劉 捷, 李湘凌, 邢 進, 胡翠茹, 袁 峰, 周濤發(fā)

(合肥工業(yè)大學 資源與環(huán)境工程學院,安徽 合肥 230009)

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一株假單胞菌對莧菜紅的脫色特性研究

劉 捷, 李湘凌, 邢 進, 胡翠茹, 袁 峰, 周濤發(fā)

(合肥工業(yè)大學 資源與環(huán)境工程學院,安徽 合肥 230009)

文章以一株假單胞菌Pseudomonassp.為研究對象,考察了該菌作用下碳源種類、葡萄糖質(zhì)量濃度、初始pH值、染料質(zhì)量濃度及時間等因素對莧菜紅(AR27)偶氮染料的厭氧脫色的影響。研究結(jié)果表明生物降解在脫色過程中占主導作用,其脫色過程符合一級反應動力學規(guī)律。在單因素實驗基礎上,利用Box-Benhnken組合實驗和響應面分析法對脫色條件進行優(yōu)化。經(jīng)修正,得到的最佳脫色條件為：染料質(zhì)量濃度170 mg/L,葡萄糖質(zhì)量濃度1.6 g/L,脫色培養(yǎng)液的初始pH值為7.2,脫色時間75 h,此時該菌對偶氮染料AR27的脫色率為97.3%。

假單胞菌;偶氮染料;碳源;響應面法

0 引 言

偶氮染料是分子中具有一個或多個偶氮基(-N=N-)的芳香類化合物。由于其具有顏色范圍廣、色光良好等優(yōu)點而成為目前商業(yè)應用最多的合成染料[1]。印染、染料等生產(chǎn)行業(yè)排放的廢水中含有大量的偶氮染料,使得該類廢水色度高且具有嚴重的生態(tài)環(huán)境危害性[2],其中染料廢水的脫色已成為研究熱點之一。生物法是偶氮染料廢水脫色的較為有效的途徑,在好氧條件下大多數(shù)偶氮染料較難降解脫色,而在兼氧或厭氧條件下偶氮鍵易被還原斷裂[3-4]使其表現(xiàn)出良好的脫色能力。

近年來,人們已發(fā)現(xiàn)多種具有脫色偶氮染料能力的菌株,包括氣單胞菌屬、光合細菌、芽孢桿菌、大腸桿菌和希瓦氏菌屬等。文獻[5]從染料廢水中分離出一株球形芽孢桿菌Lysinibacillussp. RGS對雷馬素紅具有較好的脫色效果。文獻[6]分離出的菌株Shewanellaaquimarina在高鹽偶氮染料廢水中對甲基橙的脫色率[7]達79.1%。文獻[8]篩選出的產(chǎn)堿桿菌AlkaligenesSpecies AP04是一株好氧菌,它可以以活性紅198作為唯一碳源維持生長。文獻[8]成功利用菌株Geobacteraceaemetallireducens(DSM 7210)脫色酸性紅27,脫色率最高可達93.7%。

本文以莧菜紅(AR27)偶氮染料為模式污染物,利用課題組前期從活性污泥中分離出的一株以檸檬酸鐵為電子受體能進行異化鐵還原的菌株(Pseudomonassp.),研究其脫色特性并優(yōu)化其脫色條件,以期為細菌在染料廢水治理領域的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 染料

偶氮染料AR27(C20H11N2Na3O10S3),分析純,相對分子質(zhì)量為604.47,結(jié)構(gòu)式如圖1所示,最大吸收波長為520 nm。

圖1 AR27的化學結(jié)構(gòu)式

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基

菌種來源于本實驗室前期分離出的一株具有異化鐵還原能力的菌株,經(jīng)鑒定該菌為假單胞菌Pseudomonassp.。

活化培養(yǎng)基如下:NaCl 5.0 g/L, MgCl20.1 g/L, CaCl20.1 g/L, KCl 3.0 g/L, KH2PO41.0 g/L, NH4Cl 1.25 g/L, NaNO32.0 g/L,CH3COONa 2.0 g/L, NaHCO32.5 g/L,抗壞血酸0.1 g/L。

脫色培養(yǎng)基如下：C6H12O61.5 g/L, KH2PO42.65 g/L, Na2HPO41.69 g/L,(NH4)2SO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,少量微量元素。

