劉福和，倪文娟，王國康，徐權(quán)毅

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2.華東寧波醫(yī)藥有限公司，浙江 寧波 315806）

當(dāng)歸補血湯對大鼠腎缺血－再灌注損傷后T L R4／N F－ B信號通路的影響

劉福和1，倪文娟2，王國康1，徐權(quán)毅1

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2.華東寧波醫(yī)藥有限公司，浙江 寧波 315806）

目的 探討當(dāng)歸補血湯對大鼠腎缺血－再灌注損傷(RIRI)后TLR4／NF－ B信號通路的影響，為RIRI的作用機制及其干預(yù)提供參考。方法 將45只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組（Sham組）、缺血－再灌注模型對照組（IR組）、當(dāng)歸補血湯預(yù)處理組（IR＋DG組），每組15只。實驗前5 d，Sham組和IR組以生理鹽水10 mL／(kg·d)每天灌胃1次，IR＋DG組以當(dāng)歸補血湯10 mL／(kg·d)每天灌胃1次。所有大鼠均切除右腎，Sham組僅游離左腎蒂，不夾閉左腎動脈；IR組和IR＋DG組均行RIRI模型制備。比較各組血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平，行腎臟組織形態(tài)學(xué)檢查及腎小管評分，檢測腎組織TLR4，NF－ B p65 mRNA水平。結(jié)果 各組均按預(yù)定方案完成手術(shù)，IR組、IR＋DG組大鼠均順利完成RIRI模型制備；IR組、IR＋DG組血清Cr，BUN水平及腎組織中TLR4 mRNA和NF－ B p65 mRNA的表達水平均高于Sham組(t＝3.72～7.05，P＜0.05或 P＜0.01)，IR＋DG組血清Cr，BUN水平及腎組織中TLR4 mRNA和NF－ B p65 mRNA的表達水平均低于IR組(t＝4.16～5.37，P＜0.05)；Sham組腎臟呈正常的組織結(jié)構(gòu)，IR組、IR＋DG組均呈程度不一的炎性反應(yīng)，但 IR＋DG組炎性程度輕于 IR組；IR組、IR＋DG組腎小管評分均高于 Sham組水平(tIR＝9.02，tIR＋DG＝6.21，P＜0.01)，IR＋DG組腎小管評分低于IR組(tIR＝5.15，P＜0.05)。結(jié)論 大鼠RIRI后可能通過TLR4／NF－ B信號通路介導(dǎo)下游級聯(lián)炎癥免疫反應(yīng)，當(dāng)歸補血湯預(yù)處理可能通過抑制TLR4／NF－ B信號通路而緩解RIRI損傷過程中的炎性反應(yīng)，對大鼠RIRI損傷具有積極的保護作用。

缺血－再灌注損傷；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；免疫炎性反應(yīng)；當(dāng)歸補血湯；干預(yù)；大鼠

腎臟是哺乳動物的高灌注器官，對缺血及缺血－再灌注均比較敏感，腎缺血－再灌注損傷(RIRI)是臨床常見的病理現(xiàn)象[1]。免疫炎性反應(yīng)在RIRI的發(fā)病機制中可能有重要作用[2]。近年來發(fā)現(xiàn)的一類細胞表面信號傳導(dǎo)跨膜受體，即Toll樣受體(TLRs)是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，可通過激活核因子－κB（NF－κB)上調(diào)炎癥介質(zhì)表達，進而介導(dǎo)下游的級聯(lián)炎癥免疫反應(yīng)[2－3]。前期實驗研究[4]及臨床實踐表明，當(dāng)歸補血湯對腎臟具有較好的保護作用，但其作用機制尚未完全闡明?；诖?，筆者探討了當(dāng)歸補血湯對大鼠腎RIRI后 Toll樣受體4(TLR4)／NF－κB信號通路的影響，旨在為闡述當(dāng)歸補血湯對RIRI的可能的保護機制提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試藥及引物

動物：健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量230～260 g，鼠齡8～12周，SPF級，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，實驗前常規(guī)分籠飼養(yǎng)至少7 d。

試藥：當(dāng)歸（河南省宛西制藥股份有限公司，批號為080303）6 g，黃芪（河南省宛西制藥股份有限公司，批號為090203）30 g，加蒸餾水煎煮至100 mL(質(zhì)量濃度為0.36 g／mL)備用。

引物：TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄及定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)試劑盒（美國Fermentas）。

