陳鐘樑 李正儀 李紅蕾

慢性酒精暴露對SD大鼠急性腦缺血再灌注后早期海馬齒狀回顆粒下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的影響

陳鐘樑 李正儀 李紅蕾

目的 探討慢性酒精暴露對SD大鼠急性腦缺血再灌注后早期海馬齒狀回顆粒下區(qū)（SGZ）神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的影響。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為正常組（自來水喂養(yǎng)）、對照組[單純大腦中動脈閉塞（MCAO），自來水喂養(yǎng)]和酒精組（酒精暴露后MCAO，6%乙醇水溶液喂養(yǎng)）。正常組于飼養(yǎng)28d后灌注取腦，對照組、酒精組分別于造模后1、3、7d灌注取腦。切取以視交叉前緣至垂體后緣包含海馬區(qū)厚約4mm的組織塊進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色、巢蛋白（Nestin）染色處理；使用圖像分析系統(tǒng)采集圖像，計(jì)算并比較每張切片Nestin陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 HE染色可見對照組、酒精組造模后1d腦組織開始出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，造模后3d達(dá)到高峰，造模后7d開始恢復(fù)，且酒精組更為嚴(yán)重；正常組未見神經(jīng)元損傷。Nestin染色可見對照組造模后1d SGZ Nestin陽性細(xì)胞開始增多，造模后7d達(dá)到高峰；酒精組造模后1d SGZ Nestin陽性細(xì)胞開始增多，3d達(dá)到高峰，造模后7d明顯回落；正常組SGZ可見少量散在分布的Nestin陽性細(xì)胞。酒精組Nestin陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯少于對照組（P＜0.05）。結(jié)論 慢性酒精暴露可明顯抑制MCAO后早期內(nèi)源性NSCs增殖，抑制損傷后神經(jīng)組織自身的修復(fù)，從而導(dǎo)致缺血性腦卒中的預(yù)后不良。

慢性酒精暴露 大腦中動脈閉塞 神經(jīng)干細(xì)胞

研究表明缺血性腦卒中可激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）增殖，并誘導(dǎo)其遷徙、分化，從而促進(jìn)腦卒中后的神經(jīng)再生與功能恢復(fù)[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道長期大量飲酒是腦卒中的常見病因之一，是增加腦卒中后長期病死率的獨(dú)立危險(xiǎn)因子[2]。酒精中毒可能會影響血脂、血壓、紅細(xì)胞、血小板功能、腦局部血流量、心律失常、β-內(nèi)啡肽和鎂離子等，從而間接促使腦卒中的發(fā)生[3-4]。然而目前對腦卒中后影響機(jī)制尚不清楚，故本實(shí)驗(yàn)擬通過研究慢性酒精暴露對大鼠大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后早期內(nèi)源性NSCs增殖的影響，進(jìn)一步闡明長期大量飲酒對大鼠MCAO后的影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康、雄性、清潔級SD大鼠42只，鼠齡2個(gè)月，體重（200±10）g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。75%醫(yī)用乙醇、10%水合氯醛和4%多聚甲醛，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)試劑科提供；兔抗大、小鼠Nestin蛋白多克隆抗體，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供；SAP法檢測試劑盒，由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 將42只SD大鼠隨機(jī)分為正常組6只、對照組（單純MCAO組）18只和酒精組（酒精暴露MCAO組）18只；對照組、酒精組大鼠再分為造模后1、3、7d等3個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1.2.2 動物模型建立 （1）慢性酒精暴露模型的制作：以6%乙醇水溶液作為飲水的唯一來源飼養(yǎng)28d，制作慢性酒精暴露模型；而對照組、正常組均以自來水喂養(yǎng)。（2）MCAO模型的制作：采用改良線栓法制作MCAO模型[5]，造模成功的大鼠左眼虹膜顏色變淺、眼裂變小、瞳孔縮小，右側(cè)偏癱以上肢為甚，提尾懸拉后出現(xiàn)向右旋轉(zhuǎn)。

1.2.3 術(shù)后評分 采用Zea-longa的5級4分法進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)缺損程度評分，即無神經(jīng)功能缺損癥狀為0分；輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展右側(cè)前爪為1分；中度局灶性神經(jīng)功能缺損，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向右側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識水平下降為4分。實(shí)驗(yàn)大鼠評分均≥2分。

