朱昱 顧玲玲 朱敏 張法標(biāo) 方哲平

HGFK1基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定研究

朱昱 顧玲玲 朱敏 張法標(biāo) 方哲平

目的 構(gòu)建攜帶人HGFK1基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）-HGFK1。方法 通過PCR方法從已經(jīng)構(gòu)建好的病毒穿梭載體中擴(kuò)增出HGFK1基因，構(gòu)建pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表達(dá)載體，經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序、蛋白表達(dá)等方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果 PCR、酶切、測(cè)序以及蛋白表達(dá)證實(shí)pcDNA3.1（-）-HGFK1載體序列正確。結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表達(dá)載體，可為后續(xù)進(jìn)行肝癌細(xì)胞的生物學(xué)研究提供幫助。

基因 HGFK1 載體構(gòu)建

HGFK1是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）第一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域（K1）的基因表達(dá)產(chǎn)物，由Xin等[1]在2000年首次被克隆于HGF的α鏈，是一個(gè)由79個(gè)氨基酸構(gòu)成的球形結(jié)構(gòu)。有研究表明，HGFK1可能通過表皮生長(zhǎng)因子/表皮生長(zhǎng)因子受體（EGF/EGFR）途徑，抑制腫瘤血管生成、阻止腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及拮抗HGF功能，并有效延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存期[2]。本研究通過克隆人HGFK1基因，構(gòu)建其重組真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至人肝癌HepG2細(xì)胞，觀察HGFK1蛋白在HepG2細(xì)胞的表達(dá)，以期為研究HGFK1的生物學(xué)效應(yīng)和肝癌的基因治療打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 克隆載體pGEM-T Easy（美國(guó)Promega公司），pcDNA3.1（-）真核細(xì)胞表達(dá)載體（美國(guó)Invitrogen公司），DNA Marker DL100（上海捷瑞生物工程有限公司），RNA提取試劑 Trizol（美國(guó) Invitrogen公司），Lipofectamine 2000陽(yáng)離子脂質(zhì)體（美國(guó)Invitrogen公司）。T4DNA連接酶Taq DNA聚合酶（美國(guó)Thermofisher scientific公司），限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、HindⅢ（美國(guó)Thermofisher scientific公司），限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、HindⅢ引物（上?；瞪锕竞铣桑?，兔抗人HGF抗體（武漢博士德生物工程有限公司），羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司），大腸桿菌菌株DH5a、pDC316-HGFK1病毒穿梭載體（浙江省臺(tái)州醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室保存），人肝癌H ep G2細(xì)胞株（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所）。

1.2 方法

1.2.1 HGFK1基因的克隆 根據(jù)HGFK1基因序列設(shè)計(jì)含有XbaⅠ、HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)的引物（上游：5′-TCTAGAAGGATTCTTTCACCCAGGC-3′；下游：5′-CCCAAGCTTCTTGTCGGGATATCTTTCAG-3′），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為827bp；以本課題組之前合成的pDC316-HGFK1腺病毒表達(dá)載體[3]為模板，PCR擴(kuò)增HGFK1基因，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min，94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃總延伸10min，4℃降溫10min；擴(kuò)增產(chǎn)物包含了HGFK1基因cDNA的編碼區(qū)及部分非編碼區(qū)；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物；自凝膠中回收HGFK1基因，與pGEM-T Easy載體按摩爾比8∶1的比例混合，16℃條件下用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑取單菌落，行菌落PCR驗(yàn)證；挑選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒行DNA序列分析。

1.2.2 真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）-HGFK1的構(gòu)建以限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ切割重組克隆載體和質(zhì)粒pcDNA3.1（-），瓊脂糖凝膠電泳；回收2種目的片段，用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a；挑選單菌落行菌落PCR驗(yàn)證，挑選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在HepG2細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)融合至85%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分兩組同時(shí)進(jìn)行（實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體pcDNA3.1（-）-HGFK1，陰性對(duì)照組為轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（-），以未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞作為空白對(duì)照組）：37℃、5%二氧化碳常規(guī)靜置培養(yǎng)HepG2細(xì)胞；將5×104個(gè)/ml細(xì)胞種植于6孔板，培養(yǎng)16h，待細(xì)胞融合率達(dá)70%時(shí)，將4.0μg pcDNA3.1（-）-HGFK1質(zhì)粒和10μl Lipofectamine 2000分別加至250μl無血清DMEM培養(yǎng)液中，輕輕搖勻，室溫孵育5min后將兩者混勻，室溫放置20min，再將其加入PBS漂洗后的HepG2細(xì)胞，邊加邊輕輕混合。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置37℃、5%二氧化碳的孵箱中孵育6h后棄去轉(zhuǎn)染液，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，至24h，收集部分細(xì)胞，用于總RNA抽提。另取部分細(xì)胞按1∶10稀釋，將其轉(zhuǎn)種于另一培養(yǎng)板，再經(jīng)過24h后，向培養(yǎng)液中加入終濃度為500μg/ml的G418進(jìn)行抗性篩選，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行有限稀釋，擴(kuò)大培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.2.4 HGFK1蛋白檢測(cè) 采用Western blot法。取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（-）-HGFK1的HepG2細(xì)胞系對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，抽提總蛋白；抽提蛋白10μg，加適量2×上樣緩沖液，經(jīng)煮沸變性后，行10%SDS-PAGE電泳（120V，180min），切取含目的蛋白凝膠，半干轉(zhuǎn)膜15V，30min；用5%脫脂奶粉室溫?fù)u床振蕩封閉3h，加入兔抗人HGF多克隆抗體（1∶200），4℃標(biāo)記過夜，TBST洗滌3次后，標(biāo)記二抗（1∶1 000），室溫振蕩孵育1h，洗膜顯色，曝光，顯影并定影，成像分析。

