徐 虹，張亞敏，孫 華，陳素輝，王富明，楊 楊

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院，北京 100730)

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實驗研究

針刺對腦缺血大鼠外周血miRNA-126和VEGF表達的干預作用*

徐 虹，張亞敏，孫 華△，陳素輝，王富明，楊 楊

(中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院，北京 100730)

目的：以腦缺血再灌注損傷后外周血清中血管再生相關信號的表達為切入點，觀察針刺百會、足三里穴對腦缺血再灌注損傷大鼠外周血miRNA-126和血管內皮生長因子(VEGF)表達的影響。方法：隨機數(shù)字表法將SD大鼠分為假手術組、模型組、針刺組和藥物組，各組大鼠根據(jù)再灌注后時間隨機分為1天、3天、5天和7天4個時間點。以右側大腦中動脈線栓法制備腦缺血再灌注損傷模型。TTC法驗證模型成功與否。針刺組為造模成功后在規(guī)定時間內針刺百會和左足三里穴；藥物組為造模成功后腹腔注射依達拉奉。腹主動脈采血后，實時熒光定量PCR法檢測血清miRNA-126的表達；ELISA法檢測血清VEGF的表達情況。結果： 模型組miRNA-126和VEGF表達升高，3天時間點達高峰，高于同時間點的針刺組和藥物組；除1天時間點外，針刺組miRNA-126和VEGF表達高于同時間點的藥物組。結論： 針刺大鼠百會、足三里穴可能通過下調miRNA-126及VEGF的表達干預腦缺血再灌注損傷后血管再生。

針刺；腦缺血；miRNA-126；血管內皮生長因子

血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種刺激血管內皮生長促進血管再生的信號蛋白，當血液循環(huán)差或者氧供不足的情況下，血液中的VEGF增多，促進側枝循環(huán)的建立。近年研究發(fā)現(xiàn)，VEGF增生的血管往往是不成熟的,有增加血管滲透性的風險[1]。在臨床上，VEGF被證明與急性腦梗死病人腦梗死的嚴重程度正相關[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類高度保守的非編碼小RNA， miRNAs在缺血性腦血管病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。如miRNA-126在內皮細胞中特異性表達并調控血管生成，對維持血管的完整性及血管生成方面有重要作用。近來研究表明，miRNA-126可正向調節(jié)VEGF受體-2或VEGF mRNA的表達[3-4]，促進新生血管的形成。而且動物實驗研究表明miRNA-126可能與腦缺血再灌注損傷動物的損傷嚴重程度正相關[5]。因此VEGF和miRNA-126可能是腦缺血再灌注損傷(Cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI)后的和腦損傷程度相關的兩個重要相關分子。本實驗采用針刺百會、足三里穴，研究其對腦缺血再灌注損傷后大鼠外周血中血管再生相關因子VEGF和miRNA-126表達的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗試劑、材料和儀器

VEGF試劑盒(R&D公司 RRV00，美國 )；RNAlater RNA Stabilization Reagent( Invitrogen，美國)、Trizol LS (Invitrogen 10296-010，美國)；QuantiTect Reverse Transcription Kit(Qiagen 205310，德國)；Rotor-Gene Multiplex PCR Kit (Qiagen 204772，德國)；依達拉奉注射液(批注文號：國藥準字H20050280，中國，南京先聲東元制藥有限公司)。主要試驗儀器：熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(伯樂CFX96，美國)；普通PCR儀(伯樂 C1000，美國)；低溫離心機等(ALC，意大利)；標準規(guī)格酶標儀(THERMO Multiskan MK3，美國)；長城牌KWD-808Ⅱ全能脈沖電療儀(中國，常州)；漢醫(yī)牌一次性無菌針灸針(中國，天津)。

1.2 實驗分組

根據(jù)隨機數(shù)字表法將144只健康雄性SD大鼠分為假手術組(S)、模型組(M)、針刺組(A)和藥物組(ED)4個大組，后3組先制作MCAO模型，然后根據(jù)再灌注時間又分為1天、3天、5天和7天組。假手術組1天、3天、5天、7天時間點設8只大鼠。根據(jù)以往實驗數(shù)據(jù)，考慮造模動物死亡率，模型組、針刺組及藥物組1天、3天、5天、7天時間點設為9只大鼠。最終各個時間點存活的模型組、電針組及藥物組均為8只。

