周婉婉， 梁 冰， 胡丙清

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年病科，安徽蚌埠 233000)

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端粒、端粒酶與肺癌的相關(guān)性研究進(jìn)展

周婉婉， 梁 冰， 胡丙清

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年病科，安徽蚌埠 233000)

肺癌是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥死亡的主要原因之一。全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌占所有新診斷癌癥的13 %，占所有癌癥相關(guān)死亡原因的18 %。盡管針對(duì)肺癌的多學(xué)科綜合治療已達(dá)到了新的水平，但由于缺乏行之有效的肺癌早期診斷體系，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，導(dǎo)致肺癌發(fā)病率和死亡率居高不下。到目前為止，我國肺癌患者的總體5年生存率僅約為15 %。端粒酶作為目前已知的最具腫瘤特異性及廣譜性的腫瘤標(biāo)志物之一，因其在激活的狀態(tài)下，通過以自身為模板合成端粒，補(bǔ)償細(xì)胞分裂時(shí)端粒的縮短，使細(xì)胞具有無限分裂增殖能力。故端粒酶的活性表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并成為近年來人們?cè)谘芯糠伟┮约捌渌[瘤的診治新思路及新方法的熱點(diǎn)。

1 端粒的結(jié)構(gòu)與功能

端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端特殊的核糖核蛋白復(fù)合物，是由富含鳥嘌呤的簡(jiǎn)單DNA高度重復(fù)序列沿著5’到3’方向延伸的DNA鏈及相關(guān)蛋白組成[1]。在人體中，端粒DNA序列為TTAGGG/CCCTAA，端粒末端通過3′單鏈突出侵入到端粒的雙鏈中，形成一個(gè)套鎖樣的結(jié)構(gòu)，并在其周圍包繞著許多蛋白。這些端粒結(jié)合蛋白包括端粒重復(fù)序列結(jié)合因子1(telomeric repeat binding factor 1,TRF1)、端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2(TRF2)、端粒保護(hù)蛋白1(protection of telomerel,POT1)、TRF1相互作用核因子2(TIN2)和TPP1(POT1和TIN2組蛋白)、抑制/激活蛋白(RAP1)，該蛋白混合體又稱為Shelterin復(fù)合體[2]。這些蛋白特異性地結(jié)合端粒形成復(fù)合體后，具有保護(hù)染色體不被核酸酶降解、防止染色體相互融合、為端粒酶提供底物、解決DNA復(fù)制的末端隱縮、保證染色體的完全復(fù)制等功能。

人體細(xì)胞內(nèi)端粒的長(zhǎng)度可高達(dá)50 kb，但由于DNA半保留復(fù)制的特點(diǎn)，DNA聚合酶不能完全復(fù)制到DNA雙鏈中隨從鏈的最末端，因此在每一個(gè)細(xì)胞分裂時(shí)端粒將失去50～200 bp個(gè)堿基[3]，當(dāng)端粒長(zhǎng)度縮短到一定程度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)制功能衰退，引起細(xì)胞的衰老或死亡。

2 端粒酶的結(jié)構(gòu)和功能

端粒酶最早被發(fā)現(xiàn)于四模蟲中，是人體細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)端粒延伸的特異性反轉(zhuǎn)錄酶。端粒酶主要由與端粒DNA互補(bǔ)的人端粒酶RNA(telomerase RNA component,TERC)、具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transciptase，TERT)、端粒酶相關(guān)蛋白組成[4]。其中TERC含有與端?；パa(bǔ)的序列，是端粒重復(fù)序列復(fù)制的模板。而TERT作為端粒酶的催化亞單位，其基因由約37 kb大小的基因組DNA組成，包括33 kb的內(nèi)含子序列以及共4 kb大小的16個(gè)外顯子組成，該基因起到使TERT基因轉(zhuǎn)錄的作用[3]。端粒酶的組成中含有多種蛋白質(zhì)，如具有保護(hù)TERC功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物，該蛋白復(fù)合體由角化不良蛋白、NOP10、NHP2和GAR1組成[5]以及對(duì)端粒酶的活性起到調(diào)控作用的蛋白質(zhì)，一些具有H/ACA box的snoRNA結(jié)合蛋白、甘氨酸-精氨酸富含蛋白1以及potin/reptin和端粒酶Cajal body蛋白1等[2]。