2 結(jié)果

2.1 HGFK1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，可見約827 bp處有一優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，見圖1。

圖1 HG FK1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定電泳圖（1：D L100Ma r k er；2：HG FK1基因）

2.2 HGFK1基因的克隆和鑒定 重組克隆載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑選單菌落行PCR驗(yàn)證，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見約827 bp處有一亮條帶，見圖2。選取陽(yáng)性菌落，抽提質(zhì)粒，經(jīng)SmaⅠ和HindⅢ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見約827 bp處有一亮條帶，證明此載體中有大小約為827 bp的外源DNA片段插入，見圖3。重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序，序列測(cè)定結(jié)果與Genebank報(bào)道的2.5 kb HGFmRNA的cDNA（M29145）[長(zhǎng)度為2576bp，cds=（102，2 288）]報(bào)道區(qū)域（43，860）的序列完全相同，表明重組于載體的HGFK1基因片段序列正確。

圖2 p G E M-T-HG FK1菌落PCR驗(yàn)證電泳圖（1：D L100Ma r k er；2、3、4：陽(yáng)性菌落HG FK1基因）

圖3 p G E M-T E as y-HG FK1雙酶切后PCR驗(yàn)證電泳圖（1：D L100Ma r k er；2：p G E M-TE as y載體；3：酶切后的HG FK1基因）

2.3 真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）-HGFK1鑒定 將重組好的pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑選單菌落行PCR驗(yàn)證，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見約827 bp處有一亮條帶，見圖4。選取陽(yáng)性菌落，抽提質(zhì)粒，經(jīng)XbaⅠ和HindⅢ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見約827 bp處有一亮條帶，證明此載體中有大小約為827 bp的外源DNA片段插入，見圖5。

圖4 p cDNA3.1（-）-HG FK1菌落PCR驗(yàn)證電泳圖（1：D L100 Ma r k er；2、3、4：陽(yáng)性菌落HG FK1基因）

圖5 p cDNA3.1（-）-HG FK1重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證電泳（1、2：酶切后的p DC316-HG FK1質(zhì)粒DNA片段；3：D L 200Ma r k er）

2.4 HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染HGFK1基因鑒定 取實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組HepG2細(xì)胞提取總 RNA，行PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組存在特異性條帶（827 bp），而空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組均無，提示實(shí)驗(yàn)組HepG2細(xì)胞已成功轉(zhuǎn)染重組表達(dá)載體pcDNA3.1（-）-HGFK1，且陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組HepG2細(xì)胞均無HGFK1mRNA表達(dá)，見圖6。

2.5 G418抗性篩選后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞再培養(yǎng)24h后，向培養(yǎng)液中加入G418進(jìn)行抗性篩選，得到單克隆細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，擴(kuò)大培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，見圖7-8。

圖6 p CDNA3.1（-）-HG FK1轉(zhuǎn)染H ep G2細(xì)胞PCR驗(yàn)證電泳圖（1：D L100Ma r k er；2：實(shí)驗(yàn)組；3：陰性對(duì)照組；4：空白對(duì)照組；5、6、7：β-action）

圖7 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，G418篩選后獲得的單克隆細(xì)胞顯微鏡下所見（×100）

圖8 傳代培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株顯微鏡下所見（× 50）

圖9 HG FK1基因轉(zhuǎn)染后H ep G2細(xì)胞HG FK1蛋白表達(dá)檢測(cè)電泳圖（1：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：實(shí)驗(yàn)組；3：陰性對(duì)照組）

2.6 HGFK1基因轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞HGFK1蛋白表達(dá)檢測(cè) Western blot結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液有大小約為28 kD的蛋白條帶存在，而陰性對(duì)照組無蛋白條帶存在，提示HGFK1基因轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后可表達(dá)HGFK1蛋白，見圖9。

3 討論

原發(fā)性肝癌是指肝和肝內(nèi)膽管的原發(fā)性惡性腫瘤，目前以肝切除術(shù)為代表的外科治療是其首選治療方法[4]。但實(shí)際工作中，大部分原發(fā)性肝癌患者在臨床確診時(shí)已錯(cuò)過最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率＞60%。對(duì)于原發(fā)性肝癌，除手術(shù)治療外，臨床主要還有放射介入治療、全身化療、區(qū)域性化療、免疫治療、中醫(yī)中藥、基因治療等[5]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，腫瘤的基因治療逐漸成為研究重點(diǎn)。目前，已有多種抗腫瘤治療的相關(guān)基因被研究，如抑癌基因、自殺基因、抗血管生成基因、炎性細(xì)胞因子基因、微小RNA基因等[6]，但總體效果尚不理想。因而，尋找更多更具殺傷腫瘤細(xì)胞能力的基因?qū)⒋蟠笸苿?dòng)基因治療的研究和臨床應(yīng)用。

