孟巧絨 李 楠 閆 旭

(西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 咸陽 712082)

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趨化因子受體4調(diào)節(jié)PI3K/Akt和Erk信號通路促進卵巢癌SKOV3細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

孟巧絨 李 楠1閆 旭2

(西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 咸陽 712082)

目的 觀察趨化因子受體4(CXCR4)通過激活PI3K/Akt和Erk信號通路在卵巢癌SKOV3細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用。方法 Boyden小室檢測激活CXCR4后SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化情況。Western印跡方法檢測激活CXCR4后SKOV3細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況及PI3K/Akt和Erk信號通路的活化情況。PI3K/Akt和Erk信號通路抑制劑預(yù)處理SKOV3細(xì)胞后，采用Western印跡方法檢測SKOV3細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 同對照組相比，激活CXCR4后可促進SKOV3細(xì)胞的遷移和侵襲能力(P<0.01)，下調(diào)SKOV3細(xì)胞中與EMT相關(guān)的E-鈣黏蛋白表達(dá)，并上調(diào)EMT相關(guān)波形蛋白的表達(dá)。Western印跡結(jié)果顯示隨著CXCR4刺激時間的延長，SKOV3細(xì)胞中PI3K/Akt蛋白和Erk蛋白磷酸化水平逐漸升高。采用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002和Erk信號通路抑制劑U0126預(yù)處理SKOV3細(xì)胞后，CXCR4介導(dǎo)的E-鈣黏蛋白表達(dá)下調(diào)和波形蛋白表達(dá)上調(diào)被阻斷。結(jié)論 CXCR4通過激活SKOV3細(xì)胞中的PI3K/Akt信號通路和Erk信號通路，下調(diào)SKOV3細(xì)胞中E-鈣黏蛋白表達(dá)，并上調(diào)波形蛋白的表達(dá)，從而促進卵巢癌SKOV3細(xì)胞EMT的發(fā)生。

趨化因子受體4；信號通路；上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化；遷移；侵襲

趨化因子是指吸引白細(xì)胞移行到感染部位的一些低分子量的蛋白質(zhì)〔1〕。多種趨化因子及相關(guān)受體參與了腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用〔2,3〕。趨化因子受體4(CXCR4)是趨化因子受體家族中重要的成員，與乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌和肝癌等的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔4～8〕。而CXCR4在卵巢癌中的作用目前研究還很少。據(jù)此，本研究對CXCR4激活在誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲中的作用進行初步探討，并觀察CXCR4激活是否可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt和Erk信號通路活化而在卵巢癌SKOV3細(xì)胞上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中發(fā)揮一定的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 卵巢癌SKOV3細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。CXCR4激活所用CXCR4配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(SDF-1α)購自Peprrotoech公司。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、波形蛋白(Vimentin)抗體、p-Akt抗體和p-Erk1/2抗體購自Cell Signaling Technology公司；LY294002、U0126辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG購自Snata Cruz公司；100×蛋白酶磷酸酶抑制劑Cocktail 購自Thermo公司；Boyden小室購自Millpore公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)基處理 采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期開始實驗。SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測實驗及EMT相關(guān)蛋白檢測實驗中，采用200 ng/ml的SDF-1α處理SKOV3細(xì)胞48 h。PI3K/Akt信號通路和Erk信號通路活化檢測實驗中，采用200 ng/ml的SDF-1α處理SKOV3細(xì)胞0、5、10和20 min。PI3K/Akt信號通路和Erk信號通路阻斷實驗中，分別于培養(yǎng)基中加入5 μmol/L的LY294002和30 μmol/L的U0126。

1.3 遷移和侵襲能力檢測 采用傷口愈合實驗分析CXCR4對卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移能力，具體操作方法參見文獻〔9〕。采用Boyden小室分析CXCR4對卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲能力的影響，具體操作方法參見文獻〔10,11〕。

1.4 SKOV3細(xì)胞總蛋白提取 采用CytoBuster 蛋白提取試劑提取上述SDF-1α處理卵巢癌SKOV3細(xì)胞的總蛋白：采用預(yù)冷冰PBS洗滌細(xì)胞2次(400 r/min離心5 min)；棄盡細(xì)胞上清后加入適量蛋白酶磷酸酶抑制劑Cocktail和CytoBuster 蛋白提取試劑，渦旋混勻；室溫放置15 min；于預(yù)冷至4℃離心機中離心(12 000 r/min離心15 min)；吸取上清即為細(xì)胞總蛋白。

