陳軍 續(xù)力云 劉超武 竺王玉 陸暢暢 胡曉斐 樂涵波

MMP12 mRNA在人肺腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

陳軍 續(xù)力云 劉超武 竺王玉 陸暢暢 胡曉斐 樂涵波

目的 檢測(cè)MMP12 mRNA在人肺腺癌組織中的表達(dá)，探討其與臨床病理特征的關(guān)系。方法 收集肺腺癌患者腫瘤組織樣本39例，每例患者另取癌旁組織作為對(duì)照，應(yīng)用real-time PCR技術(shù)，分別以GAPDH、RPLP0、PUM1、HPRT1和TBP為內(nèi)參基因分析肺腺癌腫瘤組織及癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平。擴(kuò)大樣本至103例，以PUM1為內(nèi)參基因分析肺腺癌腫瘤組織及癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平及MMP12 mRNA表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系。 結(jié)果 肺腺癌腫瘤組織相對(duì)于癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平上調(diào)者所占比例較表達(dá)水平無改變或表達(dá)水平下調(diào)者增高，且以PUM1為內(nèi)參基因檢測(cè)肺腺癌腫瘤組織MMP12 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織（P＜0.05），且MMP12 mRNA在男性患者（男性vs女性，2.07±3.25 vs 0.53±2.90，P＜0.05）、病理亞型為實(shí)性/微乳頭狀生長(zhǎng)為主浸潤(rùn)性腺癌（實(shí)性/微乳頭狀生長(zhǎng)為主vs附壁樣/乳頭狀/腺泡狀生長(zhǎng)為主，3.30±2.95 vs 0.75±3.20，P＜0.05）中表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論 MMP12 mRNA在肺腺癌腫瘤組織中表達(dá)水平上調(diào)，可能參與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展，且性別可能作為肺腺癌腫瘤組織MMP12 mRNA表達(dá)水平上調(diào)的危險(xiǎn)因素。

MMP12 mRNA 肺腺癌 病理亞型 性別

肺癌是全球范圍內(nèi)主要的癌癥死亡原因，而非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的85%左右[1]。近年來，肺腺癌發(fā)病率越來越高，已取代鱗癌成為肺癌最常見的病理類型[2]。2011年國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)/美國(guó)胸科協(xié)會(huì)/歐洲呼吸協(xié)會(huì)對(duì)肺腺癌不同病理亞型進(jìn)行了分類[2]，為肺腺癌的診斷、治療及預(yù)后提供了依據(jù)。雖然肺腺癌在診斷及治療方面不斷完善，但其總體預(yù)后仍不佳[3]。目前已有大量研究提出了分子標(biāo)志物在肺腺癌的診斷、治療及預(yù)后評(píng)價(jià)中的價(jià)值[3-5]。然而，肺癌是一種伴有多個(gè)主要信號(hào)通路改變的具有高度異質(zhì)性的復(fù)合疾病[6]，因此仍需要探索新的分子標(biāo)志物來預(yù)測(cè)其預(yù)后及提供新的治療靶點(diǎn)。

Matrix metallopeptidase 12（MMP12）是鋅依賴型肽鏈內(nèi)切酶家族中的一種基質(zhì)金屬蛋白酶，對(duì)NSCLC的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值[7]。本實(shí)驗(yàn)通過real-time PCR技術(shù)檢測(cè)不同病理亞型肺腺癌患者腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織MMP12 mRNA的表達(dá)，探討其與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)MMP12在肺腺癌的診斷、治療及預(yù)后中的價(jià)值提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2014年1月至2015年6月本院收治并經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)的肺腺癌患者腫瘤組織樣本共103例，其中男36例，女67例。所有患者術(shù)前均未行化療、放療或其他腫瘤相關(guān)治療，每例患者另取相應(yīng)癌旁組織作為對(duì)照。所取標(biāo)本均經(jīng)過患者及醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2 試劑和儀器 RNA提取試劑盒（mirVana RNA PARIS Kit，美國(guó)Life公司）、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司）、real-time PCR試劑盒（日本Takara公司）、7500 real-time PCR儀（美國(guó)ABI公司）、低溫離心機(jī)（美國(guó)PE公司）。

