徐凱，袁志超，詹澤濤，秦雷，葛宏賀

（武漢新華揚生物股份有限公司，武漢 430086）

屎腸球菌的制備工藝研究

徐凱，袁志超，詹澤濤，秦雷，葛宏賀

（武漢新華揚生物股份有限公司，武漢 430086）

試驗旨在開發(fā)出一套穩(wěn)定成熟的屎腸球菌制備工藝，以活菌收率為指標(biāo)，進行離心、噴霧干燥和包衣工藝的優(yōu)化。試驗結(jié)果表明，屎腸球菌的最佳離心工藝為離心轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1，離心時間10 min；最佳干燥載體為糊精；噴霧干燥的工藝為進風(fēng)130℃，出風(fēng)70℃；包衣的包材選擇為1%海藻糖。試驗通過離心工藝、噴霧干燥工藝和包衣工藝的優(yōu)化，開發(fā)出一套穩(wěn)定的屎腸球菌制備工藝。

屎腸球菌；噴霧干燥；包衣；海藻糖

微生態(tài)制劑作為一種新型的飼料添加劑，發(fā)展非常迅猛，主要原因在于全球各國都開始重視抗生素濫用所造成的危害，在全球無抗化的過程中，微生態(tài)制劑作為抗生素的替代物得到了越來越多的重視[1-3]。屎腸球菌（Enterococcus faecium）具有優(yōu)良的生物學(xué)特性，可以在腸道中迅速形成優(yōu)勢菌群，通過生物奪氧、生物頡頏，增加有益菌數(shù)量，抑制有害微生物的繁殖，增強機體免疫功能，促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，達到提高生長性能、促進動物健康生長的目的[4-5]。目前我國的研究都集中在發(fā)酵工藝的研究和應(yīng)用領(lǐng)域上，本文主要是針對后處理工藝進行研究，通過對離心工藝、噴霧干燥載體及溫度、包衣材料的篩選進行優(yōu)化，以期能夠研究出一條成熟的屎腸球菌后處理工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

屎腸球菌，來自新華揚生物酶研究院菌種室。

1.1.2 發(fā)酵液

發(fā)酵液由發(fā)酵工藝室提供。

1.1.3 主要試劑及原料

YPD培養(yǎng)基、玉米淀粉、海藻糖、普魯蘭多糖、HPMC、PEG4000等。

1.2 試驗設(shè)備

離心機、流化床包衣機XYT-Ⅲ、離心式噴霧干燥塔LPG-5、濕熱箱。

1.3 試驗方法

發(fā)酵液經(jīng)過離心后，加入載體混合均勻制備成待干燥液體，經(jīng)過噴霧干燥后篩分出需要的粒徑大小顆粒，備用；配制好包衣液，對顆粒進行包衣實驗，最后計算收率。

活菌計數(shù)：采用固體平板YPD培養(yǎng)基計數(shù)。離心收率：經(jīng)等量無菌水混勻菌泥后1 mL的菌數(shù)/離心前菌液1 mL的菌數(shù)×100%。

干燥收率：干燥后活菌/干燥前理論活菌× 100%。

包衣收率：包衣后活菌/包衣前理論活菌×100%。

耐熱存活率：濕熱后活菌/濕熱處理前活菌× 100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 離心工藝

不同離心轉(zhuǎn)速和離心時間對離心收率的影響見表1。

菌體細胞的收集方法很多，離心是其中一個比較傳統(tǒng)和成熟的方法，但是不同的菌體對離心過程中產(chǎn)生的離心力耐受性不同，離心轉(zhuǎn)速過高會導(dǎo)致菌體的死亡增多，而離心轉(zhuǎn)速過低會造成上清液中菌體分離不夠完全，因此在離心轉(zhuǎn)速和離心時間兩方面需要進行試驗，以期能得出一個最優(yōu)的離心工藝。

表1 不同離心轉(zhuǎn)速和離心時間對離心收率的影響

由表1可知，在離心轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速為5000r·min-1，離心時間為10 min，離心的收率最高，為99%，基本上沒有損失。分析原因可能是過高的離心轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的離心力較大，對菌體造成傷害，導(dǎo)致其死亡；而過低的轉(zhuǎn)速離心力小，菌體不能完全沉淀下來，導(dǎo)致收率降低。

2.2 干燥工藝

2.2.1 不同載體對屎腸球菌噴霧干燥后儲存穩(wěn)定性的影響

2.2.1.1 常溫保存實驗

不同載體常溫條件下優(yōu)化結(jié)果見表2，常溫條件下糞鏈球菌（不同載體）的存活率見圖1。

表2 不同載體常溫條件下優(yōu)化結(jié)果

圖1 常溫條件糞鏈球菌（不同載體）的存活率

將菌泥稀釋10倍后加載體噴干，理論發(fā)酵液活菌數(shù)為128億個，理論噴干樣品活菌數(shù)為64億個。表2和圖1的結(jié)果中可知，不同載體噴干后的樣品在常溫下放置0、1和4周后菌體存活率有明顯的區(qū)別。常溫放置1周后糊精和海藻糖做為載體得到的樣品中菌體的存活率相對較高，存活率分別為66.41%和67.34%。試驗操作過程中觀察可知，糊精作為載體的樣品收率最高，更好噴干，海藻糖作為載體在放置過程中有結(jié)塊現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.2.1.2 45℃加速保存實驗