1.1.3 主要儀器

AUY-120型電子天平,KADY便攜式pH值計,SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器,SF-VD-650型超凈工作臺,SHP-250型生化培養(yǎng)箱,HC-2064高速離心機,UV-754型紫外-可見分光光度計。

1.2 方法

1.2.1 碳源種類對染料脫色的影響

脫色實驗均在250 mL的鹽水瓶中進行。在配置好的脫色培養(yǎng)基中加入AR27, 其終質(zhì)量濃度為150 mg/L,分別投加葡萄糖、乙酸鈉、丙酮酸鈉、淀粉,各碳源終質(zhì)量濃度為1.5 g/L。不加碳源的作為對照組。調(diào)節(jié)pH值至7.0左右,121 ℃下滅菌20 min。按無菌操作法將處于對數(shù)生長期的菌株Pseudomonassp.按體積分數(shù)為10%的接種量接種至脫色培養(yǎng)基中。然后向培養(yǎng)基中通入高純N2,吹脫5 min,迅速用膠塞和鋁蓋密封,將其置于35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中反應。脫色前,用滅菌的注射器取樣;脫色期間,間隔一定時間用無菌注射器取樣,測定AR27的脫色率。實驗均設置3個平行樣。

1.2.2 葡萄糖質(zhì)量濃度對染料脫色的影響

向脫色培養(yǎng)基中(含有150 mg/L的AR27)添加葡萄糖,其終質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L。調(diào)節(jié)pH值至7.0左右,121 ℃下滅菌20 min。其余步驟同1.2.1。脫色前,用滅菌的注射器取樣;脫色期間,間隔一定時間用無菌注射器取樣,測定體系中pH值和AR27的脫色率。實驗均設置3個平行樣。

1.2.3 體系初始pH值對染料脫色的影響

脫色培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度為1.5 g/L,AR27質(zhì)量濃度為150 mg/L。用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。121 ℃下滅菌20 min,其余步驟同1.2.1。脫色前,用滅菌的注射器取樣;脫色期間,間隔一定時間用無菌注射器取樣,測定體系中pH值和AR27的脫色率。實驗均設置3個平行樣。

1.2.4 染料初始質(zhì)量濃度對染料脫色的影響

脫色培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度為1.5 g/L,向其中添加AR27,使得體系中AR27的終質(zhì)量濃度分別為50、100、150、200、250、300、400 mg/L。調(diào)節(jié)pH值至7.0左右,121 ℃下滅菌20 min,其余步驟同1.2.2。用無菌注射器移取脫色前和脫色72 h后的水樣,測定AR27的脫色率。實驗均設置3個平行樣。

1.2.5 響應曲面法優(yōu)化脫色條件

在單因素實驗結(jié)果最優(yōu)水平基礎上,根據(jù)Box-Behnken設計原理,本實驗以脫色率r為響應值,利用Design-Expert 8.0軟件設計四因素三水平響應曲面實驗[9],選取AR27質(zhì)量濃度、時間、pH值、葡萄糖質(zhì)量濃度4個影響因素,因素編碼水平見表1所列。

表1 響應面優(yōu)化實驗因素水平

1.2.6 菌體吸附脫色測定

將響應曲面法得到的優(yōu)化條件進行驗證實驗,脫色完全后的培養(yǎng)基在8 000 r/min下離心10 min,棄去上清液,收集菌體。將得到的菌體置于甲醇中,利用超聲波破碎菌體,并使菌體均勻分布在甲醇溶液中。

然后將混合液靜置12 h,4 000 r/min下離心10 min,收集上清液。收集2次上述步驟所得上清液,測定被菌體吸附染料的吸光度,根據(jù)AR27標準曲線計算出菌體吸附染料的質(zhì)量,從而得出吸附率[10]。

1.2.7 染料脫色率測定及計算

將含染料以及菌體的培養(yǎng)液離心后得上清液,以未加染料的菌體培養(yǎng)上清液為參比,在染料相應的最大吸收波長處(520 nm)測量其吸光度。脫色率r的計算公式如下:

其中,A0、At分別為接種后初始時刻和培養(yǎng)t時刻上清液的吸光度。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 脫色的基本作用分析

