嚴(yán)正強 楊遠清 盧啟海

茶多酚對人前列腺癌PC-3M細胞中Survivin mRNA和蛋白表達的影響

嚴(yán)正強 楊遠清 盧啟海

目的 探討茶多酚對人前列腺癌PC-3M細胞中調(diào)控細胞凋亡的生存素（Survivin）mRNA和蛋白表達的影響。方法在人前列腺癌PC-3M細胞培養(yǎng)器皿中分別加入用完全培養(yǎng)液稀釋的0、40、60、80μg/ml茶多酚溶液，24、48h后應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測并比較Survivin mRNA、蛋白表達水平。結(jié)果 與0μg/ml組相比，40μg/ml組加入茶多酚48h后Survivin mRNA、蛋白表達水平均明顯下調(diào)（均P＜0.05）；60、80μg/ml組加入茶多酚24、48h后Survivin mRNA、蛋白表達水平均明顯下調(diào)（均P＜0.05），其中80μg/ml組下調(diào)最為明顯（均P＜0.05）；大致呈劑量、時間依賴性（均P＜0.05）。結(jié)論 茶多酚可下調(diào)Survivin mRNA和蛋白表達水平，促進人前列腺癌PC-3M細胞調(diào)亡，在一定范圍內(nèi)呈劑量、時間依賴性。

茶多酚 前列腺癌 PC-3M細胞 細胞凋亡 生存素

茶葉是世界上三大飲品之一，經(jīng)常飲用茶對人體健康有利。國內(nèi)外學(xué)者證實茶多酚具有抗腫瘤、抗基因突變、抗菌消炎、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、降壓、降糖等多種生物學(xué)功能[1-5]。前列腺癌是老年男性高發(fā)的惡性腫瘤，是歐美等發(fā)達國家男性僅次于肺癌的第二大惡性腫瘤[6]，但在中國、日本等長期飲茶的亞洲國家，前列腺癌發(fā)病率遠低于歐美等發(fā)達國家[7-9]。因此，筆者就茶多酚對人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3M細胞中調(diào)控細胞凋亡的生存素（Survivin）mRNA和蛋白表達的影響作一探討，以期為前列腺癌的治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 茶多酚（98%）購自廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，胎牛血清購自依科賽（上海）生物制品有限公司，改良達爾伯克培養(yǎng)基（IMDM）購自美國GIBCO公司，Survivin抗體、β-Actin抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司，Survivin、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。RT-PCR使用美國GeneAmp公司的PCR擴增儀9700型，蛋白電泳使用美國Bio-rad公司的蛋白質(zhì)電泳裝置、電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，數(shù)據(jù)拍照記錄使用上海Tanon凝膠成像系統(tǒng)2500R。

1.2 細胞株及培養(yǎng)條件 人前列腺癌PC-3M細胞株由吉林大學(xué)前列腺防治研究中心饋贈，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2濕化的培養(yǎng)箱中；待細胞融合70%～80%培養(yǎng)孔（瓶）時，將培養(yǎng)液更換為用完全培養(yǎng)液稀釋的茶多酚溶液，其終濃度分別為0、40、60、80μg/ml，24、48h后檢測Survivin mRNA和蛋白表達水平。

1.3 檢測方法

1.3.1 RT-PCR檢測人前列腺癌PC-3M細胞中Survivin mRNA表達水平 加藥處理24、48h后提取細胞總RNA，應(yīng)用半定量RT-PCR方法擴增目的基因Survivin和內(nèi)參基因GAPDH，引物序列見表1。使用GIS凝膠分析軟件進行光密度掃描分析，用Survivin產(chǎn)物與內(nèi)參GAPDH產(chǎn)物的電泳亮度比值表示Survivin mRNA表達水平。

