王 磊，李 健，劉 寧，黎晨晨

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076）

TCA法脫除榛子殼多糖中蛋白質(zhì)的工藝研究

王 磊，*李 健，劉 寧，黎晨晨

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150076）

以廢棄的榛子殼為主要原料，先采用水浴浸提的方法對榛子殼的多糖進行提取，再對榛子殼粗多糖溶液進行脫蛋白處理，然后用紫外分光光度計對其進行蛋白吸光度的測定；采用單因素試驗和響應(yīng)面試驗，探討榛子殼粗多糖脫蛋白的研究。三氯乙酸（TCA）法對榛子殼粗多糖溶液進行脫蛋白試驗，結(jié)果表明三氯乙酸法脫蛋白的最佳工藝參數(shù)為三氯乙酸質(zhì)量分數(shù)4.2%，靜置時間20.11 min，樣液與TCA的體積比2.03∶1；在此條件下得到榛子殼粗多糖中蛋白的脫除率為77.21%，與模型的預(yù)測值79.62%基本吻合，說明響應(yīng)曲面所得數(shù)據(jù)可靠。

榛子殼；多糖；脫蛋白；響應(yīng)曲面法

榛子，也叫做山板栗、尖栗或者棰子，是一種十分重要的堅果[1]。它與核桃、扁桃和腰果并列被稱為世界上的四大干果，還有“堅果之王”的美譽[2]。榛子具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，其生物活性成分不僅在榛子果仁中，也存在于榛子殼中[3]。現(xiàn)代研究表明，榛子具有提高機體免疫力、降血糖、抑菌和抗氧化等作用，其中明確了多糖物質(zhì)是其中重要生物活性成分之一。除此之外，多糖還具有抗腫瘤生長、減少化療毒副作用和鎮(zhèn)靜安神等功效[4-6]。目前，榛子的應(yīng)用越來越廣泛，造成大量廢棄的榛子殼。為了變廢為寶，且對榛子殼多糖的研究還處于相對空白階段，所以提取廢棄榛子殼中的多糖具有一定價值。但是，在多糖的粗提物中往往含有大量蛋白質(zhì)，因此如何盡量多地去除蛋白質(zhì)而保留多糖的有效成分成為一個有積極意義的研究課題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

榛子，產(chǎn)自黑龍江??；磷酸（分析純），西隴化工股份有限公司提供；考馬斯亮藍G-250（分析純）、牛血清白蛋白（分析純），合肥博美生物科技有限責(zé)任公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

HZS-HX型超級恒溫水浴振蕩器，金壇市友聯(lián)儀器研究所產(chǎn)品；FA2004B型分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；UV5100B型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；80-2型離心機，上海逸龍科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 榛子殼多糖溶液蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍[7]法對榛子殼粗多糖溶液的蛋白質(zhì)含量進行測定。

（1）配制標準蛋白溶液和考馬斯亮藍G-250試劑。①標準蛋白溶液的配制：取20 mg的牛血清白蛋白，用蒸餾水定容至100 mL，制成200 mg/L的原液。②考馬斯亮藍G-250試劑的配制：稱取100 mg的考馬斯亮藍G-250，溶于50 mL的95%（V/V）乙醇中，再加入85%（V/V）的磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容至1 000 mL。

（2）制作榛子殼多糖溶液蛋白質(zhì)標準曲線。取7支試管，按表1中的數(shù)據(jù)依次進行取樣，然后分別加入配置好的5 mL考馬斯亮藍溶液，靜置10 min后于波長595 nm處進行比色，測定榛子殼多糖溶液蛋白質(zhì)的吸光度并記錄數(shù)值。

榛子殼多糖溶液蛋白質(zhì)含量測定取樣見表1。

表1 榛子殼多糖溶液蛋白質(zhì)含量測定取樣

（3）樣品中蛋白質(zhì)含量的測定。配制4%的榛子殼粗多糖溶液，吸取1 mL，加入5 mL的考馬斯亮藍溶液，靜置10 min，于波長595 nm處進行比色，測定蛋白質(zhì)的吸光度。

