朱廣偉 李西文 陳士林

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

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專(zhuān)題——現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)在中藥資源研究中的應(yīng)用

白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

朱廣偉 李西文 陳士林

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京，100700)

目的：制備白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。方法：以水為溶劑，以標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，采用UPLC-DAD法測(cè)定芍藥苷含量，并進(jìn)行轉(zhuǎn)移率、出膏率計(jì)算及指紋圖譜研究。結(jié)果：10批次白芍樣品制成的標(biāo)準(zhǔn)湯劑中芍藥苷含量為1.69～2.60 mg/mL，轉(zhuǎn)移率為60.47%～85.16%，平均轉(zhuǎn)移率為71.62%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.74%。出膏率范圍為19.00%～26.50%，平均出膏率為21.89%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.51%。指紋圖譜共有峰11個(gè)，確認(rèn)5個(gè)，分別是：氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷。結(jié)論：本方法處理樣品簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可用于白芍標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

白芍；飲片；標(biāo)準(zhǔn)湯劑；指紋圖譜

白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，主產(chǎn)于安徽、浙江、四川、山東等地。白芍飲片呈圓形薄片，氣微，味微寒、酸，含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷[1-5]等，具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，柔肝止痛[6-8]，平抑肝陽(yáng)的功效，用于治療月經(jīng)不調(diào)，脅痛，腹痛，四肢攣急[9-10]等癥。本研究以市售5個(gè)產(chǎn)地(湖南、安徽、山東、浙江、四川)10批次白芍飲片為材料，以標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑[11]，考察含量、轉(zhuǎn)移率、出膏率范圍，及指紋圖譜研究，為規(guī)范根及根莖類(lèi)飲片的煎煮工藝流程，為白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290高效液相色譜儀，HP真空脫氣泵，HP四元泵，HP自動(dòng)進(jìn)樣，HP柱溫箱，UPLC-DAD檢測(cè)器；WRX-1S型BP110S電子分析天平；Thermo-18色譜柱(1.5 mm×210 mm，2.6 μm)。

1.2 受試藥物 芍藥苷(含量≥98%，批號(hào)130815)，購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。白芍購(gòu)自河北省安國(guó)藥材市場(chǎng)，分別產(chǎn)自湖南(一等品至三等品)、安徽亳州(一等品至四等品)、浙江、山東、四川，經(jīng)DNA條形碼技術(shù)鑒定均為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根。見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇配制成含芍藥苷0.54 mg/mL的對(duì)照品溶液，至于冰箱中，4 ℃保存，備用。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 白芍飲片 乙醇提取液制備精密稱(chēng)取表1各批次白芍飲片5 g，按照2015版《中華人民共和國(guó)藥典》制備各樣品溶液。

表1 樣品來(lái)源

2.2.2 白芍飲片標(biāo)準(zhǔn) 湯劑的制備精密稱(chēng)取表1各批次白芍飲片100 g，分別加7倍量的水，先浸泡30 min，煮沸60 min，過(guò)濾分離出煎煮液，最后再加6倍量水煎煮40 min。合并煎煮液，濃縮成500 mL溶液，即濃度為0.2 g/mL的原藥材溶液，取該濃縮液1 mL至10 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，靜置20 min，分出上清液，即得供試品，進(jìn)樣前用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

2.3 色譜條件 色譜柱為T(mén)hormo-18色譜柱(2.1 mm×150 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相為乙腈(B)-0.1%醋酸水溶液(A)，梯度洗脫，0～6 min，5%～15%B，6～11 min，15%～20%B，11～15 min，20%～25%B，15～21 min，25%～40%B，21～26 min，40%～50%B，26～27 min，50%～95%B，體積流量0.4 mL/min，進(jìn)樣量3 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm，色譜如見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 芍藥苷對(duì)照品UPLC-DAD色譜圖

