丁 利,黎俊榆,代小梅,汪繼超,方振華,史海濤

( 1. 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571158； 2. 海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，海南 ?？?570216 )

烏龜鮑曼不動(dòng)桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

丁 利1,黎俊榆1,代小梅1,汪繼超1,方振華2,史海濤1

( 1. 海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南 ?？?571158； 2. 海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，海南 海口 570216 )

自患病烏龜肝臟中分離出1株優(yōu)勢(shì)菌DL01221，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)、16S rRNA基因序列分析，同時(shí)采用Kriby-Bauer紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌為革蘭氏陰性球桿菌，將該菌株16S rRNA序列進(jìn)行同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)它與鮑曼不動(dòng)桿菌處于同一群，同源性超過98%，結(jié)合菌株形態(tài)和生化指標(biāo)，確定該菌株為鮑曼不動(dòng)桿菌。致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，其對(duì)烏龜具有較強(qiáng)的致病作用；耐藥性結(jié)果顯示其對(duì)頭孢他啶、卡那霉素及氟羅沙星敏感，對(duì)其他多種抗生素耐藥。

烏龜；鮑曼不動(dòng)桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

近年來，隨著龜鱉養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，養(yǎng)龜場(chǎng)規(guī)模在不斷擴(kuò)大，龜類疾病也日益頻發(fā)，其中尤以細(xì)菌性和病毒性傳染病為甚[1-3]，常發(fā)生爆發(fā)性流行，死亡一般在15%左右，嚴(yán)重的可高達(dá)80%，甚至全軍覆滅，使養(yǎng)殖場(chǎng)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約著龜鱉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[4]。目前鑒定病原種類是確診病因及對(duì)癥下藥的前提，但人們對(duì)龜類疾病的研究起步較晚，基礎(chǔ)理論研究和病原分離方法與技術(shù)落后，多數(shù)養(yǎng)殖場(chǎng)存在盲目用藥現(xiàn)象，給龜類養(yǎng)殖戶造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

細(xì)菌病是水生動(dòng)物常發(fā)病。鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)作為重要條件致病菌引發(fā)的動(dòng)物感染已被廣泛報(bào)道[5-6]，也有發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌存在于患病的水生動(dòng)物體內(nèi)[7-8]，如感染鮑曼不動(dòng)桿菌株后斑點(diǎn)叉尾(Ictaluruspunctatus)死亡[7]。本研究自患病烏龜(Mauremysnigricans)體內(nèi)分離出致病菌，通過培養(yǎng)特性、生化和分子生物學(xué)鑒定，判定分離菌為鮑曼不動(dòng)桿菌；通過致病性研究發(fā)現(xiàn)該菌可引起烏龜發(fā)??；同時(shí)采用Kriby-Bauer紙片擴(kuò)散法對(duì)分離菌株進(jìn)行耐藥性分析，旨在為龜鱉的健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)，并為龜類養(yǎng)殖業(yè)細(xì)菌病害的防治提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

患病烏龜由海南省某龜鱉養(yǎng)殖場(chǎng)提供。病龜腹甲和背甲均有明顯的潰爛，頸部和四肢有大小不一的白點(diǎn)。剖解發(fā)現(xiàn)，發(fā)病龜肝、脾腫大，表面出血，質(zhì)脆易碎，呈紫黑色，腹腔內(nèi)有積液，惡臭。

1.1.2 主要試劑及儀器

革蘭氏染色試劑(杭州微生物試劑有限公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[中科瑞泰(北京)生物科技有限公司]；PCR試劑(Promega公司)；藥敏紙片(北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司)；生化鑒定試劑(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；PCR儀及凝膠成像分析系統(tǒng)(BIORAD公司)；冷凍高速離心機(jī)(EPPENDORF公司)；生物安全柜(力康發(fā)展有限公司)；引物合成和測(cè)序均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化、鏡檢

