王 宇,孔祥瑞,李成久

( 遼寧省水產(chǎn)苗種管理局，遼寧 大連 116000 )

氣相色譜—質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中己烯雌酚的不確定度分析評(píng)定

王 宇,孔祥瑞,李成久

( 遼寧省水產(chǎn)苗種管理局，遼寧 大連 116000 )

依據(jù)測(cè)量不確定度評(píng)定與表示理論，從標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品稱量、樣品定容、標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品測(cè)定和測(cè)量?jī)x器6個(gè)方面，對(duì)氣相色譜—質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中己烯雌酚的不確定度進(jìn)行分析和評(píng)定。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和樣品測(cè)量重復(fù)性這兩個(gè)分量對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度貢獻(xiàn)較大，這為減少測(cè)量不確定度，提高測(cè)量準(zhǔn)確度提供改進(jìn)方向。以平均值報(bào)告水產(chǎn)品中己烯雌酚含量為7.58 μg/kg時(shí)，擴(kuò)展不確定度為2.20 μg/kg。

不確定度；氣相色譜—質(zhì)譜法；己烯雌酚

己烯雌酚為無(wú)色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末，是人工合成的二苯乙烯類(lèi)雌激素，能夠促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)[1]，但其又具有潛在致癌性，我國(guó)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中嚴(yán)格禁止己烯雌酚作為動(dòng)物飼料添加劑添加。2002年農(nóng)業(yè)部在第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高限量》中要求[2]，己烯雌酚在動(dòng)物性食品的可食用部分中要求不得檢出。由于一切測(cè)量結(jié)果都不可避免具有不確定度[3]，故附有表征這種分散性的測(cè)量不確定度的測(cè)量結(jié)果才更完整，更能為判定測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性提供依據(jù)。本次試驗(yàn)采用農(nóng)業(yè)部1163號(hào)公告—9—2009《水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留檢測(cè)氣相色譜—質(zhì)譜法》方法[4]，對(duì)影響測(cè)量結(jié)果不確定度的分量進(jìn)行評(píng)定、計(jì)算、合成，進(jìn)而找出影響己烯雌酚測(cè)量結(jié)果的主要因素，通過(guò)對(duì)這些主要影響因素進(jìn)行持續(xù)改進(jìn)，為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理和質(zhì)量控制提供更為科學(xué)準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

7000B三重四級(jí)桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；ALC210.4電子天平(Ⅰ級(jí))；LD610-2電子天平(Ⅲ級(jí))；SLH固相萃取柱(500 mg，6 mL)；WH-2漩渦混合器；Stratos高速冷凍離心機(jī)；5085氮吹儀；Agilent固相萃取儀。

1.2 試劑

己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.5%)；N-O-雙-(三甲基硅基)三氟乙酰胺/三甲基氯硅烷體積比99∶1；乙酸乙酯、甲醇、正己烷均為色譜級(jí)；無(wú)水乙醚；無(wú)水碳酸鈉。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 提取

稱取勻漿樣品5 g于50 mL離心管中，加10%(m/V)碳酸鈉溶液3 mL，乙酸乙酯20 mL，均質(zhì)30 s，7000 r/min離心10 min，移取乙酸乙酯，再加10 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并乙酸乙酯， 40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。用2 mL正己烷和乙酸乙酯(體積比85∶15)混合溶液溶解殘留物，備用。

1.3.2 凈化

依次用5 mL正己烷、5 mL乙酸乙酯活化SHL固相萃取柱，取備用液過(guò)柱，依次用2 mL正己烷，2 mL正己烷和乙酸乙酯(體積比85∶15)混合溶液淋洗小柱并抽干，再用10 mL正己烷和乙酸乙酯(體積比80∶20)混合溶液洗脫，洗脫液于50 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，? mL無(wú)水乙醚溶解，轉(zhuǎn)至2 mL去活樣品反應(yīng)瓶中氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.3.3 衍生化