目的基因及內(nèi)參所用引物為(5′－3′)β－actin：正向GAAGTACCCCATTGAACACG，反向CAGGTCCAGACGCAGGATGG；TLR4：正向AGACATCCAAAGGAATACAGCAA，反向GCCTTCATGTCTATAGGTGATGC；NF－κB p65：正向GAGAGCCCTTGCATCCTTTA，反向CTTCCCTTTGGTCTTTCTGT，由上海生物工程公司設(shè)計及合成。

1.2 方法

按隨機數(shù)字表法將大鼠分為3組，即假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注模型對照組(IR組)、當(dāng)歸補血湯預(yù)處理組(IR＋DG組)，每組15只。試驗前5 d，Sham組和IR組以生理鹽水10 mL／(kg·d)每天灌胃1次，IR＋DG組以當(dāng)歸補血湯10 mL／(kg·d)每天灌胃1次。大鼠試驗前12 h禁食，自由飲水。予以3.5%水合氯醛10 mL／kg經(jīng)腹腔注射麻醉，沿正中線打開腹腔。所有大鼠均切除右腎，其中Sham組僅游離左腎蒂，不夾閉左腎動脈；IR組和IR＋DG組均使用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈45 min，松開動脈夾再灌注2 h，若腎臟經(jīng)紫黑色變?yōu)榧t色，則提示RIRI模型制作成功[4]，造模不成功的實驗大鼠均予以剔除。

1.3 觀察指標

1.3.1 腎功能生化指標

試驗結(jié)束后，抽取下腔靜脈血5 mL，采用日本Hitachi7170A型自動化生化分析儀測定血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)。

1.3.2 腎臟組織形態(tài)學(xué)及腎小管評分

抽取靜脈血后，切除左腎，縱向剖開，分成2段，一段置－70℃保存?zhèn)溆?；另一段置中性福爾馬林液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋制備病理切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，光鏡下觀察腎小球、腎小管、腎間質(zhì)變化及炎性細胞浸潤情況。采用Paller法[5]進行腎小管評分以評估腎小管損傷程度，×400倍光鏡下在腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)交界部位隨機選取10個視野，每個視野再隨機選取10條腎小管進行評分，其中皮質(zhì)、髓質(zhì)各取1／2。統(tǒng)計100個腎小管計分，計算平均分值。分值越高腎小管損傷越嚴重。

1.3.3 腎組織TLR4，NF－κB p65 mRNA檢測

取保存的另一側(cè)腎組織 80 mg，組織勻漿后采用Trizol法提取腎臟總RNA；依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；以cDNA為模板，按照QRT－PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，采用半定量RT－PCR法擴增TLR4 mRNA，NF－κB mRNA。以目的基因與內(nèi)參β－actin表達量為參照進行相對定量分析。RT－PCR反應(yīng)條件：94℃5 min，94℃30 s，TLR4 mRNA 60℃，NF－κB mRNA 55℃30 s，72℃1 min，72℃5 min，36個循環(huán)。擴增后產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析儀于紫外光下采集圖像。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差(s)表示，正態(tài)分布的計量資料兩組間比較采用配對樣本的LSD－t檢驗，檢驗水準為α＝0.05。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清Cr及BUN

各組均按預(yù)定方案完成手術(shù)，IR組、IR＋DG組大鼠均順利完成腎缺血－再灌注模型制備。IR組、IR＋DG組Cr和BUN水平均高于Sham組(t＝3.72～7.05，P＜0.05或 P＜0.01)，IR＋DG組血清Cr和BUN水平均低于IR組(tCr＝4.16，tBUN＝5.37，P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清Cr及BUN水平比較(s，例，n＝15)

表1 各組大鼠血清Cr及BUN水平比較(s，例，n＝15)

注：與 Sham組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與 IR組比較，cP＜0.05。表2同。

組別Sham組IR組IR＋DG組Cr( mol／L) 25.92±3.76 45.75±4.90b34.21±3.50acBUN(mmol／L) 6.67±0.45 14.95±0.76b10.27±0.53ac