病龜經(jīng)低溫麻痹后，體表用75%的酒精消毒，迅速剖檢并分離肝臟，低溫條件下研磨后，用無菌生理鹽水進(jìn)行稀釋，無菌接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，再挑取單個(gè)菌落于無菌條件下進(jìn)行劃線分離、培養(yǎng)，重復(fù)以上步驟，直至菌落特征相同時(shí)，再挑取單個(gè)菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，觀察菌落形態(tài)及染色特點(diǎn)；將單菌落分別接種于麥康凱培養(yǎng)基和SS 瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，觀察菌落的生長(zhǎng)情況。

1.2.2 生化試驗(yàn)鑒定

將分離菌純培養(yǎng)物進(jìn)行生化試驗(yàn)，按文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行。

1.2.3 16S rRNA的PCR擴(kuò)增及序列分析

取適量的菌液離心收集菌體，采用SDS裂解法提取細(xì)菌DNA，按文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行。采用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：

上游引物：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；

下游引物：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反應(yīng)體系如下：TaqMix 12.5 μL，去離子水8.5 μL，上、下游引物各1 μL(引物濃度均為10 pmol/L)，模板DNA 2 μL，共25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s；54 ℃ 45 s；72 ℃ 60 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物依照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，并送往上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。分離菌的16S rRNA基因序列通過美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 人工感染試驗(yàn)

將分離菌稀釋至密度為1.0×107cfu/mL的菌液，腹腔注射12只健康烏龜(10月齡，平均體質(zhì)量為95 g/只)，每只0.5 mL，對(duì)照組12只烏龜注射0.65%等量生理鹽水，觀察14 d，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和死亡率。取肝臟、腎臟、脾臟組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定。

1.2.5 藥物敏感性試驗(yàn)

采用世界衛(wèi)生組織推薦的紙片瓊脂擴(kuò)散法即Kirby-Barere法，無菌條件下，將菌液均勻涂布于LB培養(yǎng)基，貼上臨床常用的動(dòng)物疾病治療的藥敏紙片，將培養(yǎng)皿放于培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)量各抑菌環(huán)直徑。依據(jù)說明書上“不動(dòng)桿菌抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)”判別試驗(yàn)菌對(duì)所用抗生素的敏感程度。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特征及形態(tài)

經(jīng)分離所得的細(xì)菌，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)后，呈圓形乳白色、不透明、邊緣整齊、表面圓滑濕潤(rùn)、中間微凸起的菌落(圖 1a)；在麥康凱平板上生長(zhǎng)良好，呈圓形、表面濕潤(rùn)光滑、淡粉色的菌落(圖 1b)；在SS 瓊脂培養(yǎng)基中不生長(zhǎng)。該菌革蘭氏染色不易脫色，鏡檢結(jié)果顯示為陰性短小球桿菌，多成雙排列，近似雙球菌，有時(shí)呈絲狀或鏈狀(圖1c)，將分離菌命名為DL01221。

圖1 分離菌形態(tài)a,普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板生長(zhǎng)菌落; b,麥康凱平板生長(zhǎng)菌落; c,分離菌革蘭氏染色觀察.

2.2 生化特性鑒定

對(duì)分離到的革蘭氏陰性菌進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見表1。根據(jù)以上形態(tài)學(xué)觀察和生化鑒定結(jié)果，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[11]，初步鑒定該菌為鮑曼不動(dòng)桿菌。

表1 分離菌株的生化鑒定結(jié)果

2.3 回歸感染試驗(yàn)

經(jīng)純培養(yǎng)的分離菌懸液腹腔注射烏龜后，試驗(yàn)組在接種后第4 d出現(xiàn)精神萎靡，食欲減退等癥狀，注射7 d累計(jì)死亡率為42%。死亡的烏龜癥狀與自然病例相似。對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)期間未出現(xiàn)異常。從人工感染發(fā)病的龜體肝臟中，均分離到與自然發(fā)病分離菌相同的細(xì)菌。

