05)；各組動物動脈血PaO2、PaCO2較C組顯著下降(P＜0.05)，SFPR組和H ei m組PaO2、PaCO2明顯高于I/R組。結(jié)論:臨床相關(guān)劑量的參附注射液預(yù)處理能明顯減輕腸缺血再灌注導(dǎo)致的急性肺損傷，其機制與上調(diào)H O-1蛋白表達(dá)、一定程度上抑制脂質(zhì)過氧化、拮抗氧自由基的損傷有關(guān)。

再灌注損傷；肺臟；腸黏膜；血紅素加氧酶-1；參附注射液

胃腸道參與休克及多器官功能不全綜合征(MODS)的病理生理過程中，腸缺血再灌注期間胃腸道及遠(yuǎn)隔臟器損傷的保護是臨床多學(xué)科研究的熱點。其中以急性肺損傷引起的急性呼吸窘迫綜合癥尤為突出。參附注射液(Shenfu injection，SFI)已應(yīng)用于休克和多器官功能不全綜合征的防治，尤其是胃腸道和肺損傷的保護。近年研究發(fā)現(xiàn)參附注射液可改善油酸所致的急性呼吸窘迫綜合征ARDS的血流動力學(xué)、肺及血液的氧合功能，對肺損傷具有一定的保護和治療作用［1-3］。本研究探討臨床相關(guān)等效劑量參附注射液預(yù)處理對腸缺血再灌注損傷所致的急性肺損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑 參附注射液(吉林卓怡康納制藥有限公司生產(chǎn)，批號:050301)；氯化高鐵血紅素(Sigma公司生產(chǎn)，批號:20131021)；兔抗人HO-1多克隆抗體(武漢博士德生物工程公司生產(chǎn)，批號:BA0602)，免疫組化SABC(批號:060203)、SOD (批號:050809)、MDA試劑盒(批號:050208)(均由santa cruz公司生產(chǎn))。

1.2 動物分組及造模 健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量200～260 g，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。隨機分成5組(n=8)，對照組(C組)、缺血再灌注組(I/R組)、參附注射液預(yù)處理組(SFPR組)、血晶素組(Hemin組)、鋅原卟啉IX+ SFPR組，實驗前12小時禁食，自由飲水。稱重，10%水合氯醛4 mg/kg腹腔麻醉后固定。參照Koji Ito等［4］的方法復(fù)制腸I/R模型，對照組(C組):腸系膜上動脈僅分離而不阻斷；損傷組(I/R組):腸系膜上動脈阻斷1小時后再灌注2小時，股靜脈給予等量生理鹽水進行對照；參附注射液預(yù)處理組(SFPR組):腸系膜上動脈阻斷前1小時將10 mL/kg的參附注射液從股靜脈恒速泵入；血晶素組(Hemin組):腸系膜上動脈阻斷前24小時腹腔注射Hemin75 μmol/kg。鋅原卟啉IX+SFPR組(ZnPPIX+SFPR組):腸系膜上動脈阻斷前24小時腹腔注射鋅原卟啉IX(20 mg/kg)，后續(xù)操作同SFPR組。術(shù)前無需給藥的各組腹腔注射等劑量的生理鹽水，于再灌注2小時后頸動脈放血處死動物。

1.3 方法

1.3.1 SA BC免疫組化方法檢測H O-1蛋白表達(dá) 免疫組化染色程序:采用免疫組化染色，以肺組織切片細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒狀沉淀物為陽性細(xì)胞。采用HIPAS-2000型全自動圖像分析系統(tǒng)，對HO-1的蛋白表達(dá)進行半定量分析，在顯微鏡下對陽性染色進行分析，測定HO-1平均吸光度(OD)，隨機測定5個高倍視野后計算其平均值。

1.3.2 血氣分析測定 大鼠處死前右頸動脈采血1 mL抗凝行血氣分析。按要求將血液填充到與i-STAT血氣分析儀配套的血氣分析測試片加樣池中，避免氣泡產(chǎn)生，將測試片插入自動血氣分析儀，讀取PaO2和PaCO2數(shù)值。

1.3.3 肺通透性指數(shù)測定 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白濃度與血清中蛋白濃度之比，即為肺通透性指數(shù)，指數(shù)增大說明肺毛細(xì)血管通透性增加，它是評價肺損傷的指標(biāo)［5］。