2.2 腎臟組織形態(tài)學(xué)及腎小管評分

經(jīng)HE染色后，光鏡下可見：Sham組腎小球、腎小管呈正常的腎臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)，間質(zhì)內(nèi)未見充血水腫，亦沒有炎性細胞浸潤，見圖1 A；IR組程度不一的腎小球與腎間質(zhì)呈充血像，腎小管上皮細胞不同程度的腫脹、壞死和脫落，管腔擴張，腎間質(zhì)水腫、炎性細胞浸潤明顯，見圖1 B；IR＋DG組腎小球結(jié)構(gòu)無明顯變化，腎小管上皮細胞腫脹、壞死及腎間質(zhì)的水腫輕于IR組，有少量炎性細胞浸潤，見圖1 C。Sham組、IR組、IR＋DG組腎小管評分分別為（85.27±16.50）分、（381.31± 52.32）分、（215.78±30.37）分，可見IR組、IR＋DG組腎小管評分均高于 Sham組(tIR＝9.02，tIR＋DG＝6.21，P＜0.01)，IR＋DG組腎小管評分低于IR組(tIR＝5.15，P＜0.05)。

圖1 HE染色（×400）

2.3 腎組織中TLR4和NF－ B p65 mRNA表達

以β－actin為內(nèi)參，檢測各組腎組織中TLR4 mRNA和NF－κB p65 mRNA的表達，IR組、IR＋DG組腎組織中TLR4 mRNA和NF－κB p65 mRNA的表達水平均高于 Sham組(t＝4.59～8.05，P＜0.05或 P＜0.01)，IR＋DG組腎組織中TLR4 mRNA和NF－κB p65 mRNA的表達水平均低于 IR組(tTLR4＝4.37，tNF－κBp65＝5.36，P＜0.05)。詳見表2。

3 討論

缺血－再灌注損傷是一種多因素、多途徑的復(fù)雜病理生理過程[6]，可能涉及復(fù)雜的發(fā)生進展機制，但目前仍未完全闡明該發(fā)生機制，相關(guān)學(xué)者和學(xué)說試圖闡釋該發(fā)生機制，有細胞內(nèi)Ca2＋超載、氧自由基增加、免疫炎癥因子作用、高能磷酸化合物缺乏、細胞凋亡及無復(fù)流現(xiàn)象等[1－2]，其中免疫炎性反應(yīng)介導(dǎo)的損傷作用被認為是缺血－再灌注損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。

表2 各組大鼠腎組織中TLR4，NF－ B p65 mRNA表達水平比較(s，n＝15)

表2 各組大鼠腎組織中TLR4，NF－ B p65 mRNA表達水平比較(s，n＝15)

組別Sham組IR組IR＋DG組TLR4(×10－3) 0.51±0.09 2.60±0.17b1.43±0.21acNF－ B p65(×10－3) 0.61±0.13 2.81±0.36b1.12±0.23ac

TLR4／NF－κB信號通路在介導(dǎo)下游級聯(lián)炎癥免疫反應(yīng)中具有重要作用。有學(xué)者認為缺血－再灌注損傷是以補體成分錯誤攻擊自身抗原(Ag)為特征的先天性免疫應(yīng)答[7]。TLR4是目前研究較為成熟的一種TLRs，能特異性識別病原體相關(guān)分子模式(PAMP)[8]，通過跨膜結(jié)構(gòu)將病原相關(guān)分子刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞內(nèi)，誘導(dǎo)NF－κB等轉(zhuǎn)錄因子活化激活NF－κB，激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起一系列的炎癥應(yīng)答，促成炎癥的發(fā)生和發(fā)展。阻斷TLR4／NF－κB信號傳導(dǎo)通路有望成為干預(yù)缺血－再灌注損傷的一個重要的治療靶點[9]。

近年來，在缺血－再灌注損傷的干預(yù)研究中，缺血預(yù)處理備受關(guān)注并彰顯出諸多優(yōu)勢。缺血預(yù)處理[10]是指于可能缺血出現(xiàn)前即對組織器官進行短暫、輕微的缺血－再灌注，從而提高細胞、組織和器官對缺血缺氧的耐受程度，一般認為這是經(jīng)啟動組織、細胞自身內(nèi)源性的保護機制而發(fā)揮效應(yīng)的[11]。目前，缺血預(yù)處理的保護作用已被不同的動物及不同的器官模型所證實為可降低缺血－再灌注損傷的有效方法。本研究中，IR＋DG組于大鼠造模前經(jīng)腹腔注入當(dāng)歸補血湯即為缺血預(yù)處理，該方選自金元時期李東垣所著《內(nèi)外傷辨惑論》[12]，僅由當(dāng)歸、黃芪組方，其中重用黃芪以大補脾肺之氣，以資生血之源，與當(dāng)歸并用，養(yǎng)血和營，則陽生陰長，氣血兩旺。兩藥配伍，共著補氣、生血、活血之功，臨床主要用于勞倦內(nèi)傷、氣弱血虛之證。