1.3.2 榛子殼多糖溶液脫蛋白的單因素分析

采用TCA法對多糖溶液進行脫蛋白處理。TCA法脫蛋白的單因素包括TCA質(zhì)量分數(shù)、靜置時間和樣品與TCA的體積比。通過對多糖溶液蛋白質(zhì)吸光度的測定，得到最優(yōu)方案。

（1）TCA質(zhì)量分數(shù)對脫蛋白效果的影響。配制質(zhì)量分數(shù)為2%，4%，6%，8%，10%，12%的TCA溶液，分別取5 mL不同質(zhì)量分數(shù)的TCA溶液加入裝有10 mL樣品的錐形瓶中，靜置20 min，離心10 min，得到脫蛋白的多糖溶液。測不同質(zhì)量分數(shù)下的蛋白質(zhì)吸光度。

（2）靜置時間對脫蛋白效果的影響。配制質(zhì)量分數(shù)為4%的TCA溶液，取5 mL溶液加入裝有10 mL樣品的錐形瓶中，分別靜置10，15，20，25，30 min，離心10 min，得到脫蛋白的多糖溶液。測不同靜置時間下的蛋白質(zhì)吸光度。

（3）樣品與TCA的體積比對脫蛋白效果的影響。配制質(zhì)量分數(shù)為4%的TCA溶液，分別按樣液與TCA的體積比4∶1，3∶1，2∶1，1∶1，1∶2，1∶3混合，靜置20 min，離心10 min，得到脫蛋白的多糖溶液。測樣品與TCA的不同體積比下蛋白質(zhì)吸光度。

1.3.3 榛子殼多糖溶液脫蛋白的響應(yīng)面試驗

根據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，以TCA質(zhì)量分數(shù)（X1）、靜置時間（X2）、樣液與TCA的體積比（X3）3個因素為自變量，以各個單因素的最優(yōu)工藝參數(shù)為中間水平，上下再分別取1個值作為響應(yīng)面試驗的3個水平，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法設(shè)計響應(yīng)面試驗，并按方程xi=(Xi-x0)/x對自變量進行編碼。其中，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，x0為試驗中心點處自變量的真實值，x為自變量的變化步長。

響應(yīng)面因素設(shè)計及編碼見表2。

表2 響應(yīng)面因素設(shè)計及編碼

2 結(jié)果與討論

2.1 榛子殼多糖溶液蛋白質(zhì)測定標準曲線的繪制

根據(jù)表2，于波長595 nm處測定多糖溶液中蛋白質(zhì)的吸光度，并繪制標準曲線，得回歸方程：Y=0.004 92X+0.004 91，R2=0.999 37。

榛子殼多糖溶液蛋白質(zhì)標準曲線見圖1。

圖1 榛子殼多糖溶液蛋白質(zhì)標準曲線

2.2 榛子殼多糖溶液脫蛋白單因素的試驗結(jié)果與分析

2.2.1 三氯乙酸（TCA） 質(zhì)量分數(shù)對榛子殼多糖溶液中蛋白脫除率的影響結(jié)果

TCA質(zhì)量分數(shù)對榛子殼多糖溶液中蛋白脫除率的影響結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在相同的條件下，隨著TCA質(zhì)量分數(shù)的增加，蛋白脫除率有明顯的增加趨勢，說明隨著TCA質(zhì)量分數(shù)的增加對蛋白質(zhì)分解有一定的促進作用。當TCA質(zhì)量分數(shù)達到4%時，蛋白脫除率達到最大值；當TCA質(zhì)量分數(shù)繼續(xù)增加時，蛋白脫除率幾乎保持不變，說明質(zhì)量分數(shù)變大，脫除效果幾乎保持不變。因此從經(jīng)濟上考慮，TCA質(zhì)量分數(shù)4%對榛子殼多糖溶液脫蛋白較為合適。