2.4 16S rRNA序列分析

分離菌16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2，產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收提純后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，分離菌株16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1416 bp。同源性分析結(jié)果顯示，分離菌與多數(shù)鮑曼不動(dòng)桿菌菌株同源性超過99%，與斑點(diǎn)叉尾鮑曼不動(dòng)桿菌株的同源性為98.7%；而與醋酸鈣不動(dòng)桿菌(A.calcoaceticus)、瓊氏不動(dòng)桿菌(A.junii)、約翰遜不動(dòng)桿菌(A.johnsonii)、溶血不動(dòng)桿菌(A.haemolytius)及沃氏不動(dòng)桿菌(A.lwoffii)同源性分別為97%、97.4%、96%、97%和95.7%。分離菌株DL01221的16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3，結(jié)果顯示本試驗(yàn)分離菌株DL01221處于鮑曼不動(dòng)桿菌群內(nèi)，其中與法國(guó)和印度分離菌親緣關(guān)系最近，與中國(guó)斑點(diǎn)叉尾分離菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 分離菌株DL01221的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000；1. 分離

圖3 分離菌株DL01221的16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用15種藥物敏感試紙對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌DL01221進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢曲松、慶大霉素、妥布霉素、克林霉素、克拉霉素及四環(huán)素等7種藥物具有耐藥性；對(duì)頭孢他啶、卡那霉素及氟羅沙星敏感；對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氟沙星、鏈霉素等中度敏感；抗菌藥紙片種類、含藥量、抑菌圈直徑及判斷結(jié)果見表2。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：CLSI藥敏試驗(yàn)紙片法判定標(biāo)準(zhǔn)：S，敏感；I，中介；R，耐藥.

3 討 論

目前，隨著龜養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，龜?shù)酿B(yǎng)殖規(guī)模在不斷擴(kuò)大，但水質(zhì)惡化、養(yǎng)殖密度過高等原因?qū)е慢旝M疾病發(fā)生也日益頻繁，嚴(yán)重影響了龜鱉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[4]。龜類疾病大多由細(xì)菌、真菌和病毒感染引起，而細(xì)菌感染引起的疾病是水生動(dòng)物的常發(fā)傳染病[12-22]，在龜鱉養(yǎng)殖業(yè)中也屬于高發(fā)和頻發(fā)疾病[4]，特別是近年來，龜鱉的細(xì)菌性疾病呈現(xiàn)了爆發(fā)流行之勢(shì)。鮑曼不動(dòng)桿菌是奈瑟氏球菌科不動(dòng)桿菌屬中的一種革蘭陰性球桿菌，該菌對(duì)人和動(dòng)物是一種常見的條件性致病菌，能通過多種方式感染人體使其患病，最常見的是引起人的肺炎、敗血癥、腦膜炎、骨髓炎等[23]。該菌感染動(dòng)物可引起新生駒患敗血癥，?；既橄傺祝~患敗血癥，水牛感染后會(huì)流產(chǎn)等[24]，目前有發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌存在于患病的水生動(dòng)物體內(nèi)[7-8,25]。本研究自患病烏龜體內(nèi)分離出致病菌，通過形態(tài)學(xué)和生化特性初步鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌。該菌革蘭氏染色不易脫色，與其他研究報(bào)道的鮑曼不動(dòng)桿菌脫色不易的結(jié)果相似，但是具體原因尚不明確，猜測(cè)可能與該菌的細(xì)胞壁有關(guān)[7-8,20]。本研究基于16S rRNA序列進(jìn)行了不動(dòng)桿菌屬的系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)分離菌DL01221落于鮑曼不動(dòng)桿菌群，與其他鮑曼不動(dòng)桿菌同源性超過98%，確定該菌株為鮑曼不動(dòng)桿菌。通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)證實(shí)，該分離株可感染龜，并導(dǎo)致其發(fā)病。