1.5 蛋白濃度檢測 嚴(yán)格按BCA試劑盒說明書操作：將試劑A和試劑B按50∶1的體積比混合配制成工作液；于酶標(biāo)板中每孔加入200 μl的工作液，并加入25 μl倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，每種檢測條件設(shè)置3個復(fù)孔。37℃避光孵育30 min；酶標(biāo)儀在波長562 nm 處測定OD值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值和濃度梯度繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線以推算出樣品濃度。

1.6 Western印跡方法 上述提取的細(xì)胞總蛋白經(jīng)8% SDS-PAGE 分離膠和5%濃縮膠分離后，采用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。PVDF膜以含5% BSA的TBST室溫封閉2 h；加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過夜。第二天用0.1% TBST 洗膜3 次后加入相應(yīng)種屬的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h。0.1% TBST 洗膜3次，PVDF膜以Supersignal West Pico HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對條帶進行顯色。β-actin作為內(nèi)參對照。所有實驗至少重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0軟件行采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 CXCR4激活對SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲的影響 對照組、CXCR4刺激組的SKOV3細(xì)胞傷口寬度百分比分別為(1.00±0.00)和(0.34±0.15)，CXCR4刺激可顯著促進SKOV3細(xì)胞的遷移能力(P<0.01)。對照組、CXCR4刺激組的SKOV3細(xì)胞發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)分別為(156.85±41.95)和(318.56±58.93)，CXCR4刺激可顯著促進SKOV3細(xì)胞的侵襲能力(P<0.01)。見圖1。

2.2 CXCR4激活對SKOV3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 CXCR4刺激后可下調(diào)SKOV3細(xì)胞中與EMT相關(guān)的E-cadherin表達(dá)，并上調(diào)EMT相關(guān)波形蛋白Vimentin的表達(dá)。見圖2。

2.3 CXCR4激活對SKOV3細(xì)胞中PI3K/Akt和Erk信號通路活化的影響 隨著CXCR4刺激處理時間的延長，SKOV3細(xì)胞中PI3K/Akt蛋白和Erk蛋白磷酸化水平逐漸升高。見圖3。

2.4 阻斷PI3K/Akt和Erk信號通路后SKOV3細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況 阻斷SKOV3細(xì)胞中PI3K/Akt和Erk信號通路后，CXCR4介導(dǎo)的E-cadherin表達(dá)下調(diào)和Vimentin表達(dá)上調(diào)被阻斷。見圖4。

圖1 SKOV3細(xì)胞遷移(A)和侵襲能力(B)變化情況

圖2 SKOV3細(xì)胞E-cadherin和Vimentin表達(dá)情況

圖3 Western印跡檢測Akt和Erk磷酸化情況

圖4 SKOV3細(xì)胞E-cadherin和Vimentin表達(dá)情況

3 討 論

雖然卵巢癌對化療敏感，加之目前臨床多采用腫瘤根治術(shù)和鉑加紫杉醇為基礎(chǔ)的化療對卵巢癌進行治療，然而卵巢癌患者的預(yù)后仍不理想，且5年生存率僅為25%〔12〕。已知患者的臨床病理參數(shù)，如年齡、 腫瘤分期、 患者身體機能和殘余腫瘤體積為卵巢癌預(yù)后的獨立預(yù)測因子，然而，即便是狀態(tài)和治療相似的患者其生存率也不盡相同〔13〕。

CXCR4是一種G蛋白偶聯(lián)的趨化因子受體，通過與其相應(yīng)的配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF)-1α結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)〔14〕。CXCR4/SDF-1α軸在胚胎發(fā)育、 巨噬細(xì)胞遷移和分化中具有重要的作用〔13〕。一項研究分析了卵巢癌細(xì)胞中14種趨化因子受體的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，卵巢癌細(xì)胞僅表達(dá)CXCR4〔15〕，提示CXCR4與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。同時，EMT與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。那么，CXCR4是否可通過介導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞EMT的發(fā)生而參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展呢？本研究結(jié)果顯示，激活CXCR4可顯著上調(diào)SKOV3細(xì)胞的遷移和侵襲能力。CXCR4可通過激活SKOV3細(xì)胞中的PI3K/Akt信號通路和Erk信號通路，下調(diào)SKOV3細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)，并上調(diào)Vimentin的表達(dá)，從而促進卵巢癌SKOV3細(xì)胞EMT的發(fā)生，與文獻〔16〕報道的CXCR4發(fā)揮作用激活的下游信號通路結(jié)果一致。

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〔2015-11-12修回〕

(編輯 徐 杰)

孟巧絨(1978-)，女，碩士，主治醫(yī)師，講師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合婦科研究。

R71

A

1005-9202(2016)22-5547-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.023

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦科 2 吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理科