呂晨 郭小文 鄭暉 葉玲 馬千 張娟

●論 著

蛛網(wǎng)膜下腔注射SRT1720對慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠脊髓SIRT1表達和NF-κB去乙酰化調(diào)節(jié)的影響

呂晨 郭小文 鄭暉 葉玲 馬千 張娟

目的 探討蛛網(wǎng)膜下腔注射SRT1720對慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎（CCI）大鼠脊髓沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）表達和活性的影響，以及對NF-κB p65去乙酰化的調(diào)節(jié)作用。方法 將120只雄性SD大鼠采用隨機數(shù)表法分成5組，每組24只，即假手術(shù)組（S）組、坐骨神經(jīng)結(jié)扎組（CCI組）、二甲亞砜（DMSO）組、坐骨神經(jīng)結(jié)扎+低劑量SRT1720治療組（CCI+LD組）和坐骨神經(jīng)結(jié)扎+高劑量SRT1720治療組（CCI+HD組）。其中CCI、DMSO、CCI+LD和CCI+HD組大鼠提前8d蛛網(wǎng)膜下腔預(yù)置給藥導(dǎo)管后建立CCI模型。DMSO組從手術(shù)日起，每天通過蛛網(wǎng)膜下腔預(yù)置細管給予10μl DMSO，而CCI+LD組和CCI+HD組每天分別給予SRT1720 10μg和20μg（溶于10μl DMSO）。在CCI前1d、CCI后1、3和7d各組分別處死大鼠6只，取L4～5段手術(shù)側(cè)脊髓組織，采用熒光法測定沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1）活性，Western blot法測定SIRT1、NF-κB、乙酰化-NF-κB p65（Lys310）水平，并計算各組NF-κB的乙?；剑ㄒ阴；?NF-κB p65/NF-κB）。結(jié)果 與S組比較，CCI和DMSO組在CCI后各時點SIRT1水平和酶活性均顯著下降（均P＜0.01），相反，NF-κB、乙?；?NF-κB p65水平和NF-κB乙?；骄@著升高（均P＜0.01）；而與CCI組比較，CCI+LD和CCI+HD組在CCI后3d、7d SIRT1水平和酶活性均較高（均P＜0.01），NF-κB、乙?；?NF-κB p65（Lys310）水平則較低。其中SRT1720高劑量組在CCI后7d，SIRT1水平和酶活性顯著高于低劑量組（P＜0.01），而NF-κB的乙酰化水平則更低（P＜0.01）。結(jié)論 SRT1720蛛網(wǎng)膜下腔給藥可改善CCI導(dǎo)致的脊髓SIRT1水平和酶活性的降低，抑制NF-κB p65的過高表達和乙酰化。

SRT1720 慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎 沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1 NF-κB去乙?；?/p>

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of intrathecal SRT1720 injection on expression and activity of SIRT1,and deacetylation of NF-κBp65 in rats with chronic constriction injury(CCI). Methods One hundred and twenty male SD rats were randomly divided into five groups with 24 animals in each group:Sham group(S group),CCI group,dimethylsulfoxide(DMSO) group,CCI+LD group and CCI+HD group.Lumbosacral intrathecal(IT)catheter was placed 8d before CCI operation in DMSO, CCI+LD and CCI+HD groups.CCI was induced in all animals except those in S group.10μl DMSO was intrathecally injected q.d via the catheter in DMSO group;10μg and 20μg SRT1720 dissolved in 10μl DMSO was given to rats in CCI+LD and CCI+HD groups.Six rats were sacrificed randomly before and at 1,3,7 d after CCI or sham surgery in each group.The L4～5spinal cord segments were removed for detection of deacetylase activity of SIRT1 by fluorometric kit.The proteins levels of(SIRT1)and NF-κB/Ac-NF-κB p65 were determined by Western blot analysis. Results The deacetylase activity and protein levels of SIRT1 were significantly decreased after operation in CCI and DMSO group at postoperative d1,3 and 7,and the proteins level of NF-κB/Ac-NF-κB p65 were significantly increased(P＜0.01),compared with S group(P＜0.01).Compared with CCI group,the deacetylase activity and protein level of SIRT1 increased,and NF-κB/Ac-NF-κB p65 protein level decreased both in CCI+LDgroup and CCI+HD group at postoperative d3 and d7(P＜0.01).Furthermore,the activity and protein levels of SIRT1 were higher in CCI+HD group and the proteins levels of Ac-NF-κB p65 were lower(P＜0.01)than those in CCI+LD group at postoperative d7(P＜0.01). Conclusion SRT1720 intrathecal injection can improve the down-regulation of spinal SIRT1 deacetylase activity and protein levels in CCI rats,furthermore,it also can inhibit over-expression and acetylation of NF-κB p65.

