金 華 劉志軍 顏春魯 劉峰林 陳 麗 張秋菊 伍志偉 胡繼宏 竇榮海 溫鑫洋 曹 強(qiáng) 蘇莉莉

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

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·基礎(chǔ)研究·

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠促胰液素、生長(zhǎng)抑素mRNA表達(dá)的影響

金 華 劉志軍 顏春魯 劉峰林 陳 麗 張秋菊 伍志偉 胡繼宏 竇榮海 溫鑫洋 曹 強(qiáng) 蘇莉莉

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)促胰液素(PZ)、生長(zhǎng)抑素(SS)mRNA的影響。方法 14周齡雄性SHR隨機(jī)分為模型組(n=15)、貝那普利組(鹽酸貝那普利灌服0.90 mg·kg-1·d-1，n=15)、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯低、中、高劑量組(鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯分別灌服15、30、60 g·kg-1·d-1，n=15)，以WKY大鼠作為正常對(duì)照(n=15)，模型組及WKY組每日灌服同體積的蒸餾水。干預(yù)8 w后，采用免疫組化法和RT-PCR法檢測(cè)十二指腸、胃竇中PZ、SS mRNA的表達(dá)。結(jié)果 干預(yù)8 w后，與WKY組比較，模型組十二指腸中PZ、胃竇中SS mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組與鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯各劑量組十二指腸中PZ、胃竇中SS mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與貝那普利組比較，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯各劑量組十二指腸中PZ、胃竇中SS mRNA表達(dá)降低更為明顯(P<0.05)。結(jié)論 SHR十二指腸中PZ和胃竇中SS調(diào)節(jié)失衡，貝那普利和鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的降壓作用可能通過調(diào)節(jié)PZ和SS的表達(dá)而達(dá)到降壓目的，而鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的調(diào)節(jié)作用更為明顯。

促胰液素；生長(zhǎng)抑素；鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯；貝那普利

自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)是最接近人類原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型，與人類原發(fā)性高血壓病變過程相似，其遺傳穩(wěn)定均一，而癥狀、體征等隨周齡的增長(zhǎng)而發(fā)生變化。近年來，胃腸激素與高血壓的關(guān)系日益引起廣泛重視〔1，2〕，但胃腸激素通過什么途徑和(或)環(huán)節(jié)影響血壓的調(diào)控仍不明確。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 14周齡雄性SHR，SPF級(jí)，體重(350±20)g；同源雄性 WKY大鼠15只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室〔恒溫(22±2)℃，恒濕(55±5)%，人工光照明暗各12 h〕。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) SHR常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為模型組、貝那普利組、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯高、中、低劑量組，每組各15只；同時(shí)以WKY大鼠15只作為WKY組。以蒸餾水為溶劑配制貝那普利和氨氯地平混懸液，貝那普利組灌服貝那普利0.90 mg·kg-1·d-1；中藥低、中、高劑量組分別灌服鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯 15、30、60 g·kg-1·d-1。SHR組及WKY組每日灌服同等體積的蒸餾水。共干預(yù)8 w。

1.3 藥物、試劑和儀器 鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯按張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》藥物組成和劑量制備(1兩=30 g，1錢=3 g)，由牛膝30 g、代赭石30 g、龍骨15 g、牡蠣15 g、龜甲15 g、杭白芍15 g、玄參15 g、天冬15 g、川楝子6 g、麥芽6 g、茵陳6 g、甘草4.5 g組成，飲片由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供。代赭石、龍骨、牡蠣、龜甲先煎2 h，然后與其他藥物用8倍蒸餾水常規(guī)煎煮3次，過濾、濃縮，至含原藥材1.5、3.0 g/ml，置于4℃冰箱中保存，備用。鹽酸貝那普利(洛汀新，10 mg，北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：X1936)。促胰液素(PZ)/(Secretin)一抗，批號(hào)：GR 80805-1；生長(zhǎng)抑素(SS)一抗，批號(hào)：GR 80805-1；山羊抗兔IgG(H+L)，ab6702；上述均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。免疫組化染色試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。RNA提取試劑盒(QIAGEN公司，批號(hào)74104)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche公司)、熒光染料(Roche公司)、PCR引物(金唯智生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成)、全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(Bio-Rad公司，型號(hào)iMark)、熒光PCR儀(Bio-Rad公司，型號(hào)CFX96)、凝膠掃描成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)、電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)FA2004N)、醫(yī)用低速離心機(jī)(金壇市恒豐儀器廠，型號(hào)LX-820)等。