在正常人體細(xì)胞中，除了造血細(xì)胞、干細(xì)胞和生殖細(xì)胞，絕大多數(shù)體細(xì)胞中端粒酶的活性受到抑制。而在癌細(xì)胞進(jìn)展過程中，端粒酶則被激活，因此端粒酶的激活在細(xì)胞的惡變過程中起到重要作用。研究表明，在癌變細(xì)胞中端粒酶主要通過TERT催化TERC逆轉(zhuǎn)錄來維持腫瘤細(xì)胞端粒長(zhǎng)度的動(dòng)態(tài)平衡，從而使細(xì)胞得以無限增殖[6]，且TERT基因只在端粒酶活性陽性的細(xì)胞中表達(dá)。同時(shí)一些報(bào)告顯示，在不同的腫瘤類型中，端粒酶活性和TERT表達(dá)之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，提示TERT基因的轉(zhuǎn)錄可以作為主要的調(diào)節(jié)步驟。

3 端粒酶在肺癌方面的研究

端粒酶在肺癌組織中具有較高的陽性表達(dá)率，非小細(xì)胞肺癌端粒酶陽性率約62 %～94 %，小細(xì)胞肺癌的陽性率約為90 %～100 %[7]。盧敏等[8]在30例非小細(xì)胞肺癌患者的手術(shù)切除的肺組織中發(fā)現(xiàn)端粒酶陽性率達(dá)83.3 %，而在正常肺組織中無陽性表達(dá)；對(duì)不同分期及分型的患者進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，端粒酶活性陽性率隨腫瘤分期的進(jìn)展而升高，而腫瘤分期高的患者預(yù)后差，與腫瘤分型無相關(guān)性。盛贈(zèng)美等[9]通過對(duì)90例NSCLC組織研究發(fā)現(xiàn)，端粒酶陽性率為75.6 %，明顯高于20例非肺癌組織25 %的陽性率，且端粒酶在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，臨床診斷為中晚期非小細(xì)胞肺癌的端粒酶陽性率明顯高于臨床早期，而端粒酶的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的病理分型無關(guān)。最近，全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)表明，5p15.33染色體區(qū)域影響著肺癌的易感性，這個(gè)區(qū)域中含有編碼TERT的基因，而TERT則是影響端粒酶活性的主要因素[10]。TERT基因啟動(dòng)子的多態(tài)性也被證明調(diào)控TERT的表達(dá)，從而影響端粒的長(zhǎng)度和罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。此外，在一個(gè)全基因組關(guān)聯(lián)分析中已證明近似TERC的常見變異體與端粒長(zhǎng)度具有相關(guān)性。Yang等[11]通過meta分析方法對(duì)3 354病例和3 518例對(duì)照的TERT基因上rs2736098單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)與亞洲人群患肺癌風(fēng)險(xiǎn)性的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了病例對(duì)照研究，結(jié)果提示TERT rs2736098遺傳的等位基因可以明顯增加患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。這些研究表明，端粒酶活性影響端粒長(zhǎng)度，并由此影響肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步證實(shí)端粒酶活性和肺癌的風(fēng)險(xiǎn)之間具有相關(guān)性的觀點(diǎn)。