1.3 大腦中動脈線栓模型和腦缺血再灌注大鼠制備

參考Longa等[6]的線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。術前大鼠禁食禁水(12h)，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后將大鼠固定于操作臺，消毒后行頸部正中縱行切口，逐步分離頸部肌肉以及其他組織后暴露右側頸總動脈，頸內動脈和頸外動脈，注意保護周圍血管神經(jīng)。分離大鼠右側頸外動脈后結扎頸外動脈遠心端，并用纖維剪在頸外動脈上剪一個口，將標有黑色記號的線栓插入頸外動脈。剪斷頸外動脈后調整線栓方向直至線栓進入頸內動脈，遇到一定阻力后停止，阻斷右側大腦中動脈入口，線栓插入長度約為18cm。用細線固定線栓，縫合后讓大鼠休息。腦缺血2h后緩慢拔出線栓直至看到線栓的黑色標記后剪掉線栓。大鼠清醒后自由接觸食物和水。

1.4 實驗處理

模型組：造模成功后，不做進一步治療，僅每日給予抓取刺激1次。假手術組：模擬手術過程至分離頸內、頸外動脈后，不做進一步造模，直接縫合組織、皮膚。針刺組：造模成功后的SD大鼠，按照規(guī)定的時間點，常規(guī)消毒，選用一次性無菌針灸針，針刺百會穴和左側足三里穴，接脈沖治療儀，采用疏密波，頻率2Hz，強度2mA，以局部肌肉出現(xiàn)收縮為度，每日1次，每次20min。藥物組：造模成功后，腹腔注射依達拉奉3mg/kg，每日1次。

1.5 血清樣品的提供

實驗大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血于室溫下靜置2h，離心(3500rpm，20min)，分離血清；將血清分裝，于-80℃冰箱存放備用。后室溫冰盒上融解備用。

1.6 免疫吸附法(ELISA)測定大鼠外周血VEGF的水平

稀釋標準品后，室溫溫育2h，洗滌4次，加入抗-VEGF抗體100μl，室溫溫育1h，加鏈酶親和素100μl。后加底物100μl 37℃避光顯色15min。加終止液100μl，終止反應。450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.7 實時熒光定量PCR法檢測腦缺血大鼠外周血清中miRNA-126的表達

用Trizol LS提取血清組織樣本中總RNA，然后莖環(huán)引物還是反轉錄成cDNA，反向引物和通用引物擴增后，以U6為內參基因，伯樂CFX96熒光定量PCR檢測系統(tǒng)檢測miRNA-126在血清中的表達。實時熒光定量PCR擴增反應條件：95℃RNA酶失活5min，95℃變性30s，72℃延伸30s，循環(huán)42次。用Primer premier 5等引物設計軟件設計引物。miRNA-126引物設計序列如下：Sequence 9-CAUUAUUACUUUUGGUACGCG-29CGCGTAC莖環(huán)反向引物：GTCGTATCCAGCTCAGGTCG AGGTGATCACTGGATACGACCGCGTAC上游正向引物：ACACTCAGCTGGCATTATTACTTTTGG 27bp 64.7通用反向引物：TCCAGCTCAGGTCGAGGTGATC 22bp 63.7。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 實驗結果

2.1 TTC染色情況

假手術組大鼠(A)雙側腦組織呈鮮紅色，未見缺血性改變；腦缺血再灌注損傷大鼠(B)右側腦組織大腦中動脈供血區(qū)域，可見到白色的梗死灶，與鮮紅色的正常腦組織形成對比。驗證模型成功。見封三彩圖1。

2.2 實驗各組大鼠不同時間點外周血清miRNA-126表達情況

假手術組大鼠各個時間點外周血清miRNA-126少量表達；除1天時間點外，腦缺血各組(模型組、針刺組、藥物組)大鼠各個時間點外周血清中miRNA-126表達顯著升高，針刺組和藥物組的表達顯著低于模型組(P<0.05)，但是針刺組miRNA-126的表達高于藥物組(P<0.05)；模型組、針刺組和藥物組的峰值時間均在3天時間點。見表1、圖2。

2.3 實驗各組大鼠不同時間點外周血清VEGF表達情況

假手術組大鼠各個時間點外周血清VEGF少量表達；模型組大鼠各個時間點外周血清中VEGF表達顯著升高，針刺組和藥物組的表達顯著低于模型組(P<0.05)；藥物組各個時間點的表達顯著低于針刺組(P<0.05)；模型組、針刺組和藥物組的峰值時間均在3天時間點。見表2、圖3。