采用考馬斯亮藍(lán)蛋白測定法測支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量。

1.3.4 肺組織M D A、SO D含量測定 取右肺中葉100 mg(濕重)，以硫代巴比妥酸法測MDA，以黃嘌呤氧化酶法測SOD。1.3.5 分析天平測量肺組織濕/干重比(w et w ei ght t o dry w ei ght rat i o，W/D) 取左肺部分組織，濾紙吸干表面附著水分，用分析天平準(zhǔn)確測量濕重并記錄，于80℃恒溫箱烤24小時至肺干重恒定，稱干重，計算W/D。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以(s)表示，采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參附注射液對肺組織H O-1表達(dá)的影響 與C組比較，I/R組、SFPR組和Heim組肺組織HO-1細(xì)胞陽性表達(dá)增高；與I/R組比較，SFPR組和Heim組肺組織 HO-1細(xì)胞陽性表達(dá)增高；ZnPPIX+SFPR組上述陽性細(xì)胞表達(dá)降低(P＜0.05)。I/R組肺通透性指數(shù)與肺組織MDA含量明顯高于C組，而SOD含量顯著降低(P＜0.05)；與I/R組比較，SFPR組和Heim組肺通透性指數(shù)、肺組織MDA含量均顯著降低，SOD值明顯升高 (P＜0.05)，ZnPPIX+SFPR組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 參附注射液對肺組織H O-1(O D)和M D A、SO D含量表達(dá)的影響(s)

表1 參附注射液對肺組織H O-1(O D)和M D A、SO D含量表達(dá)的影響(s)

注:*表示與C組比較，P＜0.05；#表示與I/R組比較，P＜0.05。

組別 只數(shù) H O-1(O D) M D A/(nm ol·m L-1) SO D(N U·m L-1) C組 8 0.111±0.016 3.77±0.57 112.81±20.25 I/R組 8 0.167±0.015*6.46±0.73*50.78±16.74*SFPR組 8 0.194±0.017*#4.62±0.39*#85.47±8.51*#H em i n組 8 0.209±0.013*#4.46±0.42*#94.09±13.71*#ZnPPIX+SFPR組 8 0.114±0.018#6.70±0.46 52.33±15.26

2.2 參附注射液對大鼠肺組織濕/干重比的影響 與C組相比，I/R組肺組織濕/干重比增高50%(P＜0.05)，SFPR組和Heim組較I/R組分別降低17.4%和18.6%(P＜0.05)，但仍高于C組 (P＜0.05)；ZnPPIX+SFPR組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 參附注射液對肺通透性指數(shù)和肺組織濕/干重比的影響(s)

表2 參附注射液對肺通透性指數(shù)和肺組織濕/干重比的影響(s)

注:*表示與C組比較，P＜0.05；#表示與I/R組比較，P＜0.05。

2.3 參附注射液對動脈血氣的影響 各組動物動脈血pH值相近，無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。大鼠缺血再灌注后，PaO2、PaCO2較C組顯著下降(P＜0.05)。SFPR組和Heim組PaO2、PaCO2明顯高于I/R組，ZnPPIX+SFPR組與I/R組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 各組大鼠動脈血氣分析比較(s)

表3 各組大鼠動脈血氣分析比較(s)

注:*表示與C組比較，P＜0.05；#表示與I/R組比較，P＜0.05。

組別 只數(shù) pH PaO2/m m H g PaCO2/m m H g C組 8 7.41±0.05 100.00±0.90 37.50±3.50 I/R組 8 7.47±0.06 80.20±4.10*28.60±2.30*SFPR組 8 7.44±0.04 94.80±3.40#33.30±4.00#H em i n組 8 7.45±0.05 93.50±3.90#35.70±5.30#ZnPPIX+SFPR組 8 7.46±0.03 81.10±2.00 30.20±4.10

3 討論

腸缺血/再灌注損傷是一種臨床上很常見的臨床現(xiàn)象，研究表明，腸缺血再灌注損傷不僅會加重腸道損傷，而且會造成腸外多種器官損傷，如肺、心、腎、肝功能受損，甚至出現(xiàn)多臟器功能障礙綜合征(MODS)。肺臟是最易受損的器官，急性肺損傷(ALI)是MODS發(fā)展中出現(xiàn)最早、發(fā)生率最高的臨床癥狀，嚴(yán)重時可發(fā)展成急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)［6-7］，所以腸缺血再灌注引起的急性肺損傷倍受關(guān)注。

本實驗證實了大鼠腸缺血1小時再灌注2小時可引起典型的急性肺損傷病理表現(xiàn)。文獻(xiàn)報道［8］，腸缺血再灌注后，氧自由基造成的損害可能為重要的病理機制，并在腸缺血再灌注后的肺損傷中起重要作用。本研究的結(jié)果與之一致，腸缺血再灌注后，肺組織中SOD活性明顯降低，MDA含量顯著增高，與對照組相比差異非常顯著，提示腸缺血再灌注后產(chǎn)生的氧自由基對肺血管內(nèi)皮和肺泡細(xì)胞膜產(chǎn)生了明顯損傷。

