侯 靜 藺 艷 歐三桃 曹 靈

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科,四川 瀘州 646000)

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還原型谷胱甘肽對(duì)缺血再灌注急性腎損傷模型大鼠的腎保護(hù)機(jī)制

侯 靜 藺 艷1歐三桃 曹 靈

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科,四川 瀘州 646000)

目的 探討還原型谷胱甘肽對(duì)缺血再灌注急性腎損傷(AKI)模型大鼠的腎保護(hù)機(jī)制。方法 將無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠48只隨機(jī)分為假手術(shù)組(SN)、造模組(IN)和還原型谷胱甘肽治療組(IG)，各16只，IG組在夾閉腎蒂前10 min頸靜脈注射200 mg/ml的還原型谷胱甘肽，IN組給予同劑量的生理鹽水，SN組僅進(jìn)行假手術(shù)。術(shù)后6 h和12 h分別檢測(cè)三組血肌酐(SCR)和血尿素氮(BUN)、血清白細(xì)胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平變化，術(shù)后6 h和12 h分批處死大鼠后取腎臟組織，檢測(cè)三組丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活力。結(jié)果 術(shù)后6 h IN組與IG組SCR和BUN水平均顯著高于SN組(均P<0.05)，術(shù)后12 h IG組SCR和BUN水平均顯著低于IN組(均P<0.05)。術(shù)后6 h IN組與IG組IL-6水平均顯著高于SN組，術(shù)后12 h IG組IL-6水平顯著低于IN組(均P<0.05)；術(shù)后6 h和12 h IN組TNF-α水平均顯著高于SN組(P>0.05)，IG組TNF-α水平與SN組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。術(shù)后6 h和12 h SN組與IG組SOD活力均顯著高于IN組(P<0.05)，而SN組與IG組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；術(shù)后6 h和12 h IN組MDA活力均顯著高于SN組與IG組，而SN組與IG組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 還原型谷胱甘肽治療缺血再灌注AKI大鼠療效確切，能有效清除氧自由基和改善炎癥狀態(tài)，值得進(jìn)一步研究。

缺血；再灌注；急性腎損傷；還原型谷胱甘肽

急性腎損傷(AKI)是臨床常見的危重癥，發(fā)病機(jī)制迄今為止尚未闡明，發(fā)病誘因多種多樣，常見的有缺血、再灌注損傷、免疫反應(yīng)、毒素、炎癥等，若得不到及早診斷和治療，AKI常會(huì)導(dǎo)致不可逆的腎損傷，病死率高達(dá)50%〔1〕。缺血再灌注損傷是導(dǎo)致AKI的重要因素，病理機(jī)制是產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致多種不飽和脂肪酸過氧化，損傷膜脂質(zhì)，引起膜功能受損，破壞腎臟細(xì)胞，同時(shí)這一過程中釋放的大量炎癥因子也加重了損傷〔2〕。還原型谷胱甘肽是人體內(nèi)自身合成的一種活性成分，具有酶活性和抗氧化活性，是體內(nèi)重要的自由基清除劑〔3〕。本研究采用還原型谷胱甘肽對(duì)缺血再灌注AKI大鼠進(jìn)行術(shù)前干預(yù)，分析其干預(yù)效果和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠48只，體重200～240 g，購(gòu)自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(合格證號(hào)：201000050435)，飼喂在我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，予全顆粒鼠飼料，自由攝食、取水，調(diào)節(jié)12 h/12 h晝夜節(jié)律，溫度及濕度適宜，適應(yīng)性飼喂1 w后開始試驗(yàn)。

1.2 試劑和儀器 還原性谷胱甘肽(商品名：阿拓莫蘭，重慶藥友制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20051599，規(guī)格：1.0 g/支)，生理鹽水、戊巴比妥均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司，白細(xì)胞介素(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 動(dòng)物分組和造模方法 將48只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SN組)、造模組(IN組)、還原型谷胱甘肽治療組(IG組)各16只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模手術(shù)前禁食12 h，手術(shù)前用4%戊巴比妥50 mg/kg體重腹腔注射麻醉，確認(rèn)麻醉后頸、腹部備皮，取仰臥位，鋪消毒巾，延腹部正中線切開大鼠皮膚和肌肉，切口上緣距劍突0.5 cm，切口長(zhǎng)度不超過3 cm，小心分離頸靜脈，翻出腸管用生理鹽水紗布保濕，用玻璃分針找到雙側(cè)腎蒂，無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉雙側(cè)腎蒂，觀察腎臟顏色由粉紅轉(zhuǎn)為蒼白表明缺血處理成功，關(guān)閉腹腔，生理鹽水紗布覆蓋，90 min后松開血管夾，觀察腎臟顏色恢復(fù)粉紅表明再灌注成功，放回腸管，逐層縫合腹壁。IN組及IG組所有小鼠均造模成功。IG組在夾閉腎蒂前10 min經(jīng)頸靜脈注射200 mg/ml還原型谷胱甘肽，3 ml/kg體重；IN組在夾閉前給予同等劑量的生理鹽水；SN組打開腹腔后行假手術(shù)，不給予任何藥物或生理鹽水，也不夾閉腎蒂。所有動(dòng)物分兩批在手術(shù)后6 h和12 h處死，每批處死8只，并收集腎臟組織標(biāo)本。

1.4 指標(biāo)檢測(cè) 動(dòng)物處死前，經(jīng)下腔靜脈采血2管，其中一管3 ml，采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)；另一管4 ml室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min收集血清保存于-80℃冰箱中備用，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)血清中IL-6和TNF-α水平，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。取部分腎臟組織，稱重后在4℃冰水浴中加入適量生理鹽水，采用大龍D-160手持式均質(zhì)分散機(jī)制成10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min后取上清保存于-80℃冰箱中備用。SOD檢測(cè)采用黃嘌呤氧化法，MDA檢測(cè)采用硫代巴比妥酸法，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，計(jì)量資料多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用SNK法。