圖2 TCA質(zhì)量分數(shù)對榛子殼多糖溶液中蛋白脫除率的影響結(jié)果

2.2.2 靜置時間對榛子殼多糖溶液中蛋白脫除率的影響結(jié)果

靜置時間對榛子殼多糖溶液中蛋白脫除率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 靜置時間對榛子殼多糖溶液中蛋白脫除率的影響結(jié)果

由圖3可知，在相同的條件下，隨著靜置時間的增加，榛子殼多糖溶液蛋白脫除率逐漸增加，粒子間相互碰撞放出熱量，加速反應(yīng)。當靜置時間達到20 min時，榛子殼多糖溶液脫蛋白率達到最大值；之后隨著靜置時間繼續(xù)增加時，蛋白脫除率則明顯的下降。說明靜置時間為20 min時，是榛子殼多糖溶液脫蛋白的最適時間。

2.2.3 樣液與TCA體積比對榛子殼多糖溶液中蛋白脫除率的影響結(jié)果

樣液與TCA體積比對榛子殼多糖溶液中蛋白脫除率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 樣液與TCA體積比對榛子殼多糖溶液中蛋白脫除率的影響結(jié)果

由圖4可知，在相同的條件下，隨著樣液與TCA體積比的逐漸減少，榛子殼多糖溶液蛋白脫除率不斷增加；隨著體積比增加，反應(yīng)更加充分。當液品與TCA體積比達到2∶1時，蛋白脫除率也達到最大值；當繼續(xù)增加樣液與TCA的體積比時，脫蛋白率逐漸減少。所以，取樣液與TCA體積比2∶1時為榛子殼多糖溶液脫蛋白的最優(yōu)結(jié)果。

2.3 TCA法脫除榛子殼多糖溶液中蛋白質(zhì)響應(yīng)面的試驗結(jié)果與分析

2.3.1 回歸模型的建立

由于試驗過程中，各因素的作用交互影響，為了全面考察各個因素的影響，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計了以TCA質(zhì)量分數(shù)、靜置時間、樣液與TCA的體積比為因素L9（34）試驗。

榛子殼多糖提取率影響的響應(yīng)面法試驗設(shè)計見表3。

表3 榛子殼多糖提取率影響的響應(yīng)面法試驗設(shè)計

2.3.2 回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗

回歸方程系數(shù)的顯著性分析見表4。

表4 回歸方程系數(shù)的顯著性分析

根據(jù)響應(yīng)面法對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到回歸方程為：

其中：Y——蛋白脫除率，%；

X1——TCA質(zhì)量分數(shù)，%；

X2——靜置時間，min；

X3——樣液與TCA的體積比，V∶V。

根據(jù)表4回歸方程系數(shù)的顯著性分析數(shù)值可知，試驗所選用的模型高度顯著（p＜0.000 1）。模型一次項X1，X2，X3顯著（p＜0.05），模型交互項X1X3顯著（p＜0.05）；模型一次項X2和X3不顯著（p＞0.05）；模型交互項X1X2不顯著（p＞0.05），交互項X2X3不顯著（p＞0.05）；模型二次項X，X和X極顯著（p＜0.000 1）。

2.3.3 榛子殼多糖溶液脫蛋白的響應(yīng)面分析

TCA質(zhì)量分數(shù)和靜置時間的交互作用對榛子殼多糖溶液蛋白脫除率的影響見圖5，TCA質(zhì)量分數(shù)和樣液與TCA體積比的交互作用對榛子殼多糖溶液蛋白脫除率的影響見圖6，靜置時間和樣液與TCA的體積比對榛子殼多糖溶液蛋白脫除率的影響見圖7。

圖5 TCA質(zhì)量分數(shù)和靜置時間的交互作用對榛子殼多糖溶液蛋白脫除率的影響

由圖5～圖7可知，TCA質(zhì)量分數(shù)和靜置時間、TCA質(zhì)量分數(shù)和樣液與TCA體積比、靜置時間和樣液與TCA的體積比對榛子殼多糖溶液蛋白脫除率的影響等交互項對TCA法分離純化榛子殼多糖溶液的蛋白質(zhì)脫除率表現(xiàn)出了很好的顯著性。此外，由圖5～圖7可知，各個響應(yīng)曲面均為凸面，表明該模型在試驗范圍內(nèi)存在穩(wěn)定點，且穩(wěn)定點為最大值。