反應(yīng)瓶中加100 μL衍生化試劑，混合30 s，80 ℃烘箱中衍生30 min，氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入0.5 mL正己烷，混勻10 s，待測(cè)定。

己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)工作液于2 mL去活樣品反應(yīng)瓶中氮?dú)獯蹈?，衍生化同上?/p>

1.4 測(cè)定

分別吸取1.0 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液及凈化后的樣品溶液進(jìn)行氣相質(zhì)譜分析。樣品峰與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間之差不大于0.10 min，扣除背景后所選擇的離子均出現(xiàn)，以多點(diǎn)校準(zhǔn)定量。

1.5 質(zhì)譜條件

EI源；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；溶劑延遲12 min；選擇離子監(jiān)測(cè)己烯雌酚衍生物(質(zhì)子數(shù)/電荷數(shù))383、397、412、413。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取0.0050 g己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇定容于50 mL容量瓶中，該溶液為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

以甲醇為稀釋液，用1、5 mL分度吸管和10、50、100 mL容量瓶逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，衍生后測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量不確定度的主要來(lái)源

從測(cè)量和計(jì)算兩方面分析己烯雌酚測(cè)定引入的不確定度，主要是由標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品稱量、樣品定容、標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品測(cè)定和測(cè)量?jī)x器6個(gè)方面引入。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品稱量、樣品定容、測(cè)量?jī)x器和標(biāo)準(zhǔn)曲線部分分量的評(píng)定，數(shù)據(jù)主要來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)、檢定證書(shū)、說(shuō)明書(shū)和其他文件提供的數(shù)據(jù)和準(zhǔn)確度等級(jí)，采用B類(lèi)不確定度評(píng)定；對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和重復(fù)測(cè)定樣品引入的不確定度采用A類(lèi)不確定度評(píng)定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的不確定度

查己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)，得到己烯雌酚的純度為99.5%,不確定度為U=0.5%,按正態(tài)分布，包含因子取k=2，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(Cs)=U/k=0.25%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Cs)= 0.25%/99.5%=0.0025。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量的不確定度

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液定容的不確定度

2.2.4 環(huán)境條件變化的不確定度

由上可見(jiàn)，標(biāo)準(zhǔn)溶液定容引入的不確定度相對(duì)較小，忽略不計(jì)。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量及溫度變化引入不確定度經(jīng)合成為標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel(Cb)=0.0204。

2.3 樣品稱量引入的不確定度

2.4 定容體積引入的不確定度

2.4.1 樣液定容的不確定度

2.4.2 進(jìn)樣體積的不確定度

以上，由提取衍生液定容和進(jìn)樣體積引入的不確定度經(jīng)合成為樣品定容的不確定度urel(V)=0.0130。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋的不確定度

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液移取的不確定度

2.5.3 采用最小二乘法擬合基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的不確定度

5個(gè)不同質(zhì)量濃度的己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)工作液衍生化后，得到順?lè)磧煞N結(jié)構(gòu)己烯雌酚衍生物，相應(yīng)峰面積為yi，每個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定3次。采用最小二乘法擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程y=a+bx(a為截距，b為斜率)和方程的詳細(xì)相關(guān)系數(shù)(表1)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性回歸方程擬合結(jié)果

順式己烯雌酚衍生物:回歸方程y=3490.9442x-18.4546，相關(guān)系數(shù)r2=0.9997；反式己烯雌酚衍生物:回歸方程y=11022.6248x+17.4278， 相關(guān)系數(shù)r2=0.9998.