參附注射液具有穩(wěn)定的強心升壓作用，可改善微循環(huán)，防治臟器缺血-再灌注損傷，主要應(yīng)用于創(chuàng)傷、休克及危重病患者的急救［9-12］。參附注射液采用10 mL/kg是根據(jù)臨床使用后換算而來的相關(guān)劑量［13-17］。本研究發(fā)現(xiàn):缺血再灌注組肺內(nèi)組織HO-1表達(dá)增加，肺組織中SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，氧合指數(shù)顯著降低，肺組織出現(xiàn)典型的病理特征；當(dāng)預(yù)防性地給予臨床相關(guān)劑量的參附注射液和腹腔注射血紅素加氧酶的誘導(dǎo)劑血晶素時，肺內(nèi)HO-1表達(dá)明顯增強，肺組織中MDA含量相應(yīng)降低，而SOD活性顯著增高，肺氧合指數(shù)明顯改善［18-21］。組織病理學(xué)改變減輕，結(jié)果表明預(yù)防性應(yīng)用臨床相關(guān)劑量的參附注射液對腸缺血再灌注導(dǎo)致的急性肺損傷有明顯的保護作用，當(dāng)腹腔注射血紅素加氧酶的抑制劑鋅原卟啉IX時，盡管在缺血前預(yù)防性地給予臨床相關(guān)劑量的參附注射液，但各項指標(biāo)與I/R組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其保護作用不再呈現(xiàn)。提示SFI預(yù)處理對I/R肺損傷的保護作用可能與誘導(dǎo)HO-1的肺內(nèi)高表達(dá)有關(guān)。

因此，臨床相關(guān)劑量的參附注射液預(yù)處理減輕了肺組織的病理損傷，從而改善肺功能，提高機體氧輸送能力，改善機體缺氧狀態(tài)，有著廣闊的臨床應(yīng)用前景和實用價值。其機制可能與上調(diào)HO-1蛋白表達(dá)、一定程度上抑制脂質(zhì)過氧化、拮抗氧自由基的損傷有關(guān)，但其保護作用的確切機制尚需進一步研究。

［1］ M oore FA.The rol e of t he gast roi nt est i nal t ract i n post i nj ury m ul t i pl eorgan fai l ure［J］.A m J Surg，1999，178：449-453.

［2］ 夏中元，羅濤，夏芳，等.生脈注射液對腸黏膜再灌注損傷保護作用機制的實驗研究［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2001，21(5)：299-301.

［3］ G uan Y F，Pri t t s TA，M ont rose M H.Ischem i c post-condit i oni ng t o count eract i nt est i nal i schem i a/reperfusi on i nj ury［J］.W orl d J G ast roi nt estPat hophysi ol，2010，1(4)：137-143.

［4］ K oj i It o，H i sashi O zasa，N aosuke，et al.pharm acol ogi cal precondi t i oni ng prot ect s l ung i nj ury i nduced by i nt est i nal i schem i al/reperfusi on i n rat［J］.Shock，2003，19(5)：462-468.

［5］ Park Y Y.Ischem i a/reperfusi on l ung i nj ury i ncreases serum ferri t i n and hem e oxygenase-1 i n rat s［J］.K orean J Physi ol Pharm acol，2009，13(3)：181-187.

［6］ N am ba F，G o H，M urphy JA，etal.Expressi on l eveland subcel l ul ar l ocal i zat i on of hem e oxygenase-1 m odul at es i t s cyt oprot ect i ve propert i es i n response t o l ung i nj ury：a m ouse m odel［J］.PLo S O ne，2014，9(3)：51-57.

［7］ Sant os CH，G om es O M，Pont es JC，et al.The i schem i c precondi t i oni ng and post condi t i oni ng effect on t he i nt est i nal m ucosa of rat s undergoi ng m esent eri c i schem i a/reperfusi on procedure［J］.A ct a Ci r Bras，2008，23(1)：22-28.

［8］ Tam i on F，Ri chard V，Renet S，et al.Int est i nal precondi t i oni ng prevent s i nfl am m at ory response by m odul at i ng hem e oxygenase-1 expressi on i n endot oxi c shock m odel［J］.A m J Physi ol G ast roi nt est Li ver Physi ol，2007，293(6)：1308-1314.

［9］ 任莉莉，問明，季靜，等.參附注射液聯(lián)合細(xì)胞因子對人慢性髓性白血病細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)生成的影響［J］.西部中醫(yī)藥，2014，27(7)：4-8.

［10］孫許寶，方堅，趙秋生.參附注射液聯(lián)合多巴胺注射液對急性失血性休克患者圍術(shù)期血流動力學(xué)和組織代謝的影響［J］.河北中醫(yī)，2006，28(11)：809-811.

［11］薛建軍，張凌云，譚萍.參附注射液對心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究進展［J］.西部中醫(yī)藥，2011，24(10)：98-101.

