王東巖,孫 艷,董 旭,李 影,李 鐵
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150001)
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電針對腦梗死大鼠缺血區(qū)BDNF及CREB表達影響的研究*
王東巖1,2,孫 艷1△,董 旭1,2,李 影1,李 鐵1
(1.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150001)
目的:通過觀察電針刺激“前三里穴”和“外關穴”,探討電針治療腦梗死的作用機制。方法:將健康雄性SPF級SD大鼠隨機分為空白組、假手術組、模型組和電針組。應用線栓法制備大鼠局造性腦梗死模型。分別在1、3、7、14、21天用網(wǎng)屏實驗評分法對各組大鼠神經(jīng)功能缺損情況進行評定;各組大鼠在治療結束后取材。采用免疫組織化學方法觀察腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)在大鼠缺血區(qū)的陽性表達。結果:空白組、假手術組網(wǎng)評實驗評分為0,術后1天評分最高,術后21天評分最低,術后各時間點,模型組與空白組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。術后3、7天,電針組與空白組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),電針組與模型組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術后14、21天,電針組與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),電針組與空白組對比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模后腦內(nèi)BDNF表達水平顯著下降,電針治療后BDNF表達上升??瞻捉M與假手術組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);模型組、電針組與空白組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);電針與模型組比較,差異顯著(P<0.05)。造模后腦內(nèi)CREB表達水平顯著下降,電針治療后CREB表達上升??瞻捉M與假手術組對比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);電針組、模型組與空白組對比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);電針組與模型組對比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論:電針可以改善腦梗死后運動功能障礙并上調(diào)BDNF、CREB的表達。電針干預對腦梗死具有神經(jīng)保護作用,其機制可能與其缺血區(qū)周圍BDNF、CREB陽性表達水平上調(diào)有關。
腦梗死;電針;BDNF;CREB
腦梗死,也稱缺血性腦卒中,近年來其發(fā)病率逐年上升,且復發(fā)率高、致殘率高、死亡率高,患者日常生活活動明顯受限,為家庭和社會帶來沉重影響。因此,對本病的治療已成為研究熱點。電針治療腦梗死的療效已得到世界范圍的認可。大量研究證實,電針對腦梗死有明確的治療作用,是治療腦梗死后運動功能障礙的有效方法。但電針治療腦梗死的作用機制還有待于進一步的研究。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)是體內(nèi)含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子,環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)可通過增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的表達,促進神經(jīng)細胞的存活,增加突觸可塑性和神經(jīng)發(fā)生。本實驗的目的是研究電針治療腦梗死的作用機制,本課題在制備大鼠大腦中動脈梗死模型基礎上,采用神經(jīng)行為學評估、免疫組織化學技術方法,觀察電針對腦梗死大鼠前肢運動功能障礙的恢復情況以及缺血區(qū)周圍皮質(zhì)BDNF、CREB的表達情況。
1.1 主要試劑與儀器
BDNF、CREB羊抗兔多克隆抗體由北京博奧拓達公司提供,PV6001、DAB由北京中杉金橋生物技術有限公司提供,其它試劑為國產(chǎn)分析純。
1.2 實驗動物與分組
健康雄性SPF級SD大鼠60只,由黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全評價中心提供,動物使用許可證:SYXX(黑)2010007,鼠齡4~5個月,體質(zhì)量(250±20)g,隨機分為空白組10只、假手術組10只、模型組20只、電針組20只。通過阻閉大鼠大腦中動脈法,誘導局灶性腦缺血模型。術前12h 大鼠禁食不禁水。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5ml/kg),待麻醉后,仰臥位固定于操作臺,剪除頸部施術取毛發(fā),消毒,在兩側(cè)下頜骨連線中點,頸部正中旁開0.5cm,做長約1~2cm切口,逐層剝離筋膜和肌層,輕輕撕裂動脈鞘,暴露并鈍性分離CCA、ECA及ICA,距離分叉處遠端結扎CCA,距離分叉處近端結扎ECA,動脈夾夾閉CCA分叉處下方,在動脈夾下方用眼科剪斜45°剪一小切口,栓線緩慢插入,固定栓線,去掉動脈夾,使栓線進入ICA17~18mm,再次固定栓線,剪掉多余栓線(剪除過程中注意防止栓線脫落)及結扎線。沖洗傷口后縫合組織皮膚,再次消毒。術后動物置于清潔干燥鼠籠內(nèi),白熾燈加熱保暖。
1.3 電針治療方案
參照華興邦等制定的《實驗動物腧穴圖譜》[1]選取前三里穴、外關穴,直刺1mm。連接頻率刺激器,50Hz,連續(xù)波,每次20min,每日1次,21天。在電針組治療同時空白組、假手術組和模型組進行綁縛處理。
1.4 網(wǎng)屏實驗