1.2.4 標(biāo)本取材與固定 正常組于飼養(yǎng)28d后灌注取腦，對照組、酒精組3個(gè)亞組分別于造模后1、3、7d灌注取腦。使用4%多聚甲醛灌注取腦后，切取以視交叉前緣至垂體后緣包含海馬區(qū)厚約4mm的組織塊，用石蠟包埋固定；按5μm厚度連續(xù)切片，隔五取三，分別進(jìn)行HE染色、巢蛋白（Nestin）染色；使用圖像分析系統(tǒng)采集圖像，隨機(jī)選取每只大鼠3張非連續(xù)切片，隨機(jī)選取每個(gè)部位3～4個(gè)非重疊視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出每張切片Nestin陽性細(xì)胞數(shù)。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重變化及腦大體觀察 3組大鼠飼養(yǎng)28d后，正常組體重為（363.9±8.4）g，大于酒精組的（333.8± 41.5）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與對照組（364.8± 26.4）g比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。酒精組、對照組灌注取腦，MCAO側(cè)半球明顯腫脹，以視交叉前緣向前5mm、向后8mm為肉眼所見腦缺血區(qū)的大體定位，且酒精組更為嚴(yán)重。大鼠腦底、腦凸面均未發(fā)現(xiàn)出血情況。

2.2 腦組織HE染色結(jié)果 正常組神經(jīng)元形態(tài)正常，未見神經(jīng)元損傷。對照組造模后1d可見缺血區(qū)域（基底核外側(cè)區(qū)、頂葉、顳葉）神經(jīng)元部分皺縮呈三角形，部分呈不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞核濃染，胞質(zhì)嗜酸性，中間夾雜一定數(shù)量的正常神經(jīng)元，細(xì)胞周圍間隙增寬，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血；造模后3d缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞大量脫失，腦組織結(jié)構(gòu)變疏松，呈透亮的篩孔狀結(jié)構(gòu)，殘存的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生固縮，核仁不可見，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，間質(zhì)呈空泡樣改變甚至大片破壞；造模后7d缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞大量脫失，殘存的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生固縮，核仁個(gè)別可見，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生，神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞周圍的細(xì)胞間隙明顯增大，間質(zhì)染色變淡，組織稀疏。酒精組造模后1、3、7d細(xì)胞組織學(xué)表現(xiàn)與對照組類似，但神經(jīng)組織損傷相對更重。3組大鼠造模后HE染色結(jié)果，見圖1（插頁）。

2.3 Nestin染色結(jié)果 正常組海馬齒狀回顆粒下區(qū)（subgranular zone，SGZ）可見少數(shù)散在分布的Nestin陽性細(xì)胞，左右兩側(cè)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對照組造模后1d可見SGZ Nestin陽性細(xì)胞開始增多，造模后7d達(dá)到高峰，缺血側(cè)明顯多于對側(cè)（P＜0.05）。酒精組造模后1d可見SGZ Nestin陽性細(xì)胞開始增多，造模后3d達(dá)到高峰，造模后7d明顯回落。酒精組造模后1、3、7d雙側(cè)大腦Nestin+細(xì)胞數(shù)均明顯少于對照組（P＜0.05）。3組大鼠造模后Nestin染色結(jié)果見圖2（插頁），SGZ Nestin陽性細(xì)胞數(shù)見表1。

表1 3組大鼠造模后SGZ區(qū)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)（個(gè)/視野）

3 討論

Nestin屬于第Ⅵ類中間絲蛋白，是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)先祖細(xì)胞中的一種主要細(xì)胞骨架蛋白。研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)胚開始形成、NSCs增殖時(shí)，會出現(xiàn)Nestin表達(dá)；隨著神經(jīng)細(xì)胞的遷移，NSCs逐漸向祖細(xì)胞分化，Nestin表達(dá)逐漸減弱，直至神經(jīng)細(xì)胞遷移完成；出現(xiàn)明顯分化特征時(shí)，Nestin表達(dá)完全停止，并被其他中間纖維蛋白取代[6]。很多研究者把Nestin陽性細(xì)胞近似看作是NSCs。

