蕭淑宜 柳建華 邱春花 杜 洪

廣州市第一人民醫(yī)院超聲醫(yī)學科(廣州 510180)

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微泡增強的超聲空化增加兔睪丸組織伊文思藍濃度的研究

蕭淑宜 柳建華 邱春花 杜 洪

廣州市第一人民醫(yī)院超聲醫(yī)學科(廣州 510180)

目的 探討微泡增強的超聲空化增加睪丸組織的藥物濃度的可行性。方法 18只雄性8月齡性成熟新西蘭兔隨機分為空白對照組(C)、單純微泡組(MB)、治療超聲組(TUS)、超聲聯(lián)合微泡輻照組(MEUS)4組，每組各9個。MB組給予靜注微泡造影劑 0.1 mL/kg ；TUS組給予超聲輻照5min；MEUS組給予靜注微泡造影劑0.1 mL/kg的同時超聲輻照5min；每組在治療前5min均經耳緣靜脈注射2%伊文思藍(EB)2.5 mL/kg；治療后1 h取各組睪丸組織制備組織勻漿測量 EB 濃度。結果 MEUS組兔睪丸組織內 EB 濃度高于其他各組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。結論 微泡增強的超聲空化可以明顯提高睪丸組織內EB濃度。

睪丸；超聲空化；微泡；伊文思藍；兔

血-睪屏障是睪丸組織內存在于生精細胞、精子與血液之間的保護性的屏障結構，有選擇、調節(jié)物質通過的特點。生理狀態(tài)時血-睪屏障為生精細胞分裂增殖產生精子提供一個特殊穩(wěn)定的環(huán)境；但病理狀態(tài)下，其阻止大分子物質進入生精小管的特點卻成為藥物進入睪丸實質達到有效濃度的障礙，使睪丸成為腫瘤細胞或病原體的庇護所，成為疾病化療復發(fā)的嚴重隱患[1-2]。已知微泡增強的超聲空化能通過毀損血管壁等結構提高血管及細胞膜通透性的作用[3-5]。本研究利用新型脈沖式超聲治療儀，聯(lián)合靜脈注射超聲微泡造影劑輻照新西蘭兔睪丸，分析輻照后睪丸組織內伊文思藍濃度，探討微泡增強的超聲空化能否通過提高血-睪屏障的通透性增加睪丸組織內的藥物濃度，從而輔助治療累及睪丸的疾病。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性新西蘭兔18只, 均達性成熟期，體重1.92～2.54 kg,平均體重(2.54±0.33)kg，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。實驗全過程均獲得廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會的許可。術前利用速眠新II( 0.15 mL/kg)和2%戊巴比妥鈉(1.5 mL/kg)聯(lián)合肌注麻醉新西蘭兔，然后將其保持仰臥姿勢固定于實驗手術臺上，穿刺耳緣靜脈建立靜脈通道以備注射微泡、生理鹽水或EB溶液；剪除睪丸表面體毛作為超聲輻照聲窗。

1.2 實驗材料 ①超聲治療儀：本實驗中用于超聲治療的是第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院研制的脈沖式低頻超聲治療儀，該儀器發(fā)射的超聲頻率為1 MHz，脈沖范圍100～1000s，峰值聲壓4.6 MPa，聲強均值0.33 W/cm2，占空比1.08%。②超聲造影劑：本實驗應用的超聲造影劑為第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院研制的“脂氟顯”超聲造影劑，微泡外殼是磷脂，核心包裹的氣體是全氟丙烷，平均粒徑2 μm。

1.3 實驗方法 18只雄性8月齡性成熟新西蘭兔的36個睪丸根據是否進行超聲照射、有無微泡介導隨機分成4組，每組9個。每組實驗均包括以下三個步驟：

第一步：每組動物在超聲治療前均經耳緣靜脈均勻推注質量濃度為20 g/L的EB溶液(用量： 2.5 mL/kg)。

第二步：利用“超聲微泡振蕩儀”震蕩“脂氟顯”超聲微泡45s備用。兔睪丸表面及超聲治療探頭表面均均勻涂上耦合劑，以利于超聲探頭與睪丸表面隔絕空氣緊密接觸。MEUS組，首先將超聲治療探頭垂直于睪丸表面保持緊密接觸但不用力重壓以免影響睪丸實質血液循環(huán)，然后一邊經耳緣靜脈緩慢勻速推注微泡混懸液(0.1 mL/kg微泡加入10 mL生理鹽水中)，一邊啟動脈沖式超聲治療儀輻照5min；TUS組：超聲輻照同MEUS組，但不使用微泡，僅使用等量生理鹽水代替微泡靜推；MB組：微泡靜推同MEUS組,超聲治療探頭放置同前，但不啟動超聲治療儀，僅假照5min；C組，用10 mL的生理鹽水替代微泡并用超聲治療頭假照5min。