實驗上放置海綿,距地面80cm,屏幕水平放置,將大鼠放在中央,然后慢慢地將其一端抬高,2s將屏幕到垂直位置,保持5s進行觀察。評分標準:0分:保持5s,不落;1:暫時保持,滑動一段距離,但不落;2:5s內(nèi)落下;3分:網(wǎng)屏轉(zhuǎn)動時,大鼠立刻掉下來[2]。
1.5 取材檢測
各組大鼠治療結束后腹腔麻醉,4℃生理鹽水經(jīng)心臟灌注,待兩肺變白后,灌注4℃4%多聚甲醛。灌注成功后,取出腦組織后迅速剝離缺血區(qū),原液固定5h,脫水、包埋、切片,采用PV二步法檢測BDNF、CREB表達情況,采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達進行定量分析,以積分光密度(IOD)代表基因和蛋白相對表達量,積分光密度(IOD)=陽性面積×平均光密度,每組每例隨機分析3個高倍鏡視野倍,取其均值代表該照片的相對表達量。染色結果細胞核呈藍色,陽性為黃色或黃棕色。
1.6 統(tǒng)計學分析
2.1 電針對MCAO模型大鼠行為學影響
空白組、假手術組網(wǎng)評實驗評分為0,術后1天評分最高,術后21天評分最低,術后各時間點模型組與空白組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。隨著腦缺血時間的延長,模型組評分逐漸降低,說明大鼠腦缺血后有一定的自愈性。術后1天,電針組與模型組相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。術后3、7天,電針組與空白組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),電針組與模型組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術后14、21天,電針組與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),電針組與空白組對比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。
表1 腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損
2.2 電針對MCAO大鼠缺血皮層BDNF、CREB陽性表達情況
造模后腦內(nèi)BDNF、CREB表達水平顯著下降,電針治療后BDNF、CREB表達上升??瞻捉M與假手術組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);模型組、電針組與空白組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);電針與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。
表2 各組大鼠缺血區(qū)周圍皮質(zhì)BDNF、CREB積分光密度比較
腦梗死主要原因是腦組織局部血供動脈的突然減少或閉塞,以至于該血管供血區(qū)的腦組織缺血、缺氧,致使腦組織軟化、壞死,相應的癥狀和體征,如昏迷、偏癱、失語等神經(jīng)功能缺損均與相應的血管相關。腦卒中是目前導致人類死亡的三大疾病之一,具有高發(fā)病率、高致殘率的特點。近年來,腦梗死發(fā)病有逐年增多的趨勢。盡管通過物理療法、口服或靜點中藥、西藥等多種方法進行治療,在較大程度上降低了本病的致死率,但致殘率一直居高不降。腦梗死病人往往存在不同程度的意識障礙、運動功能障礙、感覺障礙、認知障礙、語言障礙等問題。其中,約有75%的病人遺留不同程度的上肢功能障礙,嚴重影響了患者的日常生活活動能力,降低了患者的生活質(zhì)量[3]。電針治療腦梗死的實驗研究中,電針對缺血腦組織的保護作用明顯。大量的科學研究已經(jīng)證明,針灸在腦梗死發(fā)展的各個方面發(fā)揮了逆轉(zhuǎn)疾病的作用[4]。目前,針灸治療腦梗死的機制尚未明確。大量的研究證實,針灸具有多靶向功能,可以通過調(diào)節(jié)多條通路使腦梗死后功能障礙的到改善。
BDNF歸屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族(為第二位重要因子)。在所有神經(jīng)營養(yǎng)因子成員中,BDNF的活性作用最強,它通過神經(jīng)軸突逆行運輸至神經(jīng)元胞體,與特異的神經(jīng)元受體結合發(fā)揮相應的生理功能[5]。而且BDNF在脊椎動物中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中作用廣泛[6],它能促進許多神經(jīng)元發(fā)揮生理作用(生存、發(fā)育、分化、再生等),維持神經(jīng)細胞代謝功能,并對增強中樞及周圍神經(jīng)的營養(yǎng)、支持、保護及功能表達發(fā)揮重要作用[7]。CREB是堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個成員,它是一種高選擇性結合cAMP反應元件的核蛋白。BDNF通過與TrkB的結合而發(fā)揮作用。TrkB的胞內(nèi)區(qū)域具有內(nèi)在的酪氨酸激酶活性,BDNF與TrkB結合后激活胞內(nèi)區(qū)域,在CREB的絲氨酸位點激活CREB,使其磷酸化。磷酸化的CREB通過增加BDNF基因的表達,來促進神經(jīng)細胞生存,為腦缺血保護機制之一[8]。本研究表明,腦梗死后BDNF、CREB表達顯著下降,而電針治療可以改善腦梗死大鼠運動功能,上調(diào)BDNF、CREB的陽性表達水平,進一步證明電針干預對腦梗死具有神經(jīng)保護作用,其機制可能與其缺血區(qū)周圍BDNF、CREB陽性表達水平上調(diào)有關。
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國家自然科學基金,編號:81473763。
王東巖(1971-),女,教授,博士研究生導師,從事神經(jīng)功能障礙的針灸康復治療與評價方面的研究。
△通訊作者:孫艷(1992-),女,2013級針灸推拿學專業(yè)碩士研究生。
R246.6
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1005-0779(2016)10-0084-03
2016-05-01