2 結(jié) 果

2.1 血液生化指標(biāo)變化 術(shù)后6 h、12 h三組SCR及BUN水平整體比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。術(shù)后6 h IN組與IG組SCr和BUN水平均顯著高于SN組，且隨時(shí)間增加兩組SCr和BUN水平進(jìn)一步升高；術(shù)后12 h IG組SCr和BUN水平均顯著低于IN組(均P<0.05)。見表1。

表1 術(shù)后6 h、12 h三組大鼠SCR和BUN比較

與SN組比較：1)P<0.05，與IN組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 血清炎癥因子變化 術(shù)后6 h、12 h三組血清IL-6與TNF-α水平整體比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。術(shù)后6 h，IN組與IG組IL-6水平均顯著高于SN組，術(shù)后12 h兩組IL-6水平略有下降但仍顯著高于SN組，IG組IL-6水平顯著低于IN組(均P<0.05)；術(shù)后6 h和12 h IN組TNF-α水平均顯著高于SN組(P>0.05)，IG組TNF-α水平與SN組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表2。

2.3 腎組織中SOD和MDA活力變化 術(shù)后6 h、12 h三組腎組織中SOD和MDA活力整體比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。術(shù)后6 h和12 h SN組與IG組SOD活力均顯著高于IN組(P<0.05)，而SN組與IG組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；術(shù)后6 h和12 h IN組MDA活力均顯著高于SN組與IG組，而SN組與IG組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

表2 術(shù)后6 h、12 h三組大鼠血清IL-6與TNF-α比較

表3 術(shù)后6 h、12 h三組大鼠腎組織中SOD和MDA活力比較

3 討 論

AKI是多種病因所導(dǎo)致的危急重癥，一旦發(fā)展成為急性腎衰竭，死亡率高達(dá)60%，幸存的患者中，約有10%～20%發(fā)展成為慢性腎衰竭，最終導(dǎo)致終末性腎臟疾病〔4〕。缺血再灌注是指組織缺血后重新獲得血液灌注和氧氣供給后，對(duì)組織和器官產(chǎn)生的損傷作用。腎臟是缺血再灌注損傷高發(fā)器官之一，通常由腎血管硬化、腎靜脈栓塞、心臟驟停、嚴(yán)重創(chuàng)傷等一過性缺血性疾病所致〔5〕。既往研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠BUN和SCR水平在手術(shù)后即開始上升，到48 h達(dá)到頂峰〔6〕，而對(duì)腎臟組織的病理觀察顯示缺血再灌注早期，腎組織以腎小管上皮細(xì)胞非壞死性病變?yōu)橹鳎S著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)壞死性病變；到再灌注晚期時(shí)，腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落明顯，且皮質(zhì)與髓質(zhì)交界處受損最嚴(yán)重〔7〕。證明通過該方法建立缺血再灌注AKI大鼠模型的方法是成功的。

腎臟缺血再灌注時(shí)，主要通過氧自由基和各類細(xì)胞因子和化學(xué)分子調(diào)控〔8〕。從細(xì)胞角度分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇增加，而內(nèi)源性的抗氧化物并未相應(yīng)增加甚至減少，導(dǎo)致活性氧簇在細(xì)胞內(nèi)積累，損傷細(xì)胞〔9〕；其次，組織再灌注時(shí)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，分泌大量炎癥因子，加重了再灌注部位組織細(xì)胞的損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)，還原型谷胱甘肽能夠有效控制缺血再灌注所導(dǎo)致的局部炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子水平，減輕損傷程度。導(dǎo)致缺血再灌注的另一重要機(jī)制為氧自由基的產(chǎn)生及其所致的脂質(zhì)過氧化。生理狀態(tài)下體內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生少量活性氧簇，但是很快會(huì)被體內(nèi)的SOD、過氧化氫酶等清除〔11〕，在缺血、缺氧等病理生理狀態(tài)下，線粒體少量產(chǎn)生的氧自由基會(huì)爆發(fā)性增加，同時(shí)炎癥反應(yīng)募集的中性粒細(xì)胞也具有產(chǎn)生活性氧簇的能力〔12〕。本研究證明還原型谷胱甘肽能顯著減少再灌注所致的腎組織內(nèi)活性氧簇的積累，緩解組織氧化應(yīng)激，減輕損傷。與此同時(shí)，接受還原型谷胱甘肽治療的大鼠血液中BUN和SCR水平均有不同程度的降低，表明還原型谷胱甘肽在清除氧自由基和緩解炎癥狀態(tài)的基礎(chǔ)上，確實(shí)能有效緩解缺血再灌注所導(dǎo)致的腎損傷。

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3 劉楠梅，王會(huì)玲，韓國(guó)鋒，等.血紅素氧化酶1過表達(dá)對(duì)急性損傷腎臟中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響〔J〕.腎臟病與透析腎移植雜志，2015；24(5)：441-6.

4 徐鑫梅，梁國(guó)標(biāo)，易清平，等.低劑量促紅細(xì)胞生成素減輕急性腎損傷后的慢性纖維化病變〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013；30(3)：579-80.

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〔2015-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

2010年瀘州醫(yī)學(xué)院科研課題(No.院發(fā)2011-43號(hào))

侯 靜(1973-)，女，碩士，副教授，主要從事臨床腎臟病研究。

R692.3

A

1005-9202(2016)22-5537-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.019

1 西南醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所