由于菌體對染料具有吸附作用,在本研究中為了確定反應體系中的吸附脫色作用的貢獻,采用甲醇洗脫法來研究菌體吸附脫色的情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌體對染料的吸附率僅為(6.3±1.02)%,該吸附脫色率與體系的總脫色率97.3%相比較,吸附脫色作用所占比例很小,因此該體系中的脫色以該菌的生物降解過程為主。

2.2 不同因素對AR27染料脫色的影響

2.2.1 碳源的影響

分別以葡萄糖、乙酸鈉、淀粉、丙酮酸鈉作為實驗組,不添加碳源作為對照組,研究了不同碳源對鐵還原菌脫色AR27的影響,如圖2所示。

由圖2可以看出,當無外加碳源時,AR27緩慢脫色,脫色135 h時AR27體系中脫色率為27.7%,表明該株菌可以利用AR27作為碳源來維持自身代謝并實現(xiàn)緩慢脫色。而目前只發(fā)現(xiàn)少量細菌可以以染料為唯一碳源進行生長并使其降解。如KlebsiellapneumoniaeY3可利用甲基紅作為唯一碳源維持生長并使其逐漸降解[11],64 h脫色率為52%。

圖2 碳源對AR27脫色率的影響

外加葡萄糖、淀粉、丙酮酸鈉等碳源都提高了該菌對AR27的脫色率。當脫色反應時間為135 h時,添加葡萄糖、淀粉、丙酮酸鈉體系的脫色率均達到了98%左右,與未添加碳源的體系相比較,其脫色率提高了3.5倍左右。而乙酸鈉作為外加碳源時,并沒有明顯促進脫色。同時,添加葡萄糖、淀粉、丙酮酸鈉能提高AR27的脫色速度。當脫色反應時間為46 h時,添加葡萄糖、淀粉、丙酮酸鈉體系的脫色率分別為80%、51%和41%,而添加乙酸鈉體系的脫色率僅為11%,與不添加碳源的體系基本相當。與其他碳源相比較,葡萄糖能快速啟動脫色反應,一方面是因為它易于被菌株降解利用,為微生物的生長繁殖提供足夠的能量；另一方面是誘導偶氮還原,刺激了負責還原過程的酶系統(tǒng)[12]。

以上結(jié)果表明葡萄糖是該菌株脫色AR27的最適碳源，這與乙酸鈉可以作為金屬還原地桿菌DSM7210脫色AR27的有效碳源[8],甲酸鈉是中國希瓦氏菌D14T脫色AR27的最佳碳源[6]的研究結(jié)果存在明顯的差異,主要原因是該株菌可能是利用發(fā)酵糖產(chǎn)生乙酸、氫氣等發(fā)酵產(chǎn)物的過程中來還原偶氮染料。

2.2.2 葡糖糖質(zhì)量濃度的影響

葡萄糖是該菌生長的基本物質(zhì)和脫色AR27的最適碳源,因此研究其在不同質(zhì)量濃度下脫色效果是十分必要的。AR27質(zhì)量濃度150 mg/L,pH值為7,不同葡萄糖質(zhì)量濃度下AR27在72 h時的脫色率如圖3所示。

由圖3可以看出，葡萄糖的質(zhì)量濃度低于1.5 g/L時,脫色率隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的增加而提高,這是由于葡萄糖質(zhì)量濃度較低時,電子供體不足導致鐵還原菌的脫色能力較差。而當葡萄糖的質(zhì)量濃度超過1.5 g/L時,它的脫色率有所下降,并且測得此時的脫色體系pH值處于4.5～5.5之間。這可能是因為較高質(zhì)量濃度的葡萄糖會轉(zhuǎn)化為大量的有機酸,使得培養(yǎng)基pH值大幅降低,抑制了該菌的生長,而該株假單胞菌Pseudomonassp.的最佳生長pH值為7,可見較低的pH值不利于菌株的脫色反應。用NaOH將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至7左右時,脫色反應又繼續(xù)進行,脫色率最終能達到95%左右。這種現(xiàn)象與文獻[13]研究結(jié)果一致。文獻[14]指出葡萄糖質(zhì)量濃度控制在1～2 g/L范圍內(nèi)脫色效率最高,繼續(xù)提高葡萄糖質(zhì)量濃度,菌株E2的脫色率會降低。因此,假單胞菌Pseudomonassp.脫色的最佳葡萄糖質(zhì)量濃度為1.5 g/L,體系pH值是影響脫色反應的關鍵因素。