1.3 引物的設(shè)計(jì)和合成 所有引物序列均引用于Pubmed、Nucletide Tools，其序列均來自各基因轉(zhuǎn)錄本的編碼序列，且所有引物設(shè)計(jì)條件均滿足以下條件：引物長(zhǎng)度為17～25bp，GC含量保持在45%～55%，熔鏈溫度為60℃左右，A、C、G、T堿基分布均勻。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。MMP12及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、核糖體磷酸化蛋白大亞基P0（Ribosomal Protein Lateral Stalk Subunit P0，RPLP0）、短小桿菌RNA結(jié)合蛋白家族成員1（Pumilio RNA Binding Family Member 1,PUM1）、次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶1（Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1，HPRT1）、TATA框結(jié)合蛋白（TATA-Box Binding Protein，TBP）等5個(gè)內(nèi)參基因引物序列見表1。

表1 MMP12及內(nèi)參基因引物序列

1.4 總RNA提取及cDNA合成 取適量肺腺癌患者腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織，在液氮中研磨成粉末，用TRIzol法提取組織總RNA，并溶于DEPC水中保存，經(jīng)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。

1.5 應(yīng)用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)MMP12 mRNA表達(dá) 先采用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)2014年1至6月39例肺腺癌患者腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織的MMP12 mRNA表達(dá)，擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性15s，95℃30s，60℃15s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸30s。分別以GAPDH、RPLP0、PUM1、HPRT1、TBP等5個(gè)基因?yàn)閮?nèi)參基因，計(jì)算各樣本組織ΔCt值（MMP12 Ct值-各內(nèi)參基因Ct值），采用2-ΔCt法，計(jì)算MMP12 mRNA相對(duì)表達(dá)量（relative quantity of expression，RQ）。通過公式FC= RQ腫瘤/RQ癌旁得到腫瘤組織相對(duì)于癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)差異倍數(shù)（fold changes，F(xiàn)C），轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值log2FC以分析腫瘤組織相對(duì)于癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平。對(duì)于FC≥2，即log2FC≥1，認(rèn)為MMP12 mRNA在腫瘤組織中表達(dá)水平上調(diào)；1/2＜FC＜2，即-1＜log2FC＜1，認(rèn)為MMP12 mRNA在腫瘤組織中表達(dá)水平無變化；FC≤1/2，即log2FC≤-1，認(rèn)為MMP12 mRNA在腫瘤組織中表達(dá)水平下調(diào)。計(jì)算log2FC值分析39例腫瘤組織相對(duì)于癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平。以后進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，對(duì)2014年6月至2015年6月的64例患者以PUM1為內(nèi)參基因，計(jì)算各樣本組織RQ值，將各RQ值轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)值log2RQ對(duì)各樣本組織MMP12 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析。比較103例腫瘤組織及癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平log2RQ，并計(jì)算log2FC值分析腫瘤組織相對(duì)于癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。在分析腫瘤組織及癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平log2RQ時(shí)，以中位數(shù)表示，兩者比較采用秩和檢驗(yàn)；在分析腫瘤組織相對(duì)于癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平log2FC與臨床病理特征關(guān)系時(shí)，以表示，兩者比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同內(nèi)參基因MMP12 mRNA表達(dá)水平的變化 不同內(nèi)參基因分析結(jié)果顯示，肺腺癌腫瘤組織MMP12 mRNA表達(dá)水平上調(diào)者所占比例較表達(dá)水平無改變或表達(dá)水平下調(diào)者增高，見表2。

表2 不同內(nèi)參基因MMP12mRNA表達(dá)水平的變化[例（%）]

2.2 以PUM1為內(nèi)參基因腫瘤組織及癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平的比較 以PUM1為內(nèi)參基因，計(jì)算103例肺腺癌腫瘤組織及癌旁組織log2RQ值。肺腺癌腫瘤組織MMP12 mRNA表達(dá)中位數(shù)為0.085，癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)中位數(shù)為-0.965，肺腺癌腫瘤組織MMP12 mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織（P＜0.05），見圖1。

圖1 103例肺腺癌腫瘤組織及癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平的比較

103例肺腺癌腫瘤組織中，MMP12 mRNA表達(dá)水平上調(diào)者50例（48.6%），表達(dá)水平無改變者30例（29.1%），表達(dá)水平下調(diào)者23例（22.3%），見圖2。結(jié)合圖1-2結(jié)果表明，肺腺癌腫瘤組織MMP12 mRNA表達(dá)上調(diào)。