1.4 免疫組化法測(cè)定PZ、SSS的表達(dá) 取部分十二指腸(幽門下1.5 cm處)、胃竇部組織，作適當(dāng)?shù)男拚蠓湃?%多聚甲醛中固定。①石蠟切片：40℃過夜，60℃烤片1 h；②常規(guī)脫蠟至水；③抗原修復(fù)：枸櫞酸緩沖液(pH6.0)恒溫水浴至95℃～98℃，放入玻片，維持60 min；室溫放置自然冷卻，PBS沖洗5 min×3次；④滴加內(nèi)源性過氧化物酶封閉液，避光室溫孵育10 min；PBS沖洗5 min×3次；⑤封閉：滴加正常山羊血清，37℃孵育15 min，甩干不洗；⑥滴加稀釋5-HT抗體，然后4℃過夜。用PBS替代一抗作為陰性對(duì)照，約12～16 h；次日取出，室溫放置10 min，PBS洗5 min×3次；⑦滴加二抗工作液，37℃孵育30 min；PBS洗5 min×3次；⑧滴加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37℃孵育15 min；PBS洗5 min×3次；⑨DAB顯色：DAB按試劑說明書配置，鏡下觀察，至目的組織出現(xiàn)陽性顆粒而周圍組織無非特異顯色時(shí)，蒸餾水終止；⑩蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1～2 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，鏡下控制，自來水反藍(lán)10 min；脫水、透明、封片。

1.5 RT-RCR法測(cè)定PZ、SS mRNA表達(dá) ①總RNA的提取：取30 mg組織提取總RNA，液氮速凍后碾磨組織，加入600 μl RLT裂解液裂解組織，將所得溶液于離心機(jī)4℃、12 000 r/min離心3 min；加入70%乙醇600 μl后，立即轉(zhuǎn)移700 μl溶液(包括沉淀)至柱子上，4℃ 12 000 r/min離心15 s，完全濾過溶液；分別加入700 μl Buffer RW1、500 μl Buffer RPE，按上述條件離心，棄濾液，加入500 μl Buffer RPE 4℃ 12 000 r/min離心2 min，棄濾液；將柱子移入至新的2 ml試管中，4℃ 12 000 r/min離心1 min干燥濾膜，將柱子移入之新的1.5 ml試管中加入30～50 μl無酶水，4℃ 12 000 r/min離心1 min得到RNA；同時(shí)取2 μl RNA樣品稀釋50倍后測(cè)定樣品在260 nm和280 nm的吸收值，OD260/280 1.8～2.0視為提取的總RNA質(zhì)量純度較好。② 逆轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA：使用羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒(No 0489686-6001)，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄總mRNA，合成第一鏈cDNA文庫(kù)，反應(yīng)產(chǎn)物在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫磻?yīng)條件：25℃、10 min，55℃、30 min，85℃、5 min，4℃保存。引物設(shè)計(jì)與合成：β-actin：正義：AGGGAAATCGTGCGTGAC，反義：CGCTCATTGCCGATAGTG。③ cDNA的PCR擴(kuò)增：使用FastStart Universal SYBR Green MASTER(ROX)，實(shí)驗(yàn)步驟參照其說明書，采用總體積50 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95℃、5 min，95℃、10 s，55℃、20 s，75℃、30 s。使用PCR儀自帶軟件算出CT值并用2-△△CT法做相對(duì)定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 PZ在十二指腸中的表達(dá) 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，PZ在各組大鼠的十二指腸中均有表達(dá)。與WKY組(89.59±5.30)比較，模型組PZ的表達(dá)(124.51±1.18)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組(117.60±1.84)和中藥中、低劑量組PZ的表達(dá)(93.60±6.93、113.60±3.47)明顯降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，中藥中劑量組PZ的表達(dá)顯著降低(P<0.01)中藥高劑量組PZ表達(dá)灰度為(122.27±2.51)。鏡下觀察顯示，PZ在黏膜下腺體上皮內(nèi)分泌細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)較明顯，由S細(xì)胞分泌，WKY組PZ在胞質(zhì)中表達(dá)較弱，模型組PZ在胞質(zhì)中表達(dá)增強(qiáng)，貝那普利組和中藥中、低劑量組PZ在胞質(zhì)中表達(dá)減弱，見圖1。