圖3 葡萄糖質(zhì)量濃度對AR27脫色的影響

2.2.3 體系初始pH值的影響

葡萄糖質(zhì)量濃度為1.5 g/L,AR27質(zhì)量濃度為150 mg/L,不同初始pH值對菌株Pseudomonassp.脫色率的影響如圖4所示。從圖4可以看出,反應72 h后,pH值為7～9時AR27的脫色率都能達到97%左右;pH值為5和6時脫色率分別為12%、31%,表明酸性條件下不利于脫色反應。且實驗過程中測得中性或堿性體系中培養(yǎng)基的pH值減小至6.8左右,而酸性體系的pH值變化不大。造成這種現(xiàn)象的可能原因是菌株Pseudomonassp.對葡萄糖厭氧發(fā)酵,產(chǎn)物中的乙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸,與堿性的培養(yǎng)基發(fā)生中和反應,使培養(yǎng)基的pH值降低至接近中性,便于菌體的生長[15],以致在初始pH值為9的堿性條件下AR27仍能保持較高的脫色率。

圖4 初始pH值對AR27脫色率的影響

2.2.4 AR27初始質(zhì)量濃度的影響

葡萄糖質(zhì)量濃度為1.5 g/L,pH值為7,不同AR27初始質(zhì)量濃度對菌株Pseudomonassp.脫色率的影響如圖5所示。

圖5 AR27初始質(zhì)量濃度對其脫色率的影響

從圖5可以看出,脫色時間為72 h時,AR27的初始質(zhì)量濃度不超過200 mg/L,脫色效果較好,脫色率達90%左右。而當初始質(zhì)量濃度超過200 mg/L時,脫色率隨著染料質(zhì)量濃度的增加而減小,這可能是高質(zhì)量濃度染料對該菌具有毒副作用,其中偶氮染料芳環(huán)上的磺酸基團的抑制微生物的生長,降低了微生物的脫色率[16],或者是不合適的細胞/染料比造成的[17-20]。印染行業(yè)廢水中的染料質(zhì)量濃度[21]通常為10～200 mg/L,本研究中的菌株對具有在實際染料廢水的高效厭氧脫色中的應用有一定的潛力。

2.3 不同碳源條件下染料的脫色動力學分析

動力學研究是厭氧降解有機物研究的重要內(nèi)容之一,通過對脫色動力學的研究可計算出脫色反應速率,為更好地應用于實際染料廢水提供參考依據(jù)。

采用一級反應動力學方程[22]對不同碳源條件下AR27的吸光度與反應時間進行擬合,得到動力學方程和相關參數(shù)見表2所列。

表2 不同碳源條件下AR27的脫色動力學參數(shù)

由表2可看出,不同碳源條件下AR27脫色均符合一級反應動力學規(guī)律,且相關性良好。添加葡萄糖、丙酮酸鈉、淀粉和乙酸鈉等碳源以及不添加碳源時,各體系中的染料脫色速率常數(shù)分別為0.073 4、0.047 8、0.033 4、0.004 8、0.002 6,從脫色速率常數(shù)進一步說明了添加葡萄糖能顯著提高該菌株對AR27的脫色速率。當葡萄糖、丙酮酸鈉、淀粉和乙酸鈉作碳源時AR27的脫色半衰期分別為9.44、14.50、20.75、144.41 h,當不添加碳源、菌株以偶氮染料為碳源時AR27的半衰期為266.59 h。

2.4 響應面脫色條件優(yōu)化實驗結(jié)果

采用Box-Behnken模型,以表現(xiàn)顯著的AR27質(zhì)量濃度(A)、葡萄糖質(zhì)量濃度(B)、pH值(C)、脫色時間(D)作為自變量,脫色率(r)為響應值設計29組試驗，實驗設計與結(jié)果見表3所列。