表1 Survivin與GAPDH的引物序列

1.3.2 Western blot檢測人前列腺癌PC-3M細胞中Survivin蛋白表達水平 加藥處理24、48h后收集、提取細胞總蛋白，應(yīng)用Bio-rad法進行定量，取30μg蛋白進行12%聚丙烯酰氨凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉、4℃封閉過夜，含0.05%Tween20的TBS緩沖液（TBST）洗膜3次，室溫加入1∶400兔抗人Survivin抗體，孵育2h，TBST洗膜3次，加入1∶2 000稀釋的羊抗兔IgG/AP，室溫孵育2h，TBST洗膜3次，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/四唑硝基藍溶液顯色。運用GIS凝膠分析軟件進行光密度掃描分析，用Survivin蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白的電泳條帶亮度比值表示Survivin蛋白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。上述實驗步驟重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用表示，多組間比較采用多因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組Survivin mRNA表達水平的比較 與0μg/ml組相比，40μg/ml組加入茶多酚48h后Survivin mRNA表達水平明顯下調(diào)（P＜0.05）；60、80μg/ml組加入茶多酚24、48h后Survivin mRNA表達水平均明顯下調(diào)（均P＜0.05），其中80μg/ml組下調(diào)最為明顯（均P＜0.05），見圖1和表2。茶多酚可從mRNA表達水平下調(diào)Survivin基因轉(zhuǎn)錄，大致呈劑量、時間依賴性（均P＜0.05），見圖2。

圖1 各組SurvivinmRNA表達的電泳圖

表2 各組SurvivinmRNA表達水平比較

圖2 各組SurvivinmRNA表達水平與茶多酚劑量、時間的效應(yīng)圖（a：劑量效應(yīng)；b：時間效應(yīng)）

2.2 各組Survivin蛋白表達水平比較 與0μg/ml組相比，40μg/ml組加入茶多酚48h后Survivin蛋白表達水平明顯下調(diào)（P＜0.05）；60、80μg/ml組加入茶多酚24、48h后Survivin蛋白表達水平均明顯下調(diào)（均P＜0.05），其中80μg/ml組下調(diào)最為明顯（均P＜0.05），見圖3和表3。茶多酚可從蛋白表達水平下調(diào)Survivin基因轉(zhuǎn)錄，大致呈劑量、時間依賴性（均P＜0.05），見圖4。

圖3 各組Survivin蛋白表達的電泳圖

表3 各組Survivin蛋白表達水平比較

圖4 各組Survivin蛋白表達水平與茶多酚劑量、時間的效應(yīng)圖（a：劑量效應(yīng)；b：時間效應(yīng)）

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡密切相關(guān)。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主有序的主動死亡過程。誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡是當(dāng)前今治療癌癥的主要方法[10]。細胞凋亡是一個復(fù)雜的信號傳導(dǎo)、蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）、凋亡抑制蛋白（IAPs）是調(diào)控凋亡反應(yīng)的重要因子，其中Caspase-3是凋亡級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，Tamm等[11]、鄭雪梅等[12]通過體外實驗證實Survivin可抑制Caspase-3的活性。