2.2 SS在胃竇組織中的表達(dá) 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，SS在各組大鼠的胃竇中均有表達(dá)。與WKY組(78.41±4.16)比較，模型組SS的表達(dá)(91.44±2.08)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組(82.65±2.99)和中藥高、中劑量組SS的表達(dá)(80.39±2.97、88.42±2.37)明顯降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，中藥高劑量組SS的表達(dá)明顯降低(P<0.05)中藥低劑量組SS表達(dá)灰度為91.26±1.97。鏡下觀察顯示，SS由黏膜下腺體上皮內(nèi)分泌細(xì)胞(D細(xì)胞)分泌，表達(dá)在D細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，散在分布，WKY組SS在D細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)較弱，模型組SS 在D細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)增強(qiáng)，貝那普利組和中藥高、中劑量組SS 在D細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)減弱，見圖2。

2.3 PZ mRNA在十二指腸中的表達(dá) 與WKY組(0.10±0.03)比較，模型組PZ mRNA在十二指腸中的表達(dá)(1.00±0.07)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，貝那普利組(0.55±0.14)和中藥高、中劑量組PZ mRNA(0.19±0.05、0.27±0.02)在十二指腸中的表達(dá)降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，中藥高劑量組PZ mRNA在十二指腸中的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。中藥低劑量組PZ mRNA表達(dá)量為1.04±0.13。

圖1 各組大鼠十二指腸中PZ表達(dá)(DAB，×400)

2.4 SS mRNA在胃竇中的表達(dá) 與WKY組(0.56±0.13)比較，模型組SS mRNA在胃竇中的表達(dá)(1.00±0.31)明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組SS mRNA在胃竇中的表達(dá)降低(P<0.05)，貝那普利組、中藥高、中、低劑量組分別為0.74±0.40，0.25±0.01，0.48±0.24，0.58±0.17；與貝那普利組比較，中藥低劑量組SS mRNA在胃竇中的表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

高血壓是目前臨床最常見的慢性疾病之一，是引起心腦血管疾病終點(diǎn)事件的首要危險(xiǎn)因素。高血壓的發(fā)生與遺傳易感性和環(huán)境因素密切相關(guān)，遺傳與環(huán)境因素可能通過胃腸激素途徑影響血壓的調(diào)控。研究認(rèn)為，血液所攜帶的胃腸激素是胃腸道向腦內(nèi)傳遞的重要化學(xué)信號(hào)，這些信號(hào)物質(zhì)可以通過腦干的最后區(qū)(AP)直接入腦〔3〕，而部分胃腸激素通過腦干的孤束核將信號(hào)傳至下丘腦〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)SS〔5〕、PZ〔6〕均為應(yīng)激敏感激素。Welch等〔7〕發(fā)現(xiàn)PZ及其受體廣泛分布于大腦皮質(zhì)和各種神經(jīng)核團(tuán)，參與中樞中各種神經(jīng)元活動(dòng)的調(diào)節(jié)，因而他們認(rèn)為在中樞的PZ充當(dāng)了神經(jīng)調(diào)質(zhì)的作用。研究顯示，PZ還可以調(diào)節(jié)下丘腦、垂體、腎滲透壓〔8，9〕。SS具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和多種激素的雙重作用〔10〕。Liddle〔11〕研究發(fā)現(xiàn)，SS除參與認(rèn)知、痛覺、行為、胃腸運(yùn)動(dòng)等外，還參與血壓的調(diào)節(jié)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可能通過下調(diào)十二指腸組織中PZ和胃竇組織中SS mRNA的表達(dá)，從而起到降壓的作用；并且從生物免疫學(xué)角度，發(fā)現(xiàn)鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯不僅能抑制S細(xì)胞的分泌功能，使促胰液素在黏膜下腺體上皮內(nèi)分泌細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)減弱，進(jìn)而降低十二指腸組織中PZ的表達(dá)；而且能抑制D細(xì)胞的內(nèi)分泌功能，使SS在黏膜下腺體上皮內(nèi)分泌細(xì)胞(D細(xì)胞)的胞質(zhì)中表達(dá)減弱，進(jìn)而降低胃竇組織中SS的表達(dá)。從而推測(cè)，SHR十二指腸中PZ和胃竇中SS調(diào)節(jié)失衡，貝那普利和鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可能通過調(diào)節(jié)PZ和SS的表達(dá)而達(dá)到降壓目的，而鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯的調(diào)節(jié)作用更明顯。本次實(shí)驗(yàn)中，中藥高劑量組胃竇組織中SS mRNA表達(dá)明顯降低，其機(jī)制還需深入研究。

鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯源自張錫純所著《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，功以鎮(zhèn)肝熄風(fēng)，滋陰潛陽。方中牛膝辛行苦降，引血下行，以滋肝腎，故而重用。生赭石質(zhì)重沉降，重鎮(zhèn)肝氣，使氣血不逆；生龍骨、生牡蠣、生龜板得水之陰，氣厚咸寒，滋陰潛陽，平肝安神，以助君藥，滋潛亢陽；玄參、天冬、白芍其性陰柔，助君制陽，平肝降逆。茵陳、川楝子、麥芽同為佐，清泄肝氣余火，條達(dá)肝氣郁結(jié)。甘草調(diào)和諸藥，麥芍益胃和中，防重墜而護(hù)胃，益土而調(diào)升降。《顧氏醫(yī)鏡》中說：“升降者，病機(jī)之要也。”恢復(fù)和維持氣機(jī)升降出入的有序狀態(tài)，使臟腑功能紊亂、氣化失司的無序狀態(tài)得以糾正，是疾病治療的目標(biāo)。脾升清方能補(bǔ)五臟之虛，胃降濁方使六腑傳化有常。因此，疾病治療的關(guān)健在于調(diào)理中焦，暢達(dá)氣機(jī)，順脾胃之性而時(shí)時(shí)顧護(hù)胃氣。胃氣存，氣機(jī)升降才可能有序；正氣得復(fù)，病可向愈〔12〕。有研究認(rèn)為，鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯可激活腦組織PPARγ mRNA表達(dá)，降低腦組織中ET分泌，使腦血管擴(kuò)張，從而對(duì)SHR產(chǎn)生腦保護(hù)作用〔13〕。

1 金 華，金 釗，張蕾蕾.基于胃腸激素觀點(diǎn)的高血壓發(fā)病機(jī)制思考〔J〕.醫(yī)學(xué)與哲學(xué)(臨床決策論壇版)，2011；32(6)：33-4.

2 祝之明，熊詩(shī)強(qiáng).胃腸道——代謝性高血壓發(fā)病的始動(dòng)器官？見：胡大一，馬長(zhǎng)生.心血管病學(xué)實(shí)踐2015〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015：93-8.

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13 孟云輝，凃 欣，吳艷霞.鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦保護(hù)作用的研究〔J〕.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào).2007；30(2)：101-4.

〔2016-04-16修回〕

(編輯 李相軍)

The influence of Zhengan Xifeng decoction on the expression of mRNA of secretin and smatostatin in spontaneously hypertensive rats

JIN Hua,LIU Zhi-Jun,YAN Chun-Lu,et al.

Gansu University of Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China

Objective To investigate the influence of Zhengan Xifeng decoction on the mRNA expression of Secretin (PZ)and Somatostatin (SS)in spontaneously hypertensive rats (SHR).Methods 45 SHRs(14 week old,male)were randomly assigned into model,Benazepril groups which were given benazepril 0.45 mg·kg-1·d-1and low,middle and high dose of Zhengan xifeng decoction groups (respectively given Zhengan xifeng decoction 15,30,60 g·kg-1·d-1),WKYs as normal control.After 8 weeks of intervention,the expressions of