【 Key words】 SRT1720 Chronic constriction injury Silentmating type information regulation 2 homolog 1 NF-κB Deacetylation

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是由于外周或中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接損傷和功能紊亂所引起，并由傷害性感受通路活動異常導(dǎo)致的一種慢性疼痛，其發(fā)生與維持機制在于神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞對傷害性刺激應(yīng)答后出現(xiàn)了異常記憶并長期存在，這種病理性表觀遺傳改變也正是其難以治愈的主要原因之一。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（silentmating type information regulation 2 homolog 1，SIRT1）是一種依賴于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）Ⅲ型去乙?；福鋵M蛋白/非組蛋白進行去乙?；碛^修飾，進而影響蛋白的生物學(xué)功能。近期多項研究認為SIRT1在NP的病理過程中起著重要作用[1-3]。SRT1720是目前新研制的SIRT1激動劑，前期研究已證實蛛網(wǎng)膜下腔給予SRT1720可有效改善慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎（chronic constriction injury，CCI）大鼠的痛覺敏化[4]，但其具體作用機制尚待進一步明確。筆者建立CCI大鼠模型，通過蛛網(wǎng)膜下腔給予兩種不同劑量的SRT1720，檢測SRT1720對脊髓SIRT1表達和去乙?；富钚?，以及NF-κBp65（Lys310）的乙酰化水平影響，闡述SRT1720改善神經(jīng)病理性疼痛可能的作用機制，為進一步的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 清潔級雄性SD大鼠120只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（滬）2008-0016。體重240～260g，喂飼普通飼料，自由飲水進食，自然節(jié)律采光。SRT1720由美國Selleck公司生產(chǎn)；SIRT1/sir2去乙?；療晒鉁y定試劑盒ver.2由日本CycLex公司生產(chǎn)；多功能酶標(biāo)儀SpectraMax M2由美國美谷分子儀器公司生產(chǎn)；Western blot實驗中兔抗大鼠SRIT1、NF-κB、乙酰化-NF-κB p65（Lys310）單克隆抗體由英國Abcam公司生產(chǎn)，山羊抗兔（二抗）抗體由美國Santa Cruz公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 按隨機數(shù)字表法分為5組：假手術(shù)組（S）組、坐骨神經(jīng)結(jié)扎組（CCI組）、二甲亞砜（DMSO）組、坐骨神經(jīng)結(jié)扎聯(lián)合低劑量SRT1720組（CCI+LD組）和坐骨神經(jīng)結(jié)扎聯(lián)合高劑量SRT1720組（CCI+HD組），每組24只。

1.2.2 蛛網(wǎng)膜下腔預(yù)置管操作 腹腔注射10%水合氯醛300mg/kg麻醉，俯臥位四肢固定于手術(shù)板上，常規(guī)消毒鋪孔巾后取L5～6間隙，縱向切開lcm切口，鈍性分離皮下組織和肌肉，暴露出脊間膜，用5號針尖破膜后用細鋼絲引導(dǎo)PE 10號導(dǎo)管置入，出現(xiàn)鼠尾側(cè)向甩動視為穿刺成功，拔出導(dǎo)絲可見清澈腦脊液流出。將PE 10導(dǎo)管向頭端插入2cm，至脊髓腰膨大段，然后固定導(dǎo)管并縫合傷口，術(shù)后常規(guī)肌肉注射青霉素3萬U預(yù)防感染。大鼠清醒24h后剔除運動功能障礙的大鼠，其余進行后續(xù)實驗。

1.2.3 CCI模型建立 預(yù)置管1周后，腹腔注射2%戊巴比妥鈉40mg/kg進行麻醉，消毒大鼠左下肢，于左側(cè)大腿中部切開，暴露坐骨神經(jīng)，在接近其分叉之前游離出約7mm的神經(jīng)，用4根320的鉻制羊腸線間隔1mm進行松結(jié)扎，要求不阻斷神經(jīng)血供，然后逐層縫合切口。而S組僅暴露坐骨神經(jīng)并游離連接組織，但不做坐骨神經(jīng)結(jié)扎。

