朱昱 顧玲玲 朱敏 張法標 方哲平

HGFK1基因真核表達載體的構建及鑒定研究

朱昱 顧玲玲 朱敏 張法標 方哲平

目的 構建攜帶人HGFK1基因的真核表達載體pcDNA3.1（-）-HGFK1。方法 通過PCR方法從已經構建好的病毒穿梭載體中擴增出HGFK1基因，構建pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表達載體，經PCR、酶切、測序、蛋白表達等方法進行鑒定。結果 PCR、酶切、測序以及蛋白表達證實pcDNA3.1（-）-HGFK1載體序列正確。結論 本研究成功構建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表達載體，可為后續(xù)進行肝癌細胞的生物學研究提供幫助。

基因 HGFK1 載體構建

HGFK1是肝細胞生長因子（HGF）第一個環(huán)狀結構域（K1）的基因表達產物，由Xin等[1]在2000年首次被克隆于HGF的α鏈，是一個由79個氨基酸構成的球形結構。有研究表明，HGFK1可能通過表皮生長因子/表皮生長因子受體（EGF/EGFR）途徑，抑制腫瘤血管生成、阻止腫瘤遠處轉移及拮抗HGF功能，并有效延長實驗動物的生存期[2]。本研究通過克隆人HGFK1基因，構建其重組真核表達載體，轉染至人肝癌HepG2細胞，觀察HGFK1蛋白在HepG2細胞的表達，以期為研究HGFK1的生物學效應和肝癌的基因治療打下基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 克隆載體pGEM-T Easy（美國Promega公司），pcDNA3.1（-）真核細胞表達載體（美國Invitrogen公司），DNA Marker DL100（上海捷瑞生物工程有限公司），RNA提取試劑 Trizol（美國 Invitrogen公司），Lipofectamine 2000陽離子脂質體（美國Invitrogen公司）。T4DNA連接酶Taq DNA聚合酶（美國Thermofisher scientific公司），限制性內切酶XbaⅠ、HindⅢ（美國Thermofisher scientific公司），限制性內切酶XbaⅠ、HindⅢ引物（上海基康生物公司合成），兔抗人HGF抗體（武漢博士德生物工程有限公司），羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司），大腸桿菌菌株DH5a、pDC316-HGFK1病毒穿梭載體（浙江省臺州醫(yī)院中心實驗室保存），人肝癌H ep G2細胞株（復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所）。

1.2 方法

1.2.1 HGFK1基因的克隆 根據HGFK1基因序列設計含有XbaⅠ、HindⅢ限制性酶切位點的引物（上游：5′-TCTAGAAGGATTCTTTCACCCAGGC-3′；下游：5′-CCCAAGCTTCTTGTCGGGATATCTTTCAG-3′），擴增片段長度約為827bp；以本課題組之前合成的pDC316-HGFK1腺病毒表達載體[3]為模板，PCR擴增HGFK1基因，反應條件：95℃預變性2min，94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃總延伸10min，4℃降溫10min；擴增產物包含了HGFK1基因cDNA的編碼區(qū)及部分非編碼區(qū)；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物；自凝膠中回收HGFK1基因，與pGEM-T Easy載體按摩爾比8∶1的比例混合，16℃條件下用T4 DNA連接酶進行連接；連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑取單菌落，行菌落PCR驗證；挑選陽性菌落，提取質粒DNA，用限制性內切酶XbaⅠ和HindⅢ進行雙酶切鑒定，重組質粒行DNA序列分析。

1.2.2 真核表達載體pcDNA3.1（-）-HGFK1的構建以限制性內切酶XbaⅠ和HindⅢ切割重組克隆載體和質粒pcDNA3.1（-），瓊脂糖凝膠電泳；回收2種目的片段，用T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5a；挑選單菌落行菌落PCR驗證，挑選陽性菌落，提取質粒DNA，用限制性內切酶XbaⅠ和HindⅢ進行雙酶切鑒定。