近年來，隨著廣譜抗生素在臨床上的廣泛使用，多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌逐漸增多，嚴(yán)重威脅著人類健康[26]。鮑曼不動(dòng)桿菌在臨床上的研究受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注，但作為龜類的病原菌，尚未見報(bào)道。本研究從患病烏龜體內(nèi)分離的鮑曼不動(dòng)桿菌DL01221進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)分離到的菌株耐藥性與陸文浩等[8]報(bào)道的魚源鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的耐藥性有一定差異，如本分離鮑曼不動(dòng)桿菌DL01221對(duì)頭孢他啶、卡那霉素及氟羅沙星等抗生素敏感；對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氟沙星、鏈霉素等抗生素中度敏感；對(duì)頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢曲松、慶大霉素、妥布霉素、克林霉素、克拉霉素及四環(huán)素等抗生素具有較強(qiáng)耐藥性，而魚源的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)妥布霉素、慶大霉素、左氟沙星和鏈霉素高度敏感，對(duì)四環(huán)素中度敏感，對(duì)頭孢他啶、頭孢噻肟等產(chǎn)生耐藥。這也符合不同報(bào)道中提到的國(guó)內(nèi)不同地區(qū)分離的鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥性有一定差異[8,27]。可能原因?yàn)榫晁幍沫h(huán)境和當(dāng)?shù)氐挠盟幜?xí)慣不同而導(dǎo)致同種菌對(duì)同種抗生素表現(xiàn)出不同的耐藥性。

隨著龜類疾病的高發(fā)，養(yǎng)殖場(chǎng)為追求暫時(shí)的經(jīng)濟(jì)效益，濫用化學(xué)藥物或盲目加大藥物的使用劑量，使許多致病菌產(chǎn)生抗藥性，治療困難。鮑曼不動(dòng)桿菌不但影響人類健康，對(duì)龜鱉動(dòng)物的潛在威脅也逐漸暴露出來，而且鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多種抗生素具有天然耐藥性，臨床上治療較為困難。因此，關(guān)注藥物殘留對(duì)水源的影響，不僅是實(shí)施龜鱉健康養(yǎng)殖的有效措施，而且對(duì)人類的健康具有促進(jìn)意義。

[1] 章劍, 王保良. 龜鱉病害防治黃金手冊(cè)[M]. 2版.北京: 海洋出版社, 2012.

[2] 朱凌宇，戴愛敏，董明倩，等. 中華鱉養(yǎng)殖水體光合細(xì)菌的分離、鑒定與固定化[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2014, 33(8):493-497.

[3] 林亞歌，葉鍵，石婷婷，等. 中華鱉源奇異變形桿菌的分離鑒定與致病性研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2014, 33(12):800-803.

[4] 洪美玲, 付麗容, 王銳萍, 等. 龜鱉動(dòng)物疾病的研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志, 2003, 38(6):115-119.

[5] 趙劍, 黎昆, 李科, 等. 639株鮑曼不動(dòng)桿菌分布及耐藥性分析[J]. 中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師, 2015, 12(8):7-9.

[6] El-Ageery S M, Abo-Shadi M A, Alghaithy A A, et al. Epidemiological investigation of nosocomial infection with multidrug-resistantAcinetobacterbaumannii[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2012, 16(13):1834-1839.

[7] 顧澤茂, 柳陽(yáng), 陳昌福, 等. 鮑曼不動(dòng)桿菌斑點(diǎn)叉尾株的分離與鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 24(4):489-493.

[8] 陸文浩, 陳輝, 鄒勇, 等. 銀鯽不動(dòng)桿菌病原菌鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2010, 29(3):156-161.

[9] 李建強(qiáng)，李六金. 獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)指導(dǎo)[M]. 西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1999:32-40.

[10] 彭凌, 楊旭夫, 朱必鳳, 等. 豬鏈球菌廣東株的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(2):130-133.

[11] 東秀珠,蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2001.

[12] 張曉君,畢可然,閻斌倫,等.矛尾復(fù)虎魚病原哈氏弧菌的鑒定及特異性檢測(cè)方法的建立[J].水產(chǎn)科學(xué),2011,30(12):758-763.

[13] 夏飛,梁利國(guó),謝駿.團(tuán)頭魴病原嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].水產(chǎn)科學(xué),2012,31(10):606-610.

[14] 陶詩(shī),何芳芳,劉雪珠,等.海水養(yǎng)殖魚類病原微生物研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)科學(xué),2013,32(3):175-182.