第三步：各組動物相應治療1 h后，抽取低分子肝素鈉(1000 IU/kg)經耳緣靜脈推注使兔全身肝素化，然后經腹中線剪開腹腔，暴露腹主動脈，利用連接肝素化生理鹽水的靜脈注射針穿刺進入腹主動脈后用血管鉗固定，同時離斷近心端腹主動脈和下腔靜脈，并擰開灌注液灌洗直至流出的液體由渾濁轉為澄清、睪丸由藍色轉為白色為止。隨即取出睪丸組織。

1.4 睪丸組織中 EB 含量的測定

1.4.1 建立EB標準曲線 將2 mg EB溶于100 mL的甲酰胺中配制成濃度為20 μg/mL的EB溶液，然后倍比稀釋成濃度分別為10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL、0.317 5 μg/mL、0.158 75 μg/mL的EB溶液，用紫外分光光度儀對各溶液進行光密度掃描，確定其最大吸收峰處的光密度值。依梯度濃度及相對應的光密度值回歸分析，推算回歸方程并繪制標準曲線。

1.4.2 測定睪丸組織的EB含量 各組實驗兔睪丸組織按上述方法相應處理后，首先用電子天平精確稱其濕重，然后切成小塊投入含有3 mL甲酰胺液體的試管中，加蓋標記并置于37 ℃水浴中恒溫孵育24 h，接著取出離心5min(3000 r/min)并取上清液用紫外分光光度儀測定光密度值，依光密度值及上上述建立的EB溶液標準曲線得出含有睪丸組織上清液的EB濃度，最后計算出每克睪丸組織中的EB含量(μg/g)。

1.5 統(tǒng)計學分析 計量資料均以均值±標準差表示，EB 標準曲線用回歸分析程序分析，各實驗組之間對比采用單向方差分析，采用SPSS 13.0軟件處理，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 動物實驗情況及大體標本外觀 本實驗過程嚴格遵守《實驗動物管理條例》倫理規(guī)則；實驗過程中動物均處于良好麻醉狀態(tài)。18只實驗兔全部完成實驗；大體可見，MEUS組兔睪丸表面及肌層見少許散在出血點，其余各組兔睪丸表面及其周圍肌層均色澤正常，未見明顯的血腫形成。

2.2 EB濃度 C組及TUS組及MB組兔睪丸內EB濃度極低，MEUS組兔睪丸內EB濃度高于其他三組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； TUS組兔睪丸內EB濃度高于MB組及C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表 1。

表1 各組睪丸組織EB濃度比較

*與其他各組比較，P<0.05；#與其他各組比較，P<0.05

3 討 論

血-睪屏障是睪丸組織內存在于生精細胞、精子與血液之間的保護性的屏障結構，有選擇、調節(jié)物質通過的特點。血-睪屏障能選擇性地調節(jié)物質通過，一方面供給睪丸必須的營養(yǎng)物質并傳達機體的內分泌調節(jié)信息促使精子正常發(fā)育，另一方面抵御血液內的有害物質進入睪丸實質起防御保護的作用，從而為生精細胞分裂增殖產生精子創(chuàng)造一個特殊的穩(wěn)定環(huán)境。但當出現(xiàn)睪丸疾病，如睪丸炎、睪丸腫瘤時，血-屏障則成為藥物進入睪丸實質達到有效濃度的障礙，使睪丸成為腫瘤細胞或病原體等的庇護所，為疾病的復發(fā)埋下嚴重隱患[1-2]。據報道，兒童白血病化療緩解后睪丸內復發(fā)的概率高達17%，成人淋巴瘤化療完全緩解后40%～50%的復發(fā)來自睪丸及中樞神經系統(tǒng)[2]。因此，亟需一種安全有效、可逆開放血睪屏障，促進藥物對睪丸疾病治療的方法。

