王東巖,孫 艷,董 旭,李 影,李 鐵

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

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電針對腦梗死大鼠缺血區(qū)BDNF及CREB表達(dá)影響的研究*

王東巖1,2,孫 艷1△,董 旭1,2,李 影1,李 鐵1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

目的：通過觀察電針刺激“前三里穴”和“外關(guān)穴”，探討電針治療腦梗死的作用機(jī)制。方法：將健康雄性SPF級SD大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組和電針組。應(yīng)用線栓法制備大鼠局造性腦梗死模型。分別在1、3、7、14、21天用網(wǎng)屏實驗評分法對各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況進(jìn)行評定；各組大鼠在治療結(jié)束后取材。采用免疫組織化學(xué)方法觀察腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)在大鼠缺血區(qū)的陽性表達(dá)。結(jié)果：空白組、假手術(shù)組網(wǎng)評實驗評分為0，術(shù)后1天評分最高，術(shù)后21天評分最低，術(shù)后各時間點，模型組與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。術(shù)后3、7天，電針組與空白組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，電針組與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后14、21天，電針組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，電針組與空白組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模后腦內(nèi)BDNF表達(dá)水平顯著下降，電針治療后BDNF表達(dá)上升。空白組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組、電針組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；電針與模型組比較，差異顯著(P<0.05)。造模后腦內(nèi)CREB表達(dá)水平顯著下降，電針治療后CREB表達(dá)上升?？瞻捉M與假手術(shù)組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；電針組、模型組與空白組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；電針組與模型組對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：電針可以改善腦梗死后運動功能障礙并上調(diào)BDNF、CREB的表達(dá)。電針干預(yù)對腦梗死具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其缺血區(qū)周圍BDNF、CREB陽性表達(dá)水平上調(diào)有關(guān)。

腦梗死;電針;BDNF;CREB

腦梗死，也稱缺血性腦卒中，近年來其發(fā)病率逐年上升，且復(fù)發(fā)率高、致殘率高、死亡率高，患者日常生活活動明顯受限，為家庭和社會帶來沉重影響。因此，對本病的治療已成為研究熱點。電針治療腦梗死的療效已得到世界范圍的認(rèn)可。大量研究證實,電針對腦梗死有明確的治療作用,是治療腦梗死后運動功能障礙的有效方法。但電針治療腦梗死的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)是體內(nèi)含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子，環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)可通過增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活，增加突觸可塑性和神經(jīng)發(fā)生。本實驗的目的是研究電針治療腦梗死的作用機(jī)制，本課題在制備大鼠大腦中動脈梗死模型基礎(chǔ)上，采用神經(jīng)行為學(xué)評估、免疫組織化學(xué)技術(shù)方法，觀察電針對腦梗死大鼠前肢運動功能障礙的恢復(fù)情況以及缺血區(qū)周圍皮質(zhì)BDNF、CREB的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

BDNF、CREB羊抗兔多克隆抗體由北京博奧拓達(dá)公司提供，PV6001、DAB由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物與分組

健康雄性SPF級SD大鼠60只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價中心提供,動物使用許可證：SYXX(黑)2010007，鼠齡4～5個月，體質(zhì)量(250±20)g，隨機(jī)分為空白組10只、假手術(shù)組10只、模型組20只、電針組20只。通過阻閉大鼠大腦中動脈法，誘導(dǎo)局灶性腦缺血模型。術(shù)前12h 大鼠禁食不禁水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5ml/kg)，待麻醉后，仰臥位固定于操作臺，剪除頸部施術(shù)取毛發(fā)，消毒，在兩側(cè)下頜骨連線中點，頸部正中旁開0.5cm，做長約1～2cm切口，逐層剝離筋膜和肌層，輕輕撕裂動脈鞘，暴露并鈍性分離CCA、ECA及ICA，距離分叉處遠(yuǎn)端結(jié)扎CCA，距離分叉處近端結(jié)扎ECA，動脈夾夾閉CCA分叉處下方，在動脈夾下方用眼科剪斜45°剪一小切口，栓線緩慢插入，固定栓線，去掉動脈夾，使栓線進(jìn)入ICA17～18mm，再次固定栓線，剪掉多余栓線(剪除過程中注意防止栓線脫落)及結(jié)扎線。沖洗傷口后縫合組織皮膚，再次消毒。術(shù)后動物置于清潔干燥鼠籠內(nèi)，白熾燈加熱保暖。

1.3 電針治療方案

參照華興邦等制定的《實驗動物腧穴圖譜》[1]選取前三里穴、外關(guān)穴，直刺1mm。連接頻率刺激器，50Hz，連續(xù)波，每次20min，每日1次,21天。在電針組治療同時空白組、假手術(shù)組和模型組進(jìn)行綁縛處理。

1.4 網(wǎng)屏實驗

實驗上放置海綿，距地面80cm，屏幕水平放置，將大鼠放在中央，然后慢慢地將其一端抬高，2s將屏幕到垂直位置，保持5s進(jìn)行觀察。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：保持5s，不落；1：暫時保持，滑動一段距離，但不落；2：5s內(nèi)落下；3分：網(wǎng)屏轉(zhuǎn)動時，大鼠立刻掉下來[2]。