不同載體加速（45℃烘箱）條件下優(yōu)化結(jié)果見表3，加速條件下（45℃烘箱）糞鏈球菌（不同載體）的存活率見圖2。

加速實驗的樣品選擇在45℃烘箱中進行放置，通過提高溫度加快菌體的死亡，從而進一步探究不同載體制備糞鏈球菌的穩(wěn)定性。從表3和圖2可知，不同載體樣品之間的存活率差異較大，糊精和海藻糖作為載體的樣品菌體存活率相對較高。并且隨著在烘箱（45℃）中放置時間的延長，菌體存活率呈現(xiàn)下降的趨勢，放置24 h后以糊精和海藻糖作為載體的樣品菌體存活率分別為61.41%和65%，與常溫下放置1周的結(jié)果相吻合。綜合考慮產(chǎn)品收率、成本以及菌體存活率，選擇糊精作為后續(xù)項目實驗樣品制備載體。

表3 不同載體加速（45℃烘箱）條件下優(yōu)化結(jié)果

圖2 加速條件下（45℃烘箱）糞鏈球菌（不同載體）的存活率

2.2.2 噴霧干燥溫度對活菌存活率的影響

不同溫度對噴霧干燥塔干燥后樣品存活率的影響見表4，不同進風(fēng)/出風(fēng)溫度下制備得到樣品的存活率見圖3。

由表4和圖3的結(jié)果可知，當(dāng)干燥溫度較低時，菌體的存活率較高，但是干燥溫度過低則干燥量較低，這會導(dǎo)致產(chǎn)能過低?？刂瞥鲲L(fēng)溫度為70℃時，隨著進風(fēng)溫度從110℃升高到160℃，菌體的存活率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，最適溫度出現(xiàn)在約130℃；控制進風(fēng)溫度為160℃，改變出風(fēng)溫度為80℃，菌體的存活率有明顯下降，表明出風(fēng)溫度不宜過高，但也不能過低，出風(fēng)溫度是樣品能否成功噴出的關(guān)鍵參數(shù)之一。最后綜合考慮選擇進風(fēng)溫度130℃，出風(fēng)溫度70℃噴霧干燥的條件。

表4 不同溫度對噴霧干燥塔干燥后樣品存活率的影響

圖3 不同進風(fēng)/出風(fēng)溫度下制備得到樣品的存活率

2.3 包衣工藝

不同包衣材料對活菌耐熱性的影響見表5。

由表5可知，包衣可以將活菌包裹在一層保護膜下面，使其免受高溫高濕環(huán)境的影響。不同材料保護性能也有差異，因此在前期實驗的基礎(chǔ)上篩選了幾個載體對已篩分過的屎腸球菌顆粒進行包衣實驗，得到樣品后對其進行耐熱性評價。在濕熱環(huán)境下（85℃，10min），海藻糖對屎腸球菌的保護作用是比較好的，存活率達到了40%（在微生態(tài)存活率的概念中，只要有菌體存活就可以在腸道中定植），在后續(xù)的實驗中可以對其用量進行優(yōu)化。

表5 不同包衣材料對活菌耐熱性的影響

3 結(jié)論

從結(jié)果可知屎腸球菌的最佳離心工藝為離心轉(zhuǎn)速5 000 r·min-1，離心時間10 min，最佳干燥載體為糊精，噴霧干燥的工藝為進風(fēng)130℃，出風(fēng)70℃，包衣的包材選擇為1%海藻糖。

[1]劉秀梅,聶俊華,王慶仁.多種微生物復(fù)合的微生態(tài)制劑研究進展[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報,2002,10（4）:80-83.

[2]王前光,高惠林,劉秋.微生態(tài)制劑的研究進展及其在養(yǎng)豬生產(chǎn)上的應(yīng)用[J].飼料廣角,2010（24）:45-47.

[3]王浩波,敖明,哈斯,等.飼用微生態(tài)制劑使用過程中存在的問題及解決措施[J].畜牧與飼料科學(xué),2011（2）:78-79.

[4]王婷婷,李愛科,易建明,等.飼用屎腸球菌的篩選、鑒定及其生物學(xué)特性[J].中國糧油學(xué)報,2013,25（3）:89-93,97.

[5]文靜,孫建安,周緒霞,等.屎腸球菌對仔豬生長性能、免疫和抗氧化功能的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,23（11）:70-73.

Study on the Preparation ofEnterococcus Faecium

XU Kai,YUAN Zhichao,ZHAN Zetao,QIN Lei,GE Honghe

（Wuhan Sunhy Biological Co.,Ltd.,Wuhan 430086,China）

This study aimed to develop a stable and mature preparation process of Enterococcus faecium.The living bacterium yield as the index and the test optimizd the spray drying process,centrifugal process and coating process.The result showed that the best centrifugal process was centrifugation speed 5 000 r·min-1,centrifugation time 10 min,the best drying carrier was dextrin.The process of spray drying was as follows:inlet air 130℃,outlet air 70℃, coating material package 1%trehalose.We could developed a stable excrement enterococcus preparation process throughthe way of optimizationthe spraydryingprocesscoating andcentrifugalprocess.

Enterococcus faecium;spray drying;coating;trehalose

S816.7；Q939.121

A

1001-0084（2016）11-0031-04

2016-10-10

徐凱（1987-），男，湖北黃岡人，碩士，工程師，主要從事發(fā)酵工程的研究。