1.2.4 SRT1720藥液的配置 分別配置兩種不同劑量的SRT1720溶液，低劑量：將10μg SRT1720溶于10μl二甲基亞砜（DMSO）中；高劑量：將20μg SRT1720溶于10μl DMSO中。

1.2.5 連續(xù)給藥 DMSO組于CCI后12h通過微量注射器經(jīng)預(yù)置導(dǎo)管注射10μl DMSO，注射時間為2min，1次/d；CCI+LD組和CCI+HD分別給予低劑量SRT1720藥液10μl和高劑量SRT1720藥液10μl，給藥方法和頻率同DMSO組。

1.3 脊髓標(biāo)本采集和保存 分別于CCI模型建立前1d、CCI模型建立后1、3、7d隨機抽取6只大鼠，在給藥中點（當(dāng)日給藥后12h）過量烏拉坦注射處死，迅速分離大鼠L4～5段左側(cè)（CCI制備同側(cè)）脊髓組織，置于液氮中保存。

1.4 脊髓SIRT1去乙酰化酶活性測定 通過SIRT1/ sir2去乙?；療晒鉁y定試劑盒ver.2檢測SIRT1活性。按試劑盒說明書要求，分別將各組、各時點脊髓和RVP蛋白裂解液 10μl加入微孔板中與反應(yīng)混合溶液（40μl）混合，在37℃孵育60min后置于熒光酶標(biāo)儀中測量熒光強度（EX：485mm，EM：535nm），最終測量值為熒光強度/蛋白濃度（F485/F535×10-3/μg）。

1.5 脊髓SIRT1、NF-κB、乙?；?NF-κB p65（Lys310）蛋白的檢測 采用Western blot法檢測，脊髓組織于細胞裂解緩沖液中勻漿，14 000r/min離心5min分離提取總蛋白溶液，采用Bradford法測定總蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE膠電泳分離后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉 2h，在4℃條件下與一抗孵育過夜（1∶1 000），經(jīng)TBST洗膜后于室溫下加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液（1∶10 000）中孵育1h，再用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯像。Quantity one軟件分析SIRT1、NF-κB、乙?；?NF-κB p65（Lys310）條帶的平均灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脊髓SIRT1去乙?；富钚运降谋容^ 坐骨神經(jīng)結(jié)扎前各組大鼠脊髓中SIRT1去乙?；富钚运骄鶡o統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）；與S組比較，坐骨神經(jīng)結(jié)扎后1、3、7d，各組大鼠脊髓中SIRT1去乙酰化酶活性水平均下降（均P＜0.01），但CCI+HD組在CCI后7d時，其酶活性水平與S組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與單純CCI組比較，SRT1720給藥各組（CCI+LD和CCI+HD）在CCI后3d和7d脊髓SIRT1去乙酰化酶活性水平均明顯升高（均P＜0.01），但在CCI后1d無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與CCI+LD組比較，CCI+HD組在CCI后3d和7d去乙酰化酶活性水平更高（P＜0.01），詳見表1。

表1 各組大鼠脊髓SIRT1去乙酰化酶活性水平的比較（F485/F535×10-3/μg）

2.2 各組大鼠脊髓SIRT1水平的比較 坐骨神經(jīng)結(jié)扎前各組大鼠脊髓中SIRT1水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）；與S組比較，坐骨神經(jīng)結(jié)扎后1、3、7d，各組大鼠脊髓中SIRT1水平均明顯下調(diào)（P＜0.01）；與單純CCI組比較，SRT1720給藥各組（CCI+LD和CCI+HD）在CCI后3d和7d脊髓SIRT1水平均升高（均P＜0.01），但在CCI后1d無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與CCI+LD組比較，CCI+HD組在CCI后7d SIRT1水平更高（P＜0.01），詳見表2、圖1。