1.5 取材檢測

各組大鼠治療結(jié)束后腹腔麻醉，4℃生理鹽水經(jīng)心臟灌注，待兩肺變白后，灌注4℃4%多聚甲醛。灌注成功后，取出腦組織后迅速剝離缺血區(qū)，原液固定5h，脫水、包埋、切片，采用PV二步法檢測BDNF、CREB表達(dá)情況，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，以積分光密度(IOD)代表基因和蛋白相對表達(dá)量，積分光密度(IOD)=陽性面積×平均光密度，每組每例隨機(jī)分析3個高倍鏡視野倍，取其均值代表該照片的相對表達(dá)量。染色結(jié)果細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性為黃色或黃棕色。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 電針對MCAO模型大鼠行為學(xué)影響

空白組、假手術(shù)組網(wǎng)評實驗評分為0，術(shù)后1天評分最高，術(shù)后21天評分最低，術(shù)后各時間點模型組與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。隨著腦缺血時間的延長，模型組評分逐漸降低，說明大鼠腦缺血后有一定的自愈性。術(shù)后1天，電針組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后3、7天，電針組與空白組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，電針組與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后14、21天，電針組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，電針組與空白組對比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損

2.2 電針對MCAO大鼠缺血皮層BDNF、CREB陽性表達(dá)情況

造模后腦內(nèi)BDNF、CREB表達(dá)水平顯著下降，電針治療后BDNF、CREB表達(dá)上升。空白組與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組、電針組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；電針與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠缺血區(qū)周圍皮質(zhì)BDNF、CREB積分光密度比較

3 討論

腦梗死主要原因是腦組織局部血供動脈的突然減少或閉塞，以至于該血管供血區(qū)的腦組織缺血、缺氧，致使腦組織軟化、壞死，相應(yīng)的癥狀和體征，如昏迷、偏癱、失語等神經(jīng)功能缺損均與相應(yīng)的血管相關(guān)。腦卒中是目前導(dǎo)致人類死亡的三大疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率的特點。近年來，腦梗死發(fā)病有逐年增多的趨勢。盡管通過物理療法、口服或靜點中藥、西藥等多種方法進(jìn)行治療，在較大程度上降低了本病的致死率，但致殘率一直居高不降。腦梗死病人往往存在不同程度的意識障礙、運動功能障礙、感覺障礙、認(rèn)知障礙、語言障礙等問題。其中，約有75%的病人遺留不同程度的上肢功能障礙，嚴(yán)重影響了患者的日常生活活動能力，降低了患者的生活質(zhì)量[3]。電針治療腦梗死的實驗研究中，電針對缺血腦組織的保護(hù)作用明顯。大量的科學(xué)研究已經(jīng)證明，針灸在腦梗死發(fā)展的各個方面發(fā)揮了逆轉(zhuǎn)疾病的作用[4]。目前，針灸治療腦梗死的機(jī)制尚未明確。大量的研究證實，針灸具有多靶向功能，可以通過調(diào)節(jié)多條通路使腦梗死后功能障礙的到改善。

BDNF歸屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族(為第二位重要因子)。在所有神經(jīng)營養(yǎng)因子成員中，BDNF的活性作用最強(qiáng)，它通過神經(jīng)軸突逆行運輸至神經(jīng)元胞體，與特異的神經(jīng)元受體結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生理功能[5]。而且BDNF在脊椎動物中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中作用廣泛[6]，它能促進(jìn)許多神經(jīng)元發(fā)揮生理作用(生存、發(fā)育、分化、再生等)，維持神經(jīng)細(xì)胞代謝功能,并對增強(qiáng)中樞及周圍神經(jīng)的營養(yǎng)、支持、保護(hù)及功能表達(dá)發(fā)揮重要作用[7]。CREB是堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個成員，它是一種高選擇性結(jié)合cAMP反應(yīng)元件的核蛋白。BDNF通過與TrkB的結(jié)合而發(fā)揮作用。TrkB的胞內(nèi)區(qū)域具有內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，BDNF與TrkB結(jié)合后激活胞內(nèi)區(qū)域，在CREB的絲氨酸位點激活CREB，使其磷酸化。磷酸化的CREB通過增加BDNF基因的表達(dá)，來促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生存，為腦缺血保護(hù)機(jī)制之一[8]。本研究表明，腦梗死后BDNF、CREB表達(dá)顯著下降，而電針治療可以改善腦梗死大鼠運動功能，上調(diào)BDNF、CREB的陽性表達(dá)水平，進(jìn)一步證明電針干預(yù)對腦梗死具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其缺血區(qū)周圍BDNF、CREB陽性表達(dá)水平上調(diào)有關(guān)。

[1] 華興邦,周浩良.大鼠穴位圖譜的研制[J].動物與動物實驗,1991(1):1-5

[2] Rivlin AS,And CH,Tator.Objective clinical assessment of motor function after experimental spinal cord injury in the rat[J].Neurosurg,1977,47(4):577-81

[3] 陳健安.董氏奇穴治療中風(fēng)后上肢痙攣性偏癱的臨床觀察[D].廣州:南方醫(yī)科大學(xué),2015

[4] 慎宰瑩.應(yīng)用功能磁共振成像(fMRI)對頭針治療中風(fēng)偏癱后腦功能重塑機(jī)制研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2013

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[6] Binder DK.The role of BDNF in epilepsy and other diseases of the mature nervous system[J].Advances in Experimental Medicine & Biology,2004,548(548):34-56

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[8] 江東,于建云.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子臨床研究進(jìn)展[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2011(2):221-225

國家自然科學(xué)基金，編號:81473763。

王東巖(1971-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，從事神經(jīng)功能障礙的針灸康復(fù)治療與評價方面的研究。

△通訊作者：孫艷(1992-)，女，2013級針灸推拿學(xué)專業(yè)碩士研究生。

R246.6

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1005-0779(2016)10-0084-03

2016-05-01