表1 各組大鼠不同時間點血清miRNA -126表達相對定量

表2 各組大鼠腦缺血再灌注不同時間點血清VEGF表達變化

圖2 各組大鼠不同時間點外周血清miRNA-126表達情況

圖3 各組大鼠不同時間點外周血清VEGF的表達情況

3 討論

正常情況下VEGF受體基因僅在正常血管內皮細胞中表達VEGF受體，且水平甚低，腦缺血、缺氧可激活VEGF/VEGF 受體系統(tǒng)，促使半暗帶血管內皮生長因子及其受體表達明顯上調。其表達在實驗性動物模型中腦缺血早期(12～24h)[7-8]或者更早(數(shù)分鐘內)[9]參與了血管生成和內皮細胞的增值過程，并且持續(xù)到之后的幾周[7,10]。VEGF是強有力的促血管生長因子之一。一般來說，腦缺血再灌注損傷后血管的增生范圍及程度與缺血邊緣區(qū)血流的改善直接相關，有利于側支循環(huán)的形成，最終影響著神經(jīng)元的修復。但是目前研究認為VEGF在急性期誘導的新生血管系統(tǒng)往往不成熟，VEGF劑量依賴的滲透性增加可能消減早期VEGF的腦保護作用，并有導致腦水腫和加重腦損傷的風險，從而使人對VEGF的腦保護作用產(chǎn)生了質疑。近來研究顯示，血清VEGF水平與腦梗死面積有關，血清VEGF水平愈高，腦梗死面積愈大[11]。Slevin等[2]觀察了急性腦梗死患者血清不同時相(在梗死后1、3、7、14天)VEGF的表達，發(fā)現(xiàn)每一個時相患者血清VEGF水平均顯著高于正常對照組。其中大面積腦梗死(面積>4cm2)患者各時相血清VEGF含量為最高，小面積腦梗死(面積<1.5cm2)各時相血清VEGF含量為最低，說明了外周血清VEGF的表達可反映腦缺血損傷情況。

miRNA-126是在內皮細胞特異性表達的一種促進血管新生的miRNA，可以調控血管生成、發(fā)育和再生，是目前報道的與血管內皮細胞及血管功能密切相關的microRNA[12]，且大量表達于哺乳動物腦中[13]。出芽相關蛋白-1(Sprouty-related protein-1，SPRED-1)和磷酸肌醇3激酶調節(jié)亞單位(Phospho-inositol-3kinase regulatory subunit 2，PIK3R2)為miRNA-126的兩個作用靶點，miRNA-126可直接作用于SPRED-1和PIK3R2，抑制SPRED-1和PIK3R2的表達，分別表現(xiàn)為通過靶向SPRED-1影響RAS/ERK信號通路，靶向PIK3R2影響 PI3K/AKT信號通路，以增強VEGF的生成[14-16]。此外，研究表明如芯指轉錄因子(Kruppel-like transcription factors，klf2a)能誘導內皮細胞表達miRNA-126，激活VEGF依賴的信號通路[17]。通過以上途徑miRNA-126發(fā)揮其對VEGF干預血管形成和保持完整性的信號通路的促進作用。有研究表明，外周血中的miRNA-126可能與腦缺血再灌注損傷動物的嚴重程度正相關[3]。

依達拉奉(Edaravone)已被證實為一種腦保護劑，可清除自由基，抑制脂質過氧化作用，從而抑制腦細胞、血管內皮細胞及神經(jīng)細胞的氧化損傷，減輕腦缺血引起的水腫及組織損傷[18]。此外，實驗研究還發(fā)現(xiàn)急性期依達拉奉與重組組織型纖維蛋白酶原激活劑(rtPA)溶栓治療聯(lián)合應用可通過減輕氧化應激、減少炎性細胞因子及基質金屬蛋白酶的表達來減緩超早期溶栓治療引起的再灌注損傷，促進神經(jīng)修復[19-20]。因此選用該藥作為陽性對照藥物。