表2 各組大鼠脊髓SIRT1水平的比較（SIRT1/GAPDH灰度值）

圖1 各組大鼠脊髓Western blot測定SIRT1水平比較（GAPDH為檢測的內(nèi)部參照）

2.3 各組大鼠脊髓NF-κB、乙?；?NF-κB p65（Ac-NF-κB，Lys310）水平的比較坐骨神經(jīng)結(jié)扎前各組大鼠脊髓中NF-κB、乙?；?NF-κB p65水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與S組比較，CCI組和DMSO組在CCI后1、3、7d，NF-κB和乙酰化-NF-κB p65水平均升高（P＜0.01），盡管CCI+LD組和CCI+HD組NF-κB水平在各時點同樣升高（P＜0.01），但乙?；?NF-κB p65水平在CCI后3、7d無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與CCI組比較，CCI+LD組和CCI+HD組在CCI后3、7d，NF-κB和乙?；?NF-κB p65水平均較低（P＜0.01），詳見表3。

2.4 各組大鼠脊髓NF-κB乙酰化水平的比較 坐骨神經(jīng)結(jié)扎前各組大鼠脊髓中NF-κB乙?；骄鶡o統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與S組比較，CCI組和DMSO組在CCI后1、3、7d，NF-κB乙酰化水平均升高（均P＜0.01），盡管CCI+LD組和CCI+HD組在CCI后1d的NF-κB乙酰化水平同樣升高（P＜0.01），但NF-κB乙?；皆贑CI后3d則無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而在CCI后7d時，CCI+HD組的NF-κB乙酰化水平已較S組和CCI+LD組更低（P＜0.01），詳見表4。

表3 各組大鼠脊髓NF-κB、乙?；?NF-κB p65（Ac-NF-κB，Lys310）水平的比較（與GAPDH灰度比值）

表4 各組大鼠脊髓NF-κB乙?；降谋容^（乙?；?NF-κB p65/NF-κB灰度比值）

3 討論

NP是軀體感覺系統(tǒng)的疾病或病變直接引起的疼痛，可由外傷和疾病致末梢神經(jīng)、脊髓及以上中樞神經(jīng)某些部位如腦干、大腦皮層等損傷而引發(fā)。最新研究提示疼痛相關(guān)基因和組蛋白的表觀遺傳修飾顯著影響神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞在分化、修復(fù)、突觸重塑等方面的功能，而組蛋白/轉(zhuǎn)錄因子的乙?；揎棻蛔C實在NP的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[5-6]。

SIRT1是依賴于NAD+的去乙?；福瑢M蛋白/非組蛋白進行去乙?；{(diào)控，在抑制細胞凋亡、有機體的能量代謝、線粒體功能保護、抑制炎癥反應(yīng)、抵抗氧化應(yīng)激和延長細胞壽命方面起著關(guān)鍵作用。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中發(fā)現(xiàn)SIRT1的低表達或酶活性的降低與阿爾茲海默病、帕金森病的發(fā)病具有相關(guān)性[7-8]。本研究結(jié)果顯示在大鼠CCI模型建立后1d起至第7天，脊髓組織中的SIRT1水平和SIRT1去乙?；富钚跃@著下調(diào)，在我們前期研究結(jié)果顯示，通過活化SIRT1去乙?；腹δ?，可改善CCI大鼠的機械痛敏和熱痛敏[4，9]，而Yin[2]和Shao[3]在蛛網(wǎng)膜下腔給予SIRT1的天然激動劑——白藜蘆醇后，同樣觀察到CCI大鼠痛覺敏化的行為學(xué)改善，這些研究結(jié)果均提示SIRT1在神經(jīng)病理性疼痛起著重要作用。

SRT1720是新近研發(fā)的一種小分子新藥，和天然植物藥白藜蘆醇一樣，均屬于SIRT1激動劑，但在結(jié)構(gòu)上和白藜蘆醇并不相似。SRT1720在體內(nèi)的代謝時間比白藜蘆醇更長，作用更為特異，其通過活化SRIT1途徑改善線粒體呼吸鏈功能，抑制炎癥細胞浸潤及炎癥因子釋放從而對2型糖尿病、哮喘、阿爾茲海默病等均具有干預(yù)效果[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)膜下腔注射SRT1720可以顯著改善由于CCI誘導(dǎo)的SIRT1蛋白水平和酶活性的降低，而且成劑量相關(guān)性。這與蛛網(wǎng)膜下腔注射白藜蘆醇結(jié)果相似，但這種效應(yīng)在給藥初期（CCI后1d）并不明顯，而在連續(xù)給藥3d后才表現(xiàn)出這一激動效應(yīng)。