本研究結(jié)果表明，IR組、IR＋DG組血清Cr和BUN水平，腎小管評分，腎組織中TLR4 mRNA和NF－κB p65 mRNA的表達水平均高于Sham組，腎臟組織形態(tài)學(xué)也呈現(xiàn)出類似的變化，這提示IR組、IR＋DG組腎臟組織形態(tài)、功能出現(xiàn)損傷，TLR4及NF－κB轉(zhuǎn)錄增加，其原因在于造模所致的缺血－再灌注損傷。與IR組比較，IR＋DG組血清Cr和BUN水平、腎小管評分、腎組織中TLR4 mRNA和NF－κB p65 mRNA的表達均較低，提示IR＋DG組缺血－再灌注損傷較輕，分析其原因在于當(dāng)歸補血湯預(yù)處理減輕了缺血－再灌注損傷的程度，這與文獻[12]研究結(jié)果一致，某些中藥成分可以阻斷TLR4／NF－κB信號通路(包括降低其下游關(guān)鍵因子表達)[13－14]，對機體起保護作用。

綜上所述，大鼠腎RIRI后可能通過TLR4／NF－κB信號通路介導(dǎo)下游級聯(lián)炎癥免疫反應(yīng)，當(dāng)歸補血湯預(yù)處理可能通過抑制 TLR4／NF－κB信號通路而緩解缺血－再灌注損傷過程中的炎性反應(yīng)，對大鼠腎RIRI具有積極的保護作用。

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Influence of Danggui Buxue Decoction on TLR4／NF－κB Signal Pathway of Rats after Renal Ischemia Reperfusion Injury

Liu Fuhe1,Ni Wenjuan2,Wang Guokang1,Xu Quanyi1
(1.Pharmacy Faculty of Zhejiang Pharmaceutical College,Ningbo,Zhejiang,China 315100;
2.Huadong Ningbo Medicine Co.,Ltd.,Ningbo,Zhejiang,China 315806)

Objective To investigate the influence of Danggui Buxue Decoction on TLR4／NF－κB signal pathway of rats after renal ischemia reperfusion injury(RIRI),to provide reference for interpretation of its mechanism and intervention.M ethods 45 SD rats were randomly divided into the Sham group,IR group,and IR＋DG group,15 rats in each group.5 d before experiment,rats in Sham group and IR group were orally once a day with normal saline by 10 mL／(kg·d),and rats in IR＋DG group were orally once a day with Danggui Buxue Decoction by 10 mL／(kg·d).All rats were resected right kidney,rats in Sham group were dissociated left renal pedicle,without clamping left renal artery,and rats in IR group and IR＋DG group were all given RIRI model preparation.After experiment,serum creatinine(Cr)and urea nitrogen(BUN),renal histology and renal tubule score,TLR4 mRNA and NF－κB p65 mRNA in renal tissue were compared.Results All groups completed operation according to predetermined plan;IR group and IR＋DG group successfully completed RIRI model preparation.Serum Cr and BUN level,TLR4 mRNA and NF－κB p65 mRNA in renal tissue of IR group and IR＋DG group were both higher than that in sham group(t＝3.72－7.05,P＜0.05 orP＜0.01),and serum Cr and BUN level,TLR4 mRNA and NF－κB p65 mRNA in renal tissue of IR＋DG group were lower than that in IR group(t＝4.16－5.37, P＜0.05).Sham group′s kidney showed normal structure,and there were some inflammatory reactions in IR group and IR＋DG group, yet IR＋DG group′s inflammatory reaction were slighter than that in IR group.Renal tubules score in IR group and IR＋DG group were both higher than that in sham group(tIR＝9.02,tIR＋DG＝6.21,P＜0.01),yet IR＋DG group′s renal tubules score were lower than that in IR group(tIR＝5.15,P＜ 0.05).Conclusion It may mediate downstream cascade inflammatory immune response by TLR4／NF－κB signal pathway after RIRI in rats.Danggui Buxue Decoction pretreatment may relieve inflammatory response during RIRI process by inhibiting LR4／NF－κB signal pathway,thus has positive protection to RIRI.

ischemia reperfusion injury;signal transduction;inflammatory immune response;Danggui Buxue Decoction;intervention;rat

R285.5；R289.5

A

1006－4931(2016)21－0007－04

2016－07－13)

浙江省教育廳科研項目，項目編號：Y201534611。