圖2 白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC-DAD色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1”中對(duì)照品溶液0.2 μL、0.4 μL、0.6 μL、0.8 μL、1.0 μL分別加到5 mL容量瓶中，定容至刻度。按2.3色譜條件測(cè)定各成分的峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度考察 取同一批白芍供試品溶液，按照2.3色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)6次，測(cè)定并計(jì)算芍藥苷峰面積的RSD值。RSD分別為0.4%，表明儀器精密度良好。見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取白芍飲片適量，制備供試品溶液，按照2.3色譜條件進(jìn)樣，分別于配制后0，4，8，10，12，24 h進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算芍藥苷峰面積的RSD值。RSD分別為1.3%，表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取白芍飲片適量,平行制備6批次供試品溶液，按照2.3色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算芍藥苷峰面積的RSD值。RSD為1.4%，表明本方法重復(fù)性良好。見(jiàn)表4。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批已知含量的供試品，分別精密加入等量藥苷對(duì)照品，按照色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算芍藥苷的平均回收率為98.5%，RSD值為1.4%。見(jiàn)表5。

3 結(jié)果

3.1 轉(zhuǎn)移率及出膏率考察

3.1.1 白芍飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑中芍藥苷含量測(cè)定 分別精密吸取2.2.1中各溶液1 μL進(jìn)樣，按照2.3色譜條件測(cè)定峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算白芍飲片中芍藥苷含量。見(jiàn)表6。

分別精密吸取2.2.2中供試品溶液各5 μL進(jìn)樣，按照2.3色譜條件測(cè)定峰面積，根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)湯劑中芍藥苷含量，結(jié)果見(jiàn)表6。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 白芍飲片及標(biāo)準(zhǔn)湯劑中芍藥苷含量

3.1.2 芍藥苷轉(zhuǎn)移率 根據(jù)3.1.1測(cè)定結(jié)果，按照轉(zhuǎn)移率計(jì)算公式計(jì)算芍藥苷轉(zhuǎn)移率，轉(zhuǎn)移率計(jì)算公式為：

轉(zhuǎn)移率(%)=W(mg)/M(mg)×100%

注：W表示湯劑中芍藥苷的量(mg)，M表示飲片中芍藥苷的量(mg)。

3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)浸膏出膏率計(jì)算結(jié)果 精密吸取混合均勻的2.2.2供試品溶液10 mL于蒸發(fā)皿中，40 ℃真空干燥至恒重，稱(chēng)量重量，根據(jù)出膏率公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率。見(jiàn)表8。

出膏率(%)=(w×V)/(v×M)×100%

注：M表示藥材量(g)，V表示中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑體積(mL)，v表示取樣體積(mL)，w表示取樣所得干膏量(g)。

表7 芍藥苷轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果(±s)

表7 芍藥苷轉(zhuǎn)移率計(jì)算結(jié)果(±s)

樣品編號(hào)轉(zhuǎn)移率(%)x±sBS0177.96%BS0265.61%BS0375.29%BS0462.03%BS05BS0660.47%64.47%71.62%±8.74%BS0781.69%BS0876.51%BS0967.02%BS1085.16%

表8 標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率計(jì)算結(jié)果(±s)

表8 標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率計(jì)算結(jié)果(±s)

樣品編號(hào)出膏率(%)x±sBS0123.60%BS0222.50%BS0322.10%BS0419.00%BS05BS0620.00%20.00%21.89%±2.51%BS0725.00%BS0820.50%BS0919.68%BS1026.50%

3.2 白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC-DAD指紋圖譜研究

3.2.1 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定 按照“2.3”色譜條件分別將10批次白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液進(jìn)樣分析，準(zhǔn)確吸取各供試品溶液5 μL，注入U(xiǎn)PLC記錄色譜峰信息。見(jiàn)圖4，生成的對(duì)照指紋圖譜見(jiàn)圖5。其中共有峰11個(gè)，通過(guò)UPLC-ESI-MS/MS指認(rèn)5個(gè)，分別是1號(hào)峰：氧化芍藥苷(Rt=4.661)；2號(hào)峰：兒茶素(Rt=5.696)；3號(hào)峰：芍藥內(nèi)酯苷(Rt=6.447)；4號(hào)峰：芍藥苷(Rt=7.102)；11號(hào)峰：苯甲酰芍藥苷(Rt=18.709)。見(jiàn)表9。

圖4 10批白芍樣品UPLC-DAD指紋圖譜

圖5 共有峰及其化學(xué)歸屬

3.2.2 相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積 對(duì)照指紋圖譜中，以芍藥苷色譜峰的保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表10。3.2.3 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 運(yùn)用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)”軟件，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入，峰點(diǎn)校正和數(shù)據(jù)匹配，以中位數(shù)法建立對(duì)照指紋圖譜。根據(jù)峰匹配結(jié)果，以峰面積為參數(shù)，計(jì)算出待測(cè)指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的整體相似度，結(jié)果表明，相似度均大于0.9，符合指紋圖譜相似度要求。具體計(jì)算結(jié)果如下：S1：0.984；S2：0.978；S3：0.981；S4：0.984；S5：0.989；S6：0.987；S7：0.987；S8：0.988；S9：0.973；S10：0.981。