隨著對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究不斷深入，學(xué)者們逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤新生血管的生成在腫瘤演進(jìn)過程中具有極其重要的作用[7]。定點(diǎn)清除腫瘤新生血管作為一種嶄新的抗腫瘤戰(zhàn)略具有極為重要的理論與臨床價(jià)值。有研究表明，HGFK1在體內(nèi)可以拮抗HGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移，且能抑制由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子所誘導(dǎo)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移[8]。Shen等[2]研究顯示，重組HGFK1蛋白可在體內(nèi)、外抑制腫瘤血管生成，作用效果強(qiáng)于血管抑素和內(nèi)皮抑素重組蛋白。HGFK1蛋白在對(duì)大鼠肝癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究中也都取得了令人滿意的效果[9-12]。Lu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HGFK1可有效抑制人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移，并在小鼠體內(nèi)抑制脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜新生血管形成。Zhou等[14]研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)HGFK1的非小細(xì)胞肺癌患者總生存期及無進(jìn)展生存期顯著長(zhǎng)于不表達(dá)HGFK1的非小細(xì)胞肺癌患者。

在本研究中，筆者沒有直接構(gòu)建pcDNA3.1（-）-HGFK1載體，而是先構(gòu)建重組克隆載體pGEM-TEasy-HGFK1，通過PCR、酶切等方法驗(yàn)證HGFK1基因cDNA已成功插入載體pGEM-TEasy，雙向測(cè)序證實(shí)序列正確后擴(kuò)大培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒行XbaⅠ和HindⅢ雙酶切，獲得足量的HGFK1基因cDNA，再與pcDNA3.1（-）真核表達(dá)載體連接。這樣可使整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更為合理、穩(wěn)定。載體pGEM-TEasy是一種高效的克隆PCR物的專用載體。因大部分耐熱DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR物即cDNA的3’端添加一個(gè)“A”的特性，而載體pGEM-TEasy插入處序列的兩側(cè)3’端含“T”，因此通過“A-T”堿基配對(duì)可使此載體的連接、克隆效率獲明顯提高。pCDNA3.1（-）載體是被廣泛應(yīng)用的基因真核表達(dá)載體之一，其攜帶有較多的酶切位點(diǎn)，因而可根據(jù)不同的酶切位點(diǎn)插入大片段外源基因，高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類型的人組織細(xì)胞，是目前使用最多的基因治療運(yùn)載系統(tǒng)之一。構(gòu)建的pCDNA3.1（-）-HGFK1真核表達(dá)載體可以介導(dǎo)HGFK1在真核細(xì)胞里持續(xù)長(zhǎng)期表達(dá)，用于研究對(duì)多種細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，HGFK1可通過TAK1/p38 MAPK信號(hào)通路抑制乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移[15]，還發(fā)現(xiàn)HGFK1基因表達(dá)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)，其表達(dá)率的高低也顯著影響著肝癌患者的預(yù)后[16]。肝細(xì)胞癌為典型的具有豐富血管生成的腫瘤，腫瘤血管生長(zhǎng)在肝癌增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中都起重要作用，所以在其生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中HGFK1的作用值得期待。通過載體導(dǎo)入HGFK1基因，抑制血管生成從而抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，可謂是肝癌治療研究的一種新思路。本研究成功構(gòu)建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞，建立了穩(wěn)定表達(dá)HGFK1蛋白的HepG2細(xì)胞系，這為下一步開展HGFK1基因表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)影響的相關(guān)研究提供幫助。

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Construction and identification of pcDNA3.1(-)-HGFK1 plasmid

ZHU Yu,GU Lingling,ZHU Min,et al.Department of Hepatobiliary Surgery,Taizhou Hospital of Zhejiang Province,Taizhou 317000,China

【 Abstract】 Objective To construct human pcDNA3.1(-)-HGFK1 gene eukaryotic exp ression vector.Methods HGFK1 gene was am p lified by PCR method from the constructed virus shuttle vector,and the pcDNA3.1(-)-HGFK1 eukaryotic exp ression vector was constructed and identified by PCR,enzyme d igestion,sequencing and p rotein exp ression. Results Enzyme d igestion,PCR,sequencing and p rotein exp ression showed the successful construc tion of pcDNA3.1(-)-HGFK1 eukaryotic exp ression vector. Conclusion We construct pcDNA3.1(-)-HGFK1 eukaryotic exp ression vector successfully,which may be used for further study of hepatocellular carcinoma gene therapy.

Gene HGFK1 Vector Construction

2016-04-13）

（本文編輯：李媚）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014KYB308）；浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009C33096）

317000 浙江省臺(tái)州醫(yī)院肝膽外科

方哲平，E-mail:z l yzy@y eah.ne t