Survivin是目前發(fā)現(xiàn)最小的IAPs家族成員，由142個氨基酸構(gòu)成，分子量16.5kDa，表達于細胞周期的G2/ M期，定位于細胞有絲分裂的紡錘體。1997年耶魯大學(xué)Ambrosini等[13]通過效應(yīng)細胞蛋白酶受體-1（EPR-1）的cDNA在人類基因組文庫中篩選克隆發(fā)現(xiàn)，它與EPR-1均位于染色體（17q25）的75-130Kb的基因簇上，由3個內(nèi)含子和4個外顯子構(gòu)成，兩者區(qū)別在于EPR-1 mRNA長度為 1.3Kb，Survivin mRNA長度為 1.9Kb。Survivin與其他IAPs家族成員不同之處在于只含有1 個BIR序列，羧基端無環(huán)指結(jié)構(gòu)而是1個由40個氨基酸組成的兩性α-螺旋結(jié)構(gòu)代之。目前研究認為Survivin抗凋亡作用的機制如下：（1）通過BIR分子中的氨基酸殘基Trp67、Pro33和Cys84與Caspase-3、Caspase-7結(jié)合，從而抑制其活性；（2）通過α-螺旋結(jié)構(gòu)與細胞有絲分裂微管結(jié)合，使Survivin與有絲分裂酶CDK1-cyclin B形成復(fù)合體，引起Survivin磷酸化，形成Survivin-Caspase-9復(fù)合物，從而抑制Caspase-9的活性；（3）Survivin與CDK4結(jié)合，引起CDK2-cyclin E的激活和pRB磷酸化，釋放p21，最終導(dǎo)致CDK4與Procaspase相互作用而抑制細胞凋亡。Survivin的表達具有區(qū)域、時相選擇性，在胚胎組織、腫瘤中高表達，在正常組織中不表達或僅少量表達，在癌旁組織中不表達。Tamm等[11]對美國國立癌癥研究院抗癌藥物篩選計劃所選用的60種人腫瘤細胞株檢測發(fā)現(xiàn)均有Survivin表達，且在乳腺癌、肺癌中表達最高，在腎癌中表達最低；國內(nèi)學(xué)者鄭雪梅等[12]研究結(jié)果亦持該觀點。Rohayem等[14]報道在肺癌、結(jié)腸癌患者血清中Survivin抗體明顯增高，提示Survivin可作為肺癌、結(jié)腸癌的標(biāo)志物。Duffy等[15]實驗表明膀胱癌患者尿液中可檢測出Survivin抗體，因此Survivin亦可用于膀胱癌早期診斷及預(yù)后判斷。由于Survivin在腫瘤組織中表達的特異性和本身結(jié)構(gòu)的特殊性，即其唯一的BIR區(qū)若發(fā)生cys84→ala84A突變或THr34→Ala形成Survivin（T34A）則將喪失抑制凋亡的能力[8，10]，Survivin靶向阻斷的抗腫瘤治療具有無可替代的優(yōu)勢[16]：（1）Survivin靶向阻斷可促進腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖，而正常組織不受影響；（2）由于Survivin與EPR-1位于染色體（17q25）的同一基因簇，且兩者編碼序列廣泛互補，故通過2個天然反義轉(zhuǎn)錄物的相互作用可以調(diào)節(jié)細胞凋亡；（3）由于Survivin基因突變體的存在，將其轉(zhuǎn)染至細胞體內(nèi)，亦可調(diào)節(jié)細胞凋亡。

之前有研究證實不同濃度的茶多酚作用于人前列腺癌PC-3M細胞后，細胞凋亡明顯增強[17]；本研究亦證實茶多酚可從mRNA和蛋白表達水平下調(diào)Survivin基因轉(zhuǎn)錄，從而能促進人前列腺癌PC-3M細胞的凋亡，在一定范圍內(nèi)呈劑量、時間依賴性。

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Effect of tea polyphenols on mRNA and protein expression of survivin in prostate cancer PC-3M cells

YAN Zhengqiang,YANG Yunqing,LU Qihai.Department of Urology，Ningbo Medical Center Lihuili Eastern Hospital，Ningbo 315103,China

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of tea polyphenols on the mRNA and protein expression of survivin in prostate cancer PC-3M cells. Methods Human prostate cancer PC-3M cells were treated with 40,60,80μg/ml tea polyphenol for 24h or 48h,the mRNA and protein expression of survivin in PC-3M cells were detected by RT-PCR and western blot, respectively. Results The mRNA and protein expression of survivin in PC-3M cells treated with 60μg/ml and 80μg/ml for 24h and 48h was significantly decreased in a dose-dependent and time-dependent manner(P＜0.05). Conclusion Tea polyphenols can promote apoptosis of human prostate cancer PC-3M cells,which is related to the down-regulation of survivin gene transcription and translation.

Tea polyphenolProstate cancerPC-3Mcells Apoptosis Survivin

2016-04-11）

（本文編輯：陳丹）

315103 寧波市醫(yī)療中心李惠利東部醫(yī)院泌尿外科（嚴(yán)正強、楊遠清）；廣西科技大學(xué)附屬柳州市人民醫(yī)院泌尿外科（盧啟海）

嚴(yán)正強，E-mail：mqyz@tom.com