由標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)得到的被測(cè)物含量xc的不確定度u(xc)=S(xc)，可按下式求得：

其中：

以上， 由標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋、標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生化及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入不確定度合成為標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度urel(B)=0.0480。

2.6 樣品測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度

以己烯雌酚質(zhì)控樣品作為待測(cè)樣，在相同的條件下，按試驗(yàn)方法進(jìn)行6次測(cè)定，得到順?lè)磧煞N結(jié)構(gòu)己烯雌酚衍生物的質(zhì)量濃度和響應(yīng)值(表2)。

表2 己烯雌酚衍生物測(cè)定結(jié)果表

6次測(cè)定樣品的重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差s，即為標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(c)。按下式計(jì)算：

2.7 測(cè)定儀器引入的不確定度

2.8 合成和擴(kuò)展不確定度

2.8.1 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品稱量、樣品定容、標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品測(cè)量和測(cè)量?jī)x器等6個(gè)方面引入的不確定度，通過(guò)合成得到相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(M)=0.145。

0.145

2.8.2 擴(kuò)展不確定度

在一般情況下，取置信水平95%，包含因子k=2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度U=kuc(M)=2×1.10=2.20 μg/kg。

3 討 論

評(píng)定發(fā)現(xiàn)，影響測(cè)量結(jié)果的6個(gè)分量對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度貢獻(xiàn)大小不同。其中由樣品重復(fù)測(cè)量引入不確定度對(duì)測(cè)量結(jié)果影響最大，這對(duì)樣品前處理過(guò)程包括操作熟練度、人員因素和環(huán)境條件等提出改進(jìn)要求。其次是由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)非同一次衍生，形成順?lè)磧煞N結(jié)構(gòu)己烯雌酚衍生物的量比具有不確定性，本次試驗(yàn)由于標(biāo)準(zhǔn)物和樣品非同一次衍生，分析由此引入了較大不確定度。試驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，因稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可達(dá)0.02，不可忽視。如果做單次測(cè)量有增大不確定度的風(fēng)險(xiǎn)。故試驗(yàn)建議：(1)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品最好同一次衍生化。(2)稱量過(guò)程使用精密度高的天平。(3)盡可能做雙平行試驗(yàn)。

4 結(jié) 論

采用農(nóng)業(yè)部1163號(hào)公告-9-2009《水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留檢測(cè)氣相色譜-質(zhì)譜法》測(cè)定水產(chǎn)品中己烯雌酚含量，以平均值報(bào)告結(jié)果和擴(kuò)展不確定度為(7.58±2.20) μg/kg，包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度為2.20 μg/kg。

[1] 邴愛(ài)英,李坤林，牛鐘相.己烯雌酚免疫分析技術(shù)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006,27(4)：51-54.

[2] 農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào).動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[3] 國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.JJF1059-1999.測(cè)定不確定度評(píng)定與表示[M].北京：中國(guó)計(jì)量出版社，1999.

[4] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局.農(nóng)業(yè)部1163公告-9-2009.水產(chǎn)品中己烯雌酚殘留檢測(cè)氣相色譜-質(zhì)譜法[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011.

[5] 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJG196-2006，常用玻璃量器檢定規(guī)程[M].北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2007.

[6] 朱凱.HPLC法測(cè)定片劑中雙氫青蒿素含量的不確定度評(píng)估[J].工商大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003,30(1)：81-85.

EvaluationofUncertaintyinDetectionofDiethylstilbestrolResiduesinFisheryProductsbyGC-MS

WANG Yu，KONG Xiangrui，LI Chengjiu

( Aquatic Seedlings and Fingerlings Management Bureau of Liaoning Province，Dalian 116000，China )

The uncertainty of diethylstilbestrol residues in fishery products detected by gas chromatography-mass spectrometry method was evaluated from standard solution，sample weighing，sample constant volume，calibration curve，sample and detecting instrument used based on measurement uncertainty evaluation and representation theory.The results showed that calibration curve fitting and sample detection were on the most extent involved in the uncertainty，which provided an improvement direction for the reduction in measuring uncertainty and increase in measuring accuracy.The average report of diethylstilbestrol residues in fishery products was calculated to be (7.58±2.20) μg/kg，with uncertain extension of 2.20 μg/kg.

uncertainty; GC-MS; diethylstilbestrol

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.016

S912

A

1003-1111(2016)03-0284-05

2015-08-08；

2015-10-08.

王宇(1979-)，女，碩士；研究方向：水產(chǎn)苗種質(zhì)量安全與檢測(cè).E-mail：18625038@qq.com.