既往在闡述SIRT1以及其激動劑是如何參與神經(jīng)病理性疼痛調(diào)控的實驗中，最為關(guān)注的是組蛋白H3的去乙?；{(diào)節(jié)[2-3]，通過這一途徑，可負性調(diào)節(jié)多種疼痛相關(guān)基因的表達。除外組蛋白，SIRT1去乙?；傅牡孜镞€包括多個轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB、AP-1等。Sirtl基因敲除小鼠巨噬細胞中的NF-κB表現(xiàn)為高乙?；?，增加致炎因子基因的表達[12]。在阿爾茨海默病研究中，通過激活小膠質(zhì)細胞SIRT1對NF-κB去乙酰化，可產(chǎn)生顯著的神經(jīng)保護作用。同樣，NF-κB是疼痛病理過程中至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，被致炎刺激活化后，NF-κB從胞漿轉(zhuǎn)入核內(nèi)，和DNA上的κB序列結(jié)合，參與調(diào)控眾多疼痛相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB p65亞單位可在多個賴氨酸位點發(fā)生乙酰化修飾，其中Lys310的乙?；稍鰪奛F-κB的轉(zhuǎn)錄活性[13]。本研究顯示，蛛網(wǎng)膜下腔注射SRT1720后3d，CCI大鼠脊髓中NF-κB的過高表達得到控制，而乙酰化NF-κB p65（Lys310）與NF-κB的比值下降更為顯著，到CCI后7d，高劑量組中脊髓NF-κB p65（Lys310）乙?；缴踔恋陀赟組，據(jù)此，推測SRT1720蛛網(wǎng)膜下腔注射，可能降低脊髓中NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性，進而抑制下游眾多疼痛相關(guān)基因的表達。

結(jié)合我們的前期研究，筆者推測蛛網(wǎng)膜下腔給予SRT1720，通過激動SIRT1去乙?；富钚圆⑻岣咂浔磉_水平，進而抑制CCI所致的疼痛相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65（Lys310）乙?；?，最終減少下游疼痛基因的表達，從而改善CCI大鼠的痛覺敏化。但是，SRT1720的藥理作用尚未完全清楚，SIRT1在神經(jīng)病理性疼痛中的作用可能存在更為廣泛的分子靶點，長期使用SRT1720是否存在神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重并發(fā)癥，這些仍需進一步的研究探討。

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（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

《浙江醫(yī)學(xué)》“病例討論”欄目征稿

根據(jù)廣大讀者的建議，本刊開辟了“病例討論”欄目，論文結(jié)構(gòu)分為“病例摘要”和“討論”兩部分，以期通過對疑難、復(fù)雜或罕見病例的介紹和討論，交流臨床工作經(jīng)驗，幫助廣大臨床醫(yī)師掌握科學(xué)的臨床思維方式，提高各?？坪投鄬W(xué)科的綜合分析判斷能力，進而提高醫(yī)療水平?，F(xiàn)特向廣大臨床醫(yī)師征集相關(guān)病例，具體要求如下。

1病例選擇（1）疑難病例，特別是涉及多學(xué)科、多領(lǐng)域的疑難病例；（2）診斷明確，但病情危重和（或）治療棘手的病例；（3）臨床較罕見的病例。以上病例均需最終獲得明確診斷或成功治療，且臨床資料齊全，并能提供實驗室、影像學(xué)和（或）病理確診依據(jù)。

2寫作格式和要求（1）病歷摘要：分段敘述患者的簡要病史（包括主訴、現(xiàn)病史、既往史等）、入院后體檢情況、輔助檢查結(jié)果、入院后治療方案及病情變化等內(nèi)容；（2）討論：分段記錄各級或各科或各院醫(yī)師對該病例的特點、診斷、鑒別診斷、進一步輔助檢查和治療方案等方面的分析，若為罕見病，則需介紹目前國內(nèi)外關(guān)于該病診治方面的最新進展；（3）列出相關(guān)的國內(nèi)外主要參考文獻；（4）全文字?jǐn)?shù)在3 000字左右。

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本刊編輯部

Effects of intrathecal SRT1720 injection on expressions of SIRT1 and deacetylation of NF-κB in spinal cord in rats with chronic constriction injury

LYU Chen,GUO Xiaowen,ZHENG Hui,et al.Department of Anesthesiology,Zhejiang Provincial Hospital of TCM,Hangzhou 310006,China

2016-01-09）

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（81202823）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2014KYA156）

310006 杭州，浙江省中醫(yī)院麻醉科

張娟，E-mail：zhangjuan8989@hotmail.com