本研究結(jié)果顯示，對照組大鼠造模后1d可見SGZ Nestin陽性細(xì)胞持續(xù)增多，與王細(xì)林等[7]應(yīng)用Nestin染色研究腦缺血后NSCs激活的實(shí)驗(yàn)結(jié)果“SGZ Nestin陽性細(xì)胞在腦缺血后7d達(dá)到高峰”相同；以上說明MCAO可以誘導(dǎo)NSCs的激活。Shen等[8]亦研究發(fā)現(xiàn)大鼠MCAO后3、7d，大腦多個(gè)部位存在Nestin陽性細(xì)胞。此外，酒精組大鼠造模后亦出現(xiàn)Nestin陽性細(xì)胞增多，在造模3d達(dá)到高峰后開始回落；與Zhao等[9]研究結(jié)果“大劑量慢性酒精暴露（6.4%乙醇水溶液喂養(yǎng)）會加重大鼠腦缺血再灌注損傷”一致；以上提示慢性酒精暴露可以明顯抑制NSCs的激活。對照組、酒精組在MCAO后均出現(xiàn)雙側(cè)SGZ Nestin陽性細(xì)胞增多，且以缺血側(cè)為主；與Jin等[10]研究結(jié)果“一側(cè)腦缺血能啟動雙側(cè)大腦半球的NSCs，且以病灶側(cè)更為明顯”一致。

綜上所述，一側(cè)MCAO可以誘導(dǎo)SD大鼠雙側(cè)NSCs的激活，以缺血側(cè)為主；而大劑量慢性酒精暴露會明顯抑制MCAO后早期內(nèi)源性NSCs的激活與增殖，抑制損傷后神經(jīng)組織自身的修復(fù)，從而導(dǎo)致缺血性腦卒中的預(yù)后不良。

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Effect of chronic alcoholic exposure on endogenous neural stem cells in rat hippocampal dentate gyrus at early stage of acute cerebralischemia and reperfusion

CHEN Zhongliang,LI Zhengyi,LI Honglei.Department of Neurosurgery，Huzhou Central Hospital，Huzhou 313000,China

Objective To investigate the effect of chronic alcoholic exposure on the proliferation of endogenous neural stem cells(NSCs)in rat subgranular zone(SGZ)in hippocampal gyrus at the early stage of acute cerebral ischemia and reperfusion. Methods Forty-two SD rats were divided into 3 groups randomly:6 rats were fed with clean water(normal group), 18 rats underwent middle cerebral artery occlusion(MCAO)/reperfusion and fed with clean water(model group)and 18 rats underwent MCAO/reperfusion and fed with 6%alcoholas(alcohol group).Rats from normal group were sacrificed 28 days after feeding,and rats from model group and alcoholic group were sacrificed at 1,3 or 7 days after establishment of MCAO and reperfusion model,respectively.Brain samples were collected immediately after sacrifice.Brain tissues including hippocampal dentate gyrus were selected for paraffin imbedding and tissue slicing.HE stain was performed to detect the neuron damage,and immunohistochemistry stain was applied to detect the expression of Nestin in brain tissue.Images were obtained by image analysis system and the number of Nestin positive cells in each slice was calculated. Results Based on the HE stain,neuron damage was observed from day 1 after model establishment in model group and alcoholic group,peaked at the day 3 and reduced at the day 7.Neuron damage was not observed in normal group.A few Nestin positive cells were detected in the SGZ of normal group from the immunohistochemistry.In model group,the number of Nestin positive cells increased from day 1 after model establishment,peaked at day 7.And in alcoholic group,the number of Nestin positive cells increased from day 1 after model establishment,peaked at day 3,and reduced at day 7.Compared with model group,the number of Nestin positive cells in SGZ of alcoholic group was significantly reduced(P＜0.05). Conclusion Chronic alcoholic exposure can reduce the proliferation of endogenous NSCs in SGZ,leading to a poor prognosis of cerebral ischemic/reperfusion injuty.

Chronic alcoholic exposure Middle cerebralartery occlusion Neuralstem cells

2016-02-15）

（本文編輯：陳丹）

313000 湖州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科（陳鐘樑）；西安交通大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（李正儀）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（李紅蕾）

李紅蕾，E-mail：honglei2015@foxmail.com