針灸作為補充和替代治療腦血管病的手段之一，廣泛應用于臨床。針灸具有疏通經(jīng)絡、調和陰陽、扶正祛邪的作用。針刺可以改善腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能[21]。根據(jù)針灸經(jīng)絡理論，百會穴是督脈上的要穴，為督脈與足太陽經(jīng)的交會穴，總督一身之陽，位于頭部巔頂，“頭者神之居”為“精明之府”，具有開竅醒神之功。督脈行于脊里，上行入腦，與肝脈交巔，并從脊里分出，屬腎，因此把腦、肝、腎三臟聯(lián)絡起來，“病變在腦，首取督脈”為治療腦缺血疾病的首選。足三里穴為足陽明經(jīng)要穴，陽明經(jīng)多氣多血，又“主潤宗筋”，宗筋約束骨骼，利于關節(jié)運動，對中風之肢體痿痹不用尤為適宜。同時胃經(jīng)與足太陰脾經(jīng)互為表里關系。針刺足三里穴可以調理脾胃、補中益氣、通經(jīng)活絡、扶正祛邪之效。 腦缺血后機體正氣不足，屬于積損正衰，百會和足三里穴對于缺血性腦血管病有正向調節(jié)作用[22-24]。

本研究結果顯示，模型組、針刺組、藥物組大鼠外周血清VEGF值高于假手術組，提示腦缺血缺氧可促進VEGF的表達上調，大鼠腦缺血再灌注損傷(CIRI)后1天外周血清VEGF開始升高，3天達高峰，與Marti等[8]研究的腦組織表達基本一致，進一步說明了腦缺血后3天可能為腦組織損傷最嚴重的時間點。同時經(jīng)研究證實與急性腦缺血正性相關的外周血miRNA-126也同步升高。本實驗顯示針刺組大鼠VEGF及miRNA-126表達較假手術組升高，較模型組降低，說明針刺治療可能通過降低VEGF及miRNA-126表達，減少VEGF劑量依賴增高的血管滲透性，從而緩解CIRI后腦組織的損傷而保護腦組織。但是其治療效果又不如傳統(tǒng)的腦保護作用藥物依達拉奉；但是針刺具有操作簡便、費用低廉、無毒副作用等特點。選取針刺百會和足三里這兩個穴位，可通過下調外周血中VEGF及miRNA-126表達減緩腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷后，VEGF和其調控基因miR-126誘導了不成熟新生血管，血管滲透性增加加重了腦水腫，加重了腦組織損傷，而針刺治療可以有效緩解該損傷，因此為臨床治療缺血性腦血管病進一步提供實驗依據(jù)。

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Effect of Acupuncture on Peripheral Serum Expression of miRNA-126and Vascular Endothelial Growth Factor in Rats with Cerebral Ischemia

XU Hong,ZHANG Ya-min,SUN Hua△,CHEN Su-hui,WANG Fu-ming,YANG Yang

(ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,PekingUnionMedicalCollegeHospital,Beijing100730,China)

Objective：To explore the effect of acupuncture at “Baihui” (GV20) and “Zusanli” (ST36) on the peripheral serum expression of miRNA-126and VEGF in rats with CIRI. Methods：Healthy male Sprague-Dawley rats were randomized into a sham-operated group(S), a model group (M), an acupuncture group(A) and an edaravone group (ED) by using the random digit table. Each group was further randomly divided into 1d, 3d, 5d and 7d subgroups based on the reperfusion times according to the random digit table. In the group (M) and the group (A), CIRI was induced by using the thread occlusion method. TTC staining was used to evaluate the success of models. Electroacupuncture stimulation was applied daily to GV20and left ST36for 20min at the indicated time points after successful operation. Edaravone was given at the indicated time points after successful operation once a day. Serum was sampled for detecting VEGF protein via enzyme-linked immunosorbent assay, and serum miRNA-126was examined by using quantitative PCR.Results：The serum level of miRNA-126and VEGF increased significantly, and the peak expression of the group (M) and the group (A) occurred on the 3rd day. The expression of miRNA-126and VEGF in the group (A) and the group (ED) was lower than that in the group(M) at the same time point (P<0.05), and the expression of miRNA-126and VEGF in group (A) was higher than that in the group(ED) for the time points of 3d, 5d and 7d (P<0.05).Conclusion：Acupuncture therapy has a better effect on alleviating CIRI.The mechanism is related to down-regulating the expression of miRNA-126and VEGF.

Acupuncture;Cerebral ischemia;miRNA-126;Vascular endothelial growth factor

國家自然科學基金委項目,編號:81574054，81403459。

徐虹(1984-)，女，住院醫(yī)師，2014級中西醫(yī)結合臨床專業(yè)博士研究生，研究方向：針刺對腦血管病的研究。

△通訊作者：孫華(1957-)，女，主任醫(yī)師，博士研究生導師，主要從事針刺對腦血管病臨床與實驗研究。

R246.6

A

1005-0779(2016)10-0080-04

2016-05-15