[15] 隗黎麗，王自蕊，楊竹青. 草魚2株氣單胞菌的分離與鑒定[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2013, 32(6):348-352.

[16] 李春濤,楊秀營(yíng),蔣自立.大鰭鳠腹部一種感染性疾病病原菌確定及藥敏研究[J].水產(chǎn)科學(xué),2014,33(3):171-174.

[17] 楊寧，黃海，張希，等. 尼羅羅非魚嗜水氣單胞菌病的病原分離鑒定和藥敏試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2014, 33(5):306-310.

[18] 周毅，張培培，徐曄，等. 金魚嗜水氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2014, 33(6):379-384.

[19] 沈曉靜，胡秀彩，蘭云，等. 錦鯉熒光假單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2014, 33(7):443-446.

[20] 張培，朱愛華，胡秀彩，等. 金魚類志賀鄰單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2015, 34(6):375-379.

[21] 李聰，蔡巖，周永燦，等. 海南羅非魚致病性維氏氣單胞菌分離鑒定及藥敏特性研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2015, 34(10):640-646.

[22] 藍(lán)勝華,王利,鄧麟杰,等.黃顙魚溶酪巨型球菌的鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].水產(chǎn)科學(xué)，2015,34(12):748-752.

[23] Méndez J A, Mateos J, Beceiro A, et al. Quantitative proteomic analysis of host-pathogen interactions: a study ofAcinetobacterbaumanniiresponses to host airways[J]. BMC Genomics, 2015, 16(1):422.

[24] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 4版.北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2007.

[25] 顧天釗, 陸承平, 陳懷青. 鮑氏不動(dòng)桿菌—鱖魚暴發(fā)性死亡的新病原[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1997, 24(2):104-106.

[26] 黃一睿, 甘文思, 夏優(yōu)秀, 等. 鮑氏不動(dòng)桿菌的臨床分布與耐藥性分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2015, 25(8):1693-1695.

[27] 馬越, 李景云, 姚蕾,等. 不同地區(qū)鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株的耐藥性比較[J]. 中國(guó)抗感染化療雜志, 2003, 3(5):306-308.

Isolation,IdentificationandDrugSensitivityofAcinetobacterbaumanniifromTortoiseMauremysnigricans

DING Li1, LI Junyu1, DAI Xiaomei1, WANG Jichao1, FANG Zhenhua2, SHI Haitao1

( 1.College of Life Sciences, Hainan Normal University, Haikou 571158, China;2. School of Biological Engineering, Hainan College of Vocation and Techniques, Haikou 570216, China )

One predominant bacterial strain named DL01221 was isolated from the liver of diseased tortoiseMauremysnigricans, identified by morphologic observation, biochemical test, and sequencing analysis of 16S rRNA, and then the drug sensitivity was determind by Kirby-Bauer′s agar diffusion method. Results showed that the strain was gram negative bacterial. By analyzing the homology and phylogenetic relationship of 16S rRNA sequences in the NCBI database, the homology was found to be more than 98% compared toAcinetobacterbaumannii, which was in the same group withA.baumannii. Combining with the colonial morphology and biochemical results, the strain was identified asA.baumannii. Inoculating the strain toM.nigricansfor lethality indicated that the strain had pathogenicity and the same bacterium could be isolated from these animals. Meanwhile the drug sensitivity test showed the bacterium was sensitive to ceftazidime, kanamycin and fleroxacin, and multi-resistant to most antibiotics.

Mauremysnigricans;Acinetobacterbaumannii;isolation and identification; drug sensitive test

S947

A

1003-1111(2016)04-0426-05

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.04.020

2015-10-19；

2016-01-26.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31502036、31372228)；海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(314076、20153086)；海南省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(Hnky2016—15).

丁利(1982—)，女，副教授，博士；研究方向：動(dòng)物疾病. E-mail: dingli705@163.com. 通訊作者：史海濤(1963—)，男，教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：龜鱉生態(tài)學(xué). E-mail: haitao-shi@263.net.