聲孔效應是超聲空化在機體血管壁、細胞膜等結構上產生的可逆的生物學效應；微泡增強的超聲空化通過靜脈推注超聲微泡增加血液中的空化核，一方面降低超聲空化閾值，一方面增強超聲空化效應。怎樣有效、可控地利用微泡增強的超聲空化效應來克服各種生物膜屏障進行靶向治療是超聲界近年來的研究熱點之一[3-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，利用超聲波輻照攜帶藥物或基因的微泡造影劑，利用空化效應以及超聲輻射力的作用可以靶向導入和釋放藥物。目前研究已經證明超聲聯(lián)合微泡可以靶向、局部、可逆性地開放血腦屏障和血腫瘤屏障[6-8]。對于血-睪屏障，也有體外實驗提示低強度超聲聯(lián)合微泡可以通過作用于支持細胞上的波形蛋白可逆地開放血-睪屏障[10-11]。既往對于超聲空化作用對睪丸影響的相關研究主要有兩類：第一類主要針對診斷超聲(伴或不伴有微泡)對睪丸生殖細胞的影響[9-10]，研究認為其對組織的影響與超聲的機械參數、微泡特性及輻照時間密切相關；一定劑量的低強度超聲并不誘導生殖細胞凋亡，反而有通過睪酮增加而促進生殖細胞增殖作用的可能，另外即使輻照達一定劑量可以引起生殖細胞的凋亡，但停止輻照后可逐漸恢復正常。第二類是研究治療超聲對血-睪屏障的影響的離體實驗，張波等[11-13]利用微泡聯(lián)合治療超聲作用于離體的大鼠睪丸支持細胞后發(fā)現(xiàn)，與緊密連接密切相關的波形蛋白表達降低，提示超聲空化可能可以影響血-睪屏障的結構。

筆者前期實驗發(fā)現(xiàn)微泡增強的超聲空化效應可以有效地影響甚至損傷血-睪屏障結構[14]，本研究希望進一步探討藥物是否可通過超聲空化效應損傷了的血-睪屏障結構在睪丸組織內聚集，從而為超聲空化應用于輔助藥物治療睪丸疾病提供依據。本研究結果顯示，C組及MB組兔睪丸內EB濃度極低，這是由于這兩組均沒有超聲輻照產生空化效應；TUS組兔睪丸內EB濃度稍高于C組及MB組，推測原因可能是治療超聲聯(lián)合血液本身固有的少量的空化核產生低程度的空化效應，一定程度上影響了血-睪屏障的通透性，從而輕微影響了EB的擴散。MEUS組睪丸內藥物濃度明顯高于其他各組，有力的證明了超聲聯(lián)合微泡產生的空化效應可以顯著提高血-睪屏障的通透性，增加局部藥物的濃度，有望用之于輔助提高藥物治療效果。

總之，筆者前期實驗證明微泡增強的超聲空化效應能夠有效地開放血-睪屏障[14]，本實驗結果證實超聲聯(lián)合微泡可以提高睪丸組織局部藥物濃度。進一步明確其血-睪屏障打開的機制、明確實驗中生精細胞的損傷及血睪屏障的破壞是否可逆將成為我們未來探索的問題。

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Research on the increase of concentration of EB in rabbit testis by microbubbles enhanced ultrasound

XiaoShuyi，LiuJianhua，QiuChunhua，etal.

Department of Medical Ultrasound，The First People’s Hospital of Guangzhou，Guangzhou 510180，China

Objective To investigate feasibility of microbubbles enhanced ultrasound (MEUS) on the concentration of Evans blue (EB) in rabbit，stestis. Methods Eighteen sexually mature male New Zealand rabbits were divided into four groups randomly. Pulsed ultrasound irradiation and intravenous microbubbles injection were both applied in the microbubbles enhanced ultrasound group (MEUS), pulsed ultrasound irradiation and intravenous microbubbles injection were individually applied in the therapeutic ultrasound group (TUS) and the simple microbubbles group (MB). Injection of EB was applied in each group five minutes before the treatment.Concentration of EB in testis tissue was measured homogenated. Results The concentration of Evans blue (EB) in rabbit’s testis in MEUS group was statistically higher than the other groups (P<0.05). Conclusion Microbubbles enhanced ultrasound (MEUS) can increase the concentration of Evans blue (EB) in rabbit’s testis.

Testis；Cavitation；Microbubbles； Evans blue；Rabbit

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目 (20131A011021 )；廣東省公益研究與能力建設專項資金項目(2014A020212014)；廣東省自然科學基金(2016A030313461)

柳建華，E-mail：jhliu666666@163.com

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.06.003

2016- 08-12)