隨著端粒酶活性與肺癌相關(guān)性研究的逐漸深入，涉及端粒酶機(jī)制的治療方法也成為現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)之一。端粒酶抑制劑主要針對(duì)端粒酶活性及維持端粒長(zhǎng)度的3個(gè)必要組成部分起作用。而TERT作為調(diào)控端粒酶活性的主要部分，其過度激活有助于保持端粒長(zhǎng)度與細(xì)胞永生化。有學(xué)者通過Western印跡和RT-PCR方法發(fā)現(xiàn)，褪黑激素聯(lián)合黃連素處理的H1299細(xì)胞與僅經(jīng)過黃連素處理的H1299細(xì)胞相比較，明顯加強(qiáng)了黃連素介導(dǎo)的對(duì)AP-2β和hTERT表達(dá)水平的抑制作用，有效提高了黃連素對(duì)hTERT啟動(dòng)子活性的抑制作用；其結(jié)果還表明，褪黑激素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制是通過AP-2β/hTERT基因、半胱天冬/細(xì)胞色素C、NF-κB/COX-2和Akt/ERK依賴性信號(hào)途徑的同時(shí)調(diào)制介導(dǎo)。有研究中發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞中CBP其特異siRNA被敲除或在RFPL3的表達(dá)被其抑制劑抑制時(shí)，RFPL3結(jié)合hTERT啟動(dòng)子的能力則會(huì)明顯降低。當(dāng)上調(diào)或下調(diào)RFPL3和CBP兩種蛋白的其中一個(gè)，而另一個(gè)不變時(shí)，就會(huì)相應(yīng)地激活或抑制hTERT基因表達(dá)和端粒酶活性，進(jìn)而促進(jìn)或抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并發(fā)現(xiàn)RFPL3與CBP是通過CBP誘導(dǎo)RFPL3蛋白的乙?；退鼈?cè)赥ERT啟動(dòng)子區(qū)域的共同錨點(diǎn)來上調(diào)TERT的表達(dá)。Vicki[12]報(bào)道一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)用腺病毒攜帶端粒酶靶向藥物來搜索并摧毀腫瘤細(xì)胞，其Ⅰ期研究中有16例患者應(yīng)用了由腺病毒攜帶的telomelysin或OBP-301藥物的患者，其中有11例病情得以緩解。

除TERT外，另一個(gè)目標(biāo)是充當(dāng)模板的RNA組分，Julia等[13]開發(fā)了脫乙酰殼多糖包衣聚丙交酯共乙交酯(PLGA)納米顆粒，該顆粒能介導(dǎo)2-O-甲基RNA導(dǎo)入人肺癌細(xì)胞的過程。該研究結(jié)果表明由脫乙酰殼多糖包衣PLGA納米介導(dǎo)的抑制劑相對(duì)于單獨(dú)反義寡核苷酸明顯增強(qiáng)了細(xì)胞攝取能力，在長(zhǎng)期治療(15周)后肺癌細(xì)胞中端粒酶活性降低了約80 %。此外，納米顆粒介導(dǎo)2-O-甲基核糖核酸轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞中端粒的長(zhǎng)度從5.9 kb的縮短到4 kb。而Geron公司也是基于寡核苷酸的治療策略設(shè)計(jì)了藥物GRN163L或imetelstat，該藥是一個(gè)結(jié)合于端粒酶催化位點(diǎn)的短鏈脂化寡核苷酸。第3種方法則是針對(duì)相關(guān)的蛋白質(zhì)來抑制端粒酶，如TRF1、GV-1001等。上述研究均圍繞端粒酶激活的分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行,部分藥物尚處于試驗(yàn)階段，但也有一些藥物已應(yīng)用于臨床。

端粒酶在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，因其幾乎在所有的癌癥中存在著較高的水平，使其一直被認(rèn)為是潛在的藥物靶點(diǎn)。在肺癌方面，大量研究結(jié)果顯示，端粒酶活性測(cè)定在肺癌的診斷及預(yù)后方面具有較高的價(jià)值。端粒酶活性調(diào)節(jié)機(jī)制在肺癌發(fā)生發(fā)展過程的深入探討,將使得端粒酶及端粒酶抑制劑的研究在肺癌的診斷和治療方面取得突破性的進(jìn)展。

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