1.2.3 細胞轉染 在HepG2細胞貼壁生長融合至85%～90%時進行細胞轉染，分兩組同時進行（實驗組為轉染重組表達載體pcDNA3.1（-）-HGFK1，陰性對照組為轉染空載體pcDNA3.1（-），以未轉染的HepG2細胞作為空白對照組）：37℃、5%二氧化碳常規(guī)靜置培養(yǎng)HepG2細胞；將5×104個/ml細胞種植于6孔板，培養(yǎng)16h，待細胞融合率達70%時，將4.0μg pcDNA3.1（-）-HGFK1質粒和10μl Lipofectamine 2000分別加至250μl無血清DMEM培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，室溫孵育5min后將兩者混勻，室溫放置20min，再將其加入PBS漂洗后的HepG2細胞，邊加邊輕輕混合。將轉染后的細胞置37℃、5%二氧化碳的孵箱中孵育6h后棄去轉染液，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，至24h，收集部分細胞，用于總RNA抽提。另取部分細胞按1∶10稀釋，將其轉種于另一培養(yǎng)板，再經過24h后，向培養(yǎng)液中加入終濃度為500μg/ml的G418進行抗性篩選，對陽性克隆進行有限稀釋，擴大培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達的細胞株。

1.2.4 HGFK1蛋白檢測 采用Western blot法。取穩(wěn)定轉染pcDNA3.1（-）-HGFK1的HepG2細胞系對數生長期細胞，抽提總蛋白；抽提蛋白10μg，加適量2×上樣緩沖液，經煮沸變性后，行10%SDS-PAGE電泳（120V，180min），切取含目的蛋白凝膠，半干轉膜15V，30min；用5%脫脂奶粉室溫搖床振蕩封閉3h，加入兔抗人HGF多克隆抗體（1∶200），4℃標記過夜，TBST洗滌3次后，標記二抗（1∶1 000），室溫振蕩孵育1h，洗膜顯色，曝光，顯影并定影，成像分析。

2 結果

2.1 HGFK1基因PCR擴增產物鑒定 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，可見約827 bp處有一優(yōu)勢擴增條帶，與預期結果一致，見圖1。

圖1 HG FK1基因PCR擴增產物鑒定電泳圖（1：D L100Ma r k er；2：HG FK1基因）

2.2 HGFK1基因的克隆和鑒定 重組克隆載體轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑選單菌落行PCR驗證，經瓊脂糖凝膠電泳可見約827 bp處有一亮條帶，見圖2。選取陽性菌落，抽提質粒，經SmaⅠ和HindⅢ雙酶切，回收酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳可見約827 bp處有一亮條帶，證明此載體中有大小約為827 bp的外源DNA片段插入，見圖3。重組質粒進行基因測序，序列測定結果與Genebank報道的2.5 kb HGFmRNA的cDNA（M29145）[長度為2576bp，cds=（102，2 288）]報道區(qū)域（43，860）的序列完全相同，表明重組于載體的HGFK1基因片段序列正確。

圖2 p G E M-T-HG FK1菌落PCR驗證電泳圖（1：D L100Ma r k er；2、3、4：陽性菌落HG FK1基因）

圖3 p G E M-T E as y-HG FK1雙酶切后PCR驗證電泳圖（1：D L100Ma r k er；2：p G E M-TE as y載體；3：酶切后的HG FK1基因）

2.3 真核表達載體pcDNA3.1（-）-HGFK1鑒定 將重組好的pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表達載體轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑選單菌落行PCR驗證，經瓊脂糖凝膠電泳可見約827 bp處有一亮條帶，見圖4。選取陽性菌落，抽提質粒，經XbaⅠ和HindⅢ雙酶切，回收酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳可見約827 bp處有一亮條帶，證明此載體中有大小約為827 bp的外源DNA片段插入，見圖5。