表9 主要色譜峰的歸屬

4 結(jié)果

通過(guò)對(duì)入選的10批次白芍進(jìn)行含量測(cè)定，各批次的芍藥苷含量均符合藥典的要求(芍藥苷含量≥1.2%)，含量分別為：湖南一等1.48%、湖南二等1.29%、湖南三等1.22%、亳州一等2.07%、亳州二等2.01%、亳州三等1.91%、亳州四等1.59%、浙江1.34%、山東1.56%、四川1.52%。從數(shù)據(jù)看，各產(chǎn)地的白芍指標(biāo)成分含量存在一定的差異，亳州一等質(zhì)量最優(yōu)，為藥典最低值1.725倍。

選定的符合藥典含量要求的白芍飲片(芍藥苷含量1.34%～2.07%)，按照標(biāo)準(zhǔn)化工藝制備成的標(biāo)準(zhǔn)湯劑指標(biāo)成分含量為1.69～2.60 mg/mL，轉(zhuǎn)移率為60.47%～85.16%，平均轉(zhuǎn)移率為71.62%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為8.74%。出膏率范圍為19.00%～26.50%，平均出膏率為21.89%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.51%。

通過(guò)分析可以看出，作為原材料的飲片，其質(zhì)量?jī)?yōu)劣與湯劑含量、轉(zhuǎn)移率、出膏率并無(wú)明顯的線性關(guān)系(圖6)，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，飲片的切制方式、質(zhì)地疏松度也是影響這些指標(biāo)的重要因素。因此，工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，既要考慮到飲片質(zhì)量，還要考慮到飲片的加工方式等因素。

表10 各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積

圖6 飲片含量、湯劑含量、轉(zhuǎn)移率、出膏率趨勢(shì)圖

通過(guò)對(duì)10批次白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑的指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn)，湯劑的指紋圖譜相似度較高，均達(dá)到0.9以上，共有峰總計(jì)11個(gè)，確認(rèn)5個(gè)，包括氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷，5個(gè)峰的相對(duì)保留為0.66∶0.80∶0.91∶1.00∶2.63；相對(duì)峰面積為0.06∶0.01∶0.32∶1.00∶0.01。

5 討論

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)體系，是對(duì)傳統(tǒng)湯劑煎煮工藝的傳承和創(chuàng)新，傳統(tǒng)湯劑在煎煮時(shí)一般沒(méi)有固定的加水量、煎煮時(shí)間、濃縮體積等，大多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)操作，如《傷寒論》中有記載：“……右二味，以水三升，煮取一升五合……”；又有記載“……右六味，以水七升，煮取三升……”，傳統(tǒng)煎煮方法也沒(méi)有明確的時(shí)間計(jì)量，一般以加水量及濃縮體積來(lái)控制煎煮時(shí)間，如將三升水煎煮至一升五合時(shí)即可停止煎煮，以此進(jìn)行時(shí)間計(jì)量，這種粗略的計(jì)算原則不利于中藥現(xiàn)代化，更無(wú)法保證湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及臨床給藥劑量的均一性?，F(xiàn)代煎煮規(guī)范雖對(duì)不同部位、不同功效的飲片加水量、煎煮時(shí)間作了細(xì)化，如加水量“浸過(guò)藥面2～5 cm”，煎煮時(shí)間“一般藥物20～30 min；解表、清熱、芳香類(lèi)15～20 min；滋補(bǔ)類(lèi)40～60 min；二煎時(shí)間比頭煎略縮短”，但數(shù)值范圍較寬，容易受人為因素影響而產(chǎn)生較大誤差。