［12］金湯.參附注射液治療低血容量休克31例［J］.中醫(yī)藥信息，2002，19(5)：43.

［13］張丹琦，劉丕弘.參附注射液對高齡病人手術(shù)期循環(huán)功能的保護效應(yīng)［J］.中醫(yī)藥信息，2009，26(3)：43-44.

［14］王晨，杜自忠.參附注射液聯(lián)合前列地爾治療血管成形術(shù)后缺血再灌注損傷44例［J］.西部中醫(yī)藥，2014，27(2)：97-99.

［15］薛建軍，張凌云，賈國龍.參附注射液對心肌缺血再灌注老年大鼠N F-κB p65及CO X-2表達(dá)的影響［J］.西部中醫(yī)藥，2012，25(8)：14-16.

［16］薛建軍，呼薈茹，齊兵獻(xiàn)，等.參附注射液對心肌缺血再灌注老年大鼠N F-κB及IκB-α表達(dá)的影響［J］.西部中醫(yī)藥，2013，26(2)：18-21.

［17］王冠，曹德晨，張國斌，等.參附注射液對重型顱腦損傷亞低溫治療患者顱內(nèi)壓、血生化指標(biāo)及神經(jīng)功能的影響［J］.河北中醫(yī)，2013，35(5)：737-740.

［18］張志剛，孫國棟.參附注射液對阿霉素所致心衰大鼠氧化應(yīng)激水平及血管緊張素Ⅱ的影響［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2016，13(1)：21-24.

［19］趙振河.參附注射液輔助治療新生兒缺氧缺血性腦病合并微循環(huán)障礙39例［J］.中醫(yī)藥信息，2007，24(3)：39-40.

［20］鄒捍東，周青山，周晨亮等.參附注射液對膿毒癥患者心肌損傷的保護作用［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，9(13)：77-78.

［21］陳榕，夏中元，孟慶濤.參附注射液對體外循環(huán)心內(nèi)直視術(shù)中心肌損傷的保護的M et a分析［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，11(18)：96-103.

Preconditioning Effects of ShenFu Injection in Clinical Dosage on Acute Lung Injury of the Rats with Intestinal Ischemia-reperfusion

LIU Zhigang,FU Xiangyun,LIU Yongfang,HU Gang,XIE Hengtao
Anesthesia Department of People's Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective：To investigate the preconditioning effects of ShenFu Injection on acute lung injury of the rats with intestinal ischemia-reperfusion.Methods：Rat model with acute lung injury was prepared by intestinal ischemia-reperfusion.Forty rats were randomized into five groups,eight rats each group.The control group(group C)：superior mesenteric artery(SMA)was only separated but not blocked;injury group(I/R group)：SMA was blocked for one hour,and reperfusion for two hours,femoral vein received the injection of equivalent amounts of physiological saline as the control;ShenFu injection preconditioning group(SFPR group)：ShenFu injection,10 mL/kg, was pumped from femoral vein one hour before SMA was blocked;hemin group：the rats accepted peritoneal injection of hemin,75 μmol/kg,24 hours before SMA was blocked.ZnppIX+SFPR group：the rats received peritoneal injection of IX(20 mg/kg)24 hours before SMA was blocked,and subsequent operation was the same as SFPR group.The rats accepted peritoneal injection of physiological saline in the same amounts before the operation,and sacrificed by carotid artery bleeding in two hours after reperfusion.HO-1 expressions in lung tissues,the contents of MDA and SOD,the influences of lung permeability index,artery blood gas and W/D ratio were observed.Results：Compared with I/R group,HO-1 positive expressions raised in lung tissues of SFPR and Hemin groups,while lowered in ZnppIX+SFPR group(P＜0.05).Lung permeability index,the contents of MDA and W/D ratio decreased significantlyin SFPR and Hemin groups,SOD raised obviously(P＜0.05);compared with group C,lung permeability index,the contents of MDA and W/D ratio increased notably in I/R group,while SOD contents decreased notably (P＜0.05);PaO2and PaCO2decreased remarkably in other groups compared with group C(P＜0.05),while PaO2and PaCO2in SFPR and Hemin groups were higher than I/R group.Conclusion：Preconditioning by clinical use of ShenFu injection can significantly relieve acute lung injury induced by I/R in intestine,and the underlying mechanism could be associated with up-regulation of HO-1,inhibiting lipid peroxidation and oxidation injury antagonism.

reperfusion injury;lung;intestinal mucosa;heme oxygenase-1;ShenFu injection

R285.5

A

1004-6852(2016)10-0026-04

2016-02-27

劉志剛(1977—)，男，博士學(xué)位，副主任醫(yī)師。研究方向:圍術(shù)期臟器保護。