圖4 p cDNA3.1（-）-HG FK1菌落PCR驗證電泳圖（1：D L100 Ma r k er；2、3、4：陽性菌落HG FK1基因）

圖5 p cDNA3.1（-）-HG FK1重組質粒雙酶切驗證電泳（1、2：酶切后的p DC316-HG FK1質粒DNA片段；3：D L 200Ma r k er）

2.4 HepG2細胞轉染HGFK1基因鑒定 取實驗組、陰性對照組和空白對照組HepG2細胞提取總 RNA，行PCR。擴增產物經電泳發(fā)現實驗組存在特異性條帶（827 bp），而空白對照組、陰性對照組均無，提示實驗組HepG2細胞已成功轉染重組表達載體pcDNA3.1（-）-HGFK1，且陰性對照組和空白對照組HepG2細胞均無HGFK1mRNA表達，見圖6。

2.5 G418抗性篩選后實驗組細胞 實驗組細胞再培養(yǎng)24h后，向培養(yǎng)液中加入G418進行抗性篩選，得到單克隆細胞，對細胞進行有限稀釋，擴大培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達的細胞株，見圖7-8。

圖6 p CDNA3.1（-）-HG FK1轉染H ep G2細胞PCR驗證電泳圖（1：D L100Ma r k er；2：實驗組；3：陰性對照組；4：空白對照組；5、6、7：β-action）

圖7 脂質體轉染，G418篩選后獲得的單克隆細胞顯微鏡下所見（×100）

圖8 傳代培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達的細胞株顯微鏡下所見（× 50）

圖9 HG FK1基因轉染后H ep G2細胞HG FK1蛋白表達檢測電泳圖（1：蛋白分子量標準；2：實驗組；3：陰性對照組）

2.6 HGFK1基因轉染后HepG2細胞HGFK1蛋白表達檢測 Western blot結果表明，實驗組細胞培養(yǎng)液有大小約為28 kD的蛋白條帶存在，而陰性對照組無蛋白條帶存在，提示HGFK1基因轉染HepG2細胞后可表達HGFK1蛋白，見圖9。

3 討論

原發(fā)性肝癌是指肝和肝內膽管的原發(fā)性惡性腫瘤，目前以肝切除術為代表的外科治療是其首選治療方法[4]。但實際工作中，大部分原發(fā)性肝癌患者在臨床確診時已錯過最佳手術治療時機，且術后復發(fā)率高，術后5年復發(fā)率＞60%。對于原發(fā)性肝癌，除手術治療外，臨床主要還有放射介入治療、全身化療、區(qū)域性化療、免疫治療、中醫(yī)中藥、基因治療等[5]。近年來，隨著分子生物學技術的發(fā)展，腫瘤的基因治療逐漸成為研究重點。目前，已有多種抗腫瘤治療的相關基因被研究，如抑癌基因、自殺基因、抗血管生成基因、炎性細胞因子基因、微小RNA基因等[6]，但總體效果尚不理想。因而，尋找更多更具殺傷腫瘤細胞能力的基因將大大推動基因治療的研究和臨床應用。

隨著對腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移機制的研究不斷深入，學者們逐漸認識到腫瘤新生血管的生成在腫瘤演進過程中具有極其重要的作用[7]。定點清除腫瘤新生血管作為一種嶄新的抗腫瘤戰(zhàn)略具有極為重要的理論與臨床價值。有研究表明，HGFK1在體內可以拮抗HGF誘導的細胞增殖、遷移，且能抑制由血管內皮生長因子或成纖維細胞生長因子所誘導的微血管內皮細胞的增殖和遷移[8]。Shen等[2]研究顯示，重組HGFK1蛋白可在體內、外抑制腫瘤血管生成，作用效果強于血管抑素和內皮抑素重組蛋白。HGFK1蛋白在對大鼠肝癌、結腸癌、非小細胞肺癌等腫瘤的實驗研究中也都取得了令人滿意的效果[9-12]。Lu等[13]研究發(fā)現，HGFK1可有效抑制人臍血管內皮細胞生長、遷移，并在小鼠體內抑制脈絡膜及視網膜新生血管形成。Zhou等[14]研究發(fā)現，表達HGFK1的非小細胞肺癌患者總生存期及無進展生存期顯著長于不表達HGFK1的非小細胞肺癌患者。