2.3 MMP12 mRNA表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系 肺腺癌腫瘤組織相對(duì)于癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)水平與患者年齡、吸煙史、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜侵犯、臨床分期差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），與性別和浸潤(rùn)性肺腺癌不同病理亞型之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），在男性患者、病理類型為實(shí)性/微乳頭狀生長(zhǎng)為主的浸潤(rùn)性肺腺癌中表達(dá)水平上調(diào)，見表3。

圖2 103例肺腺癌腫瘤組織MMP12mRNA表達(dá)水平分布圖

表3 MMP12mRNA表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

目前，肺癌是人類發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中肺腺癌是肺癌最常見的病理類型。由于肺癌的高度侵襲性及異質(zhì)性，多數(shù)肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生淋巴結(jié)、血行或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是其預(yù)后較差的主要原因[8]。MMP12 mRNA表達(dá)產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶是一類具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，通過降解細(xì)胞外膠原蛋白及基底膜成分使惡性腫瘤細(xì)胞向相鄰周圍組織浸潤(rùn)、遷移及轉(zhuǎn)移[9]。本研究通過real-time PCR技術(shù)檢測(cè)肺腺癌腫瘤組織及相應(yīng)癌旁組織MMP12 mRNA的表達(dá)情況，探討其與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP12 mRNA在肺腺癌腫瘤組織中表達(dá)水平上調(diào)，并在男性患者和實(shí)性/微乳頭狀生長(zhǎng)為主浸潤(rùn)性腺癌患者中表達(dá)水平上調(diào)。

Vandesompele等[10]研究證實(shí)，同時(shí)使用多個(gè)內(nèi)參基因?qū)晒舛縋CR實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，可有效減少實(shí)驗(yàn)誤差，故本研究中分別以GAPDH、PUM1、RPLP0、HPRT1、TBP為內(nèi)參基因，檢測(cè)肺腺癌腫瘤組織及癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)參基因PUM1，與Soes等[11]研究結(jié)果一致，并以PUM1為內(nèi)參基因，擴(kuò)大樣本量，再次檢測(cè)肺腺癌腫瘤組織及癌旁組織MMP12 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果均顯示MMP12 mRNA在肺腺癌腫瘤組織中表達(dá)水平上調(diào)，與Hofmann等[7]的報(bào)道結(jié)果一致。本研究運(yùn)用多個(gè)內(nèi)參基因?qū)eal-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，而在之前對(duì)MMP12 mRNA的研究中未見有報(bào)道。

MMP12最初被認(rèn)為是由炎性巨噬細(xì)胞所分泌的一種促進(jìn)彈性纖維溶解的金屬蛋白酶[12]。該酶具有廣泛的底物特異性，包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白如纖連蛋白、層粘連蛋白、玻連蛋白、蛋白聚糖、纖維蛋白等，它也能通過水解血纖維蛋白溶酶原生成血管抑素。目前，MMP12 mRNA已被證實(shí)在肺癌、肝癌、大腸癌、外陰癌和胰腺癌等諸多癌癥腫瘤組織中有表達(dá)[7]。Hofmann等[7]報(bào)道MMP12 mRNA的表達(dá)能較好地預(yù)測(cè)NSCLC腫瘤早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。Lv等[13]通過體外細(xì)胞培養(yǎng)研究也證實(shí)，敲除MMP12基因可以有效地抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)。因此，MMP12 mRNA表達(dá)水平上調(diào)提示肺腺癌患者預(yù)后不佳。然而，MMP12 mRNA表達(dá)在不同病理亞型的肺腺癌之間是否存在差異尚未見有報(bào)道。Yoshizawa等[14]提出，肺腺癌新分類是依據(jù)預(yù)后的差異進(jìn)行的組織學(xué)分類，其研究結(jié)果顯示，實(shí)性/微乳頭狀生長(zhǎng)為主的浸潤(rùn)性腺癌其5年無病生存率較附壁樣/乳頭狀/腺泡狀生長(zhǎng)為主的浸潤(rùn)性腺癌低，即預(yù)后較差。本研究通過real-time PCR技術(shù)檢測(cè)不同病理亞型的肺腺癌腫瘤組織及癌旁組織MMP12 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示MMP12 mRNA表達(dá)與浸潤(rùn)性肺腺癌的不同病理亞型密切相關(guān)，在實(shí)性/微乳頭狀生長(zhǎng)為主的浸潤(rùn)性腺癌中表達(dá)水平上調(diào)，從而也提示，MMP12 mRNA表達(dá)水平上調(diào)的肺腺癌預(yù)后較差，與現(xiàn)有研究結(jié)果相一致。此外，本研究通過對(duì)肺腺癌患者臨床特征比較，發(fā)現(xiàn)MMP12 mRNA表達(dá)水平在性別之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在男性肺腺癌患者中表達(dá)水平上調(diào)，提示性別可能作為肺腺癌患者腫瘤組織中MMP12 mRNA表達(dá)水平上調(diào)的危險(xiǎn)因素，且可能提示肺腺癌男性患者預(yù)后較女性患者差。