表3 響應面實驗設計及結(jié)果

根據(jù)表3的實驗結(jié)果,經(jīng)回歸擬合實驗數(shù)據(jù)所得經(jīng)驗模型為:

r=96.02+1.86A+4.36B+5.44C+

3.16D+1.25AB+0.35AC-0.68AD-

3.78BC+1.7BD-2.7CD-2.27A2-

8.42B2-5.4C2-2.85D2。

用Design-Expert8.0對模型進行方差分析,結(jié)果見表4所列，其二次回歸方程的方差分析見表5所列。從表4中可知,模型顯著,失擬項不顯著。從表5中可知,該模型的復相關系數(shù)R2=0.976 6,說明該模型能較好地描述實驗結(jié)果。它的變異系數(shù)為1.76,低于10%,說明該實驗的穩(wěn)定性較好。最后得出菌株Pseudomonassp.脫色的最佳條件為:AR27質(zhì)量濃度為172.06 mg/L,葡萄糖質(zhì)量濃度為1.63 g/L,脫色培養(yǎng)液的初始pH值為7.16,脫色時間為77.15 h,此時該菌對AR27的預測脫色率達98.5%。

表4 響應面結(jié)果的方差分析

為了檢驗響應曲面設計所得結(jié)果的可靠性,同時考慮到實際操作的可行性,將實驗參數(shù)修正如下：AR27質(zhì)量濃度為170 mg/L,葡萄糖的質(zhì)量濃度為1.6 g/L,脫色培養(yǎng)液的初始pH值為7.2,脫色時間為75 h。在該修正條件下進行3次平行實驗,得到脫色率的平均值為97.3%,與預測值相差1.2%,與理論值基本吻合。說明該實驗設計與響應曲面法優(yōu)化得到的脫色參數(shù)準確可靠,具有實際應用價值。

表5 二次回歸方程的方差分析

3 結(jié) 論

(1) 假單胞菌Pseudomonassp.脫色莧菜紅AR27是以生物降解為主,且莧菜紅AR27脫色過程符合一級反應動力學規(guī)律。

(2) 菌株能以莧菜紅為碳源維持自身生長并使其脫色。外加葡萄糖、丙酮酸鈉和淀粉不僅能提高脫色率,也能顯著提高脫色速率,其中葡萄糖是該菌株的最佳碳源,其最佳質(zhì)量濃度為1.5 g/L左右。

(3) 菌株以葡萄糖為碳源,在pH值為7～9環(huán)境下,染料的初始質(zhì)量濃度低于200 mg/L，均表現(xiàn)出良好的脫色能力。

(4) 采用響應曲面法得到的最優(yōu)化脫色條件為:AR27質(zhì)量濃度170 mg/L,葡萄糖質(zhì)量濃度1.6 g/L,脫色培養(yǎng)液的初始pH值為7.2,脫色時間為75 h,在該脫色條件下，AR27的脫色率達到了97.3%。

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(責任編輯 閆杏麗)

Characterization of decolorization of amaranth byPseudomonassp. strain

LIU Jie, LI Xiangling, XING Jin, HU Cuiru, YUAN Feng, ZHOU Taofa

(School of Resources and Environmental Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The effect of factors like carbon sources, initial concentrations of glucose and azo dye, initial pH value and time on the amaranth(AR27) anaerobic decolorization byPseudomonassp. strain was investigated. The results indicated that the biodegradation played the dominant role in the decolorization, and the kinetics of decolorization reaction was corresponding with the first order reaction kinetics models. Based on the single factor experiment, the decolorization was optimized by using the Box-Benhnken composite designing and response surface methodology. After amendment, the rate of decolorization of AR27 byPseudomonassp. strain reached 97.3% under the optimal parameters with AR27 of 170 mg/L and glucose of 1.6 g/L cultivating for 75 h at pH value of 7.2.

Pseudomonassp.; azo dye; carbon source; response surface methodology

2015-10-14；

2015-11-27

安徽省國土資源科技資助項目(2015-g-8)

劉 捷(1989-),女,湖北麻城人,合肥工業(yè)大學碩士生; 袁 峰(1971-),男，廣西桂林人，博士，合肥工業(yè)大學教授，博士生導師； 周濤發(fā)(1964-)，男，安徽廬江人，博士，合肥工業(yè)大學教授，博士生導師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2016.11.023

X172

A

1003-5060(2016)11-1556-07