在本研究中，筆者沒有直接構建pcDNA3.1（-）-HGFK1載體，而是先構建重組克隆載體pGEM-TEasy-HGFK1，通過PCR、酶切等方法驗證HGFK1基因cDNA已成功插入載體pGEM-TEasy，雙向測序證實序列正確后擴大培養(yǎng)已轉化的感受態(tài)細胞，提取質粒行XbaⅠ和HindⅢ雙酶切，獲得足量的HGFK1基因cDNA，再與pcDNA3.1（-）真核表達載體連接。這樣可使整個實驗設計更為合理、穩(wěn)定。載體pGEM-TEasy是一種高效的克隆PCR物的專用載體。因大部分耐熱DNA聚合酶進行PCR反應時都有在PCR物即cDNA的3’端添加一個“A”的特性，而載體pGEM-TEasy插入處序列的兩側3’端含“T”，因此通過“A-T”堿基配對可使此載體的連接、克隆效率獲明顯提高。pCDNA3.1（-）載體是被廣泛應用的基因真核表達載體之一，其攜帶有較多的酶切位點，因而可根據不同的酶切位點插入大片段外源基因，高效地轉導不同類型的人組織細胞，是目前使用最多的基因治療運載系統(tǒng)之一。構建的pCDNA3.1（-）-HGFK1真核表達載體可以介導HGFK1在真核細胞里持續(xù)長期表達，用于研究對多種細胞的生物學功能的影響。

本課題組前期研究發(fā)現，HGFK1可通過TAK1/p38 MAPK信號通路抑制乳腺癌的骨轉移[15]，還發(fā)現HGFK1基因表達與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移相關，其表達率的高低也顯著影響著肝癌患者的預后[16]。肝細胞癌為典型的具有豐富血管生成的腫瘤，腫瘤血管生長在肝癌增殖、浸潤和轉移中都起重要作用，所以在其生長、浸潤和轉移過程中HGFK1的作用值得期待。通過載體導入HGFK1基因，抑制血管生成從而抑制肝癌細胞生長及轉移，可謂是肝癌治療研究的一種新思路。本研究成功構建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表達載體，并轉染入人肝癌細胞，建立了穩(wěn)定表達HGFK1蛋白的HepG2細胞系，這為下一步開展HGFK1基因表達對人肝癌細胞的生物學影響的相關研究提供幫助。

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Construction and identification of pcDNA3.1(-)-HGFK1 plasmid

ZHU Yu,GU Lingling,ZHU Min,et al.Department of Hepatobiliary Surgery,Taizhou Hospital of Zhejiang Province,Taizhou 317000,China

【 Abstract】 Objective To construct human pcDNA3.1(-)-HGFK1 gene eukaryotic exp ression vector.Methods HGFK1 gene was am p lified by PCR method from the constructed virus shuttle vector,and the pcDNA3.1(-)-HGFK1 eukaryotic exp ression vector was constructed and identified by PCR,enzyme d igestion,sequencing and p rotein exp ression. Results Enzyme d igestion,PCR,sequencing and p rotein exp ression showed the successful construc tion of pcDNA3.1(-)-HGFK1 eukaryotic exp ression vector. Conclusion We construct pcDNA3.1(-)-HGFK1 eukaryotic exp ression vector successfully,which may be used for further study of hepatocellular carcinoma gene therapy.

Gene HGFK1 Vector Construction

2016-04-13）

（本文編輯：李媚）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2014KYB308）；浙江省科技計劃項目（2009C33096）

317000 浙江省臺州醫(yī)院肝膽外科

方哲平，E-mail:z l yzy@y eah.ne t