目前，由于肺腺癌在臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)、生物學(xué)表現(xiàn)、病理分型等方面存在諸多差異，導(dǎo)致診斷及治療方面效果不盡人意，總體預(yù)后仍然欠佳。因此，本研究通過檢測(cè)MMP12 mRNA在浸潤(rùn)性肺腺癌不同病理亞型之間的表達(dá)差異，揭示MMP12可能參與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展，因此檢測(cè)MMP12 mRNA對(duì)于肺腺癌的早期診斷與鑒別診斷，指導(dǎo)治療及預(yù)后評(píng)估具有重要意義，但MMP12 mRNA在肺腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機(jī)制，以及MMP12 mRNA與性別可能存在的相互關(guān)系及性別與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展過程可能存在的聯(lián)系仍需進(jìn)一步研究。

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Expression of MMP12 in human lung adenocarcinoma and its clinopathological significance

CHEN Jun,XU Liyun,LIU Chaowu,etal.Department of Cardiothoracic Surgery,Affiliated Zhoushan Hospital of Wenzhou Medical University,Zhoushan 316021，China

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of MMP12 mRNA in human lung adenocarcinoma and its clinicopathological significance.Methods The expression of MMP12 mRNA was detected with real-time quantitative PCR using GAPDH,RPLP0,PUM1,HPRT1,TBP as reference genes in 39 specimens of lung adenocarcinoma and corresponding pericancerous tissues.The expression of MMP12 mRNA was also detected in 103 samples of lung adenocarcinoma tissue (including above 39 cases)with PUM1 as reference gene.The association between expression of MMP12 mRNA and clinical and pathological characteristics of lung adenocarcinoma was analyzed.Results More adenocarcinoma samples had MMP12 mRNA up-regulated than samples with not-changed or down-regulated MMP12 mRNA,and the expression of MMP12 mRNA was significantly higher in tumor tissues than that in pericancerous tissues(P＜0.05).The rate of MMP12 mRNA expression was significantly higher in male patients than that in females(2.07±3.25 vs 0.53±2.90,P＜0.05),and in invasive solid or micropapillary predominant tumors was higher than that in lepidic,papillary or acinar predominant tumors(3.30±2.95 vs 0.75±3.20,P＜0.05). Conclusion The expression of MMP12 mRNA is up-regulated in lung adenocarcinoma,particularly in male patients,indicating that MMP12 may be associated with occurrence and development of lung cancer.

MMP12 mRNA Lung adenocarcinoma Histopathologicalsubtypes Gender

2016-07-28）

（本文編輯：陳麗）

浙江省科技廳分析測(cè)試科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015C37024）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃重點(diǎn)資助項(xiàng)目（2015ZDA032）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃一般項(xiàng)目（2015KYB411）；舟山市公益類科技項(xiàng)目（2014C31065)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺(tái)計(jì)劃（2016R CB020）；浙江省科技廳省級(jí)公益技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2016C37008）

316021 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬舟山醫(yī)院胸心外科（陳軍、劉超武、樂涵波），細(xì)胞分子生物實(shí)驗(yàn)室（續(xù)力云、竺王玉、陸暢暢、胡曉斐）

樂涵波，E-mail：zslehanbo@163.com