中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑既傳承了按照藥用部位的不同，設(shè)計(jì)不同層次的加水量，如：根及根莖類(lèi)飲片首煎加7倍水，二煎加6倍水。同時(shí)也根據(jù)功效的差異及飲片的特質(zhì)設(shè)計(jì)不同煎煮時(shí)間，如：一般飲片，頭煎30 min，二煎20 min；對(duì)于質(zhì)地堅(jiān)硬、滋補(bǔ)類(lèi)飲片，頭煎60 min，二煎40 min，從根本上解決了工藝不統(tǒng)一的問(wèn)題，解決了以往因煎煮工藝的不同，而導(dǎo)致用藥劑量無(wú)法統(tǒng)一的現(xiàn)狀，為規(guī)范根及根莖類(lèi)飲片的煎煮工藝流程，為白芍飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。同時(shí)，中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑對(duì)于生產(chǎn)配方顆粒具有重要的指導(dǎo)作用，對(duì)于同種飲片，由于給定了具體的操作規(guī)范，可以從根本上減少不同批次、不同廠家間產(chǎn)品的差異，確保質(zhì)量的均一性，保障了用藥安全及臨床療效。

[1]金林，趙萬(wàn)順，郭巧生,等.白芍飲片的化學(xué)成分測(cè)定及質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40(3):484-489.

[2]李巖.白芍及其化學(xué)成分的藥理研究進(jìn)展[J].職業(yè)與健康,2015,31(15):2153-2156.

[3]李震宇，范瑪莉，秦雪梅.基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)的白芍及其醋制品的化學(xué)比較[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50(2):211-217.

[4]方新華，吳鑫，曹崗,等.白芍和白術(shù)配伍麩炒前后主要化學(xué)成分變化HPLC分析(英文)[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2015，24(4):231-235.

[5]張亮.白芍加工炮制對(duì)其化學(xué)成分的影響研究[J].中國(guó)科技博覽，2015，24(16):397-397.

[6]閆亞超，冷偉.白芍除痹止痛臨床應(yīng)用淺探[J].四川中醫(yī)，2015，33(4):42-44.

[7]戴淑萍，顏勤明.白芍總苷在心血管疾病模型動(dòng)物中的藥理研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2015，26(10):1418-1420.

[8]王紅權(quán)，詹杰.白芍總苷治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥理作用及機(jī)制[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，34(2):199-201.

[9]田林，邵智，王海凌.白芍的現(xiàn)代炮制研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2003,14(11)：697-698.

[10]蔣國(guó)強(qiáng)，楊水新，葉勇.RP-HPLC法測(cè)定生白芍免煎飲片中芍藥苷[J].Chinese Traditional and Herbal Drugs，2007，38(8):1190-1191.

[11]陳士林，劉安，李琦，等.中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究策略[A].世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)中藥新藥創(chuàng)制專(zhuān)業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)暨第一屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C].世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)中藥新藥創(chuàng)制專(zhuān)業(yè)委員會(huì)，2016:24.

(2016-04-12收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Quality standard research on standard decoction of paeonialactiflora

Zhu Guangwei，Li Xiwen，Chen Shilin

(InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicinalSciences，Beijing100700，China)

Objective:To study the preparation and quality standard of the standard decoction of paeonia lactiflora.Methods:The standard decoction of paeonia lactiflora was preparated with water by using standardization method and the content of peoniflorin was determined by UPLC-DAD.Then calculate the transfer rate,the rate of extractum and carry on the research of fingerprint.Results:The content of paeoniflo-rin in 10 batches of standard decoction of paeonia lactiflora is 1.69～2.60 mg/mL，the transfer rate is 60.47%～85.16%，the average transfer rate is 71.62% and the standard deviation is 8.74%.The rate of extractum is 19.00%～26.50%，the average yield is 21.89% and the standard deviation is 2.51%.There were 11common peaks，5 of which were identified，including oxypaeoniflorin，catechins,albiflorin，paeoniflorin and benzoylpaeoniflorin.Conclusion:The method is simple with good repeatability，and it can be used to study the preparation of the standard decoction of paeonia lacti-flora.

Paeonia lactiflora; Medicinal slices; Standard decoction; Fingerprint

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院綜合性大平臺(tái)項(xiàng)目(編號(hào)：Z2014003-05)

朱廣偉，博士，助理研究員，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、中藥藥效組分評(píng)價(jià)體系研究，E-mail：gwzhu@icmm.ac.cn

陳士林，博士研究生導(dǎo)師，主要從事中藥資源學(xué)研究，Tel：(010)57203877，E-mail：slchen@icmm.ac.cn

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2016.01.001