利用Design Expert軟件對試驗?zāi)Ｐ瓦M行分析，得到TCA法脫除蛋白質(zhì)的最優(yōu)條件為TCA質(zhì)量分數(shù)4.2%，靜置時間20.11 min，樣液與TCA的體積比2.03∶1，TCA法脫除榛子殼多糖中蛋白質(zhì)的脫除率為79.62%。為了方便實際操作，選取TCA質(zhì)量分數(shù)為4%，靜置時間為20 min，樣液與TCA的體積比為2，在此條件下進行平行驗證試驗3次，榛子殼多糖中蛋白質(zhì)的脫除率平均值是77.21%，與模型的理論值79.62%較為接近，表明數(shù)字模型對優(yōu)化TCA法脫除榛子殼多糖中蛋白質(zhì)的工藝可行。

圖6 TCA質(zhì)量分數(shù)和樣液與TCA體積比的交互作用對榛子殼多糖溶液蛋白脫除率的影響

圖7 靜置時間和樣液與TCA的體積比對榛子殼多糖溶液蛋白脫除率的影響

3 結(jié)論

以榛子殼為主要原料，用TCA試劑對榛子殼的多糖溶液進行脫蛋白處理，進而達到把榛子殼多糖溶液分離純化的目的，其中用分光光度計分別測量多糖溶液脫蛋白前后的蛋白質(zhì)吸光度，根據(jù)數(shù)值的測定得到脫蛋白的最優(yōu)工藝參數(shù)。

結(jié)果表明，各因素對榛子殼多糖溶液脫蛋白影響的顯著性表現(xiàn)結(jié)果為樣液與TCA的體積比＞TCA質(zhì)量分數(shù)＞靜置時間。通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化TCA法脫蛋白工藝條件，得到最佳工藝參數(shù)TCA質(zhì)量分數(shù)4.2%，樣液與TCA的體積比2.03∶1，靜置時間20.11 min；在此條件下平行試驗3次，得到榛子殼多糖的蛋白脫除率為77.21%，與模型的預(yù)測值79.62%基本吻合，數(shù)據(jù)可靠。

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[2]馬勇，張麗娜，齊鳳元，等.榛子蛋白質(zhì)提取及功能特性研究 [J].食品科學(xué)，2008（8）：318-322.

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Study on Separation and Purification of Hazelnut Shell Polysaccharide TCA Method

WANG Lei，*LI Jian，LIU Ning，LI Chenchen （School of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

With hazelnut shell as main raw material.First，by using water bath method of hazelnut shell polysaccharide solution extraction.The hazelnut shell polysaccharide solution for deproteinization.The absorbance of protein are determined by spectrophotometer.This experiment adopts three trichloroacetic acid method of hazelnut shell polysaccharide solution and protein.The results show that optimal process parameters for the three.Three the concentration of chlorine acid is 4.0%，and the settling time is 20 minutes，the ratic of sample to 2 is TCA.And response surface experiment，The most optimal results is Three the concentration of chlorine acid is 4.2%，and the settling time is 20.11 minutes，the ratic of sample to 2.03 is TCA.Under these conditions，the hazelnut shell in the coarse polysaccharide protein removal rate is 77.21%.The removal rate of protein in consistent with the model value of 79.59%.Therefore，the response surface data are reliable.

hazelnut shell；polysaccharide；removal of protein；response surface

S664.4

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.11.039

1671-9646（2016）11b-0038-04

2016-09-25

王 磊（1989—），男，在讀碩士，研究方向為食品科學(xué)。

*通訊作者：李 健（1956—），男，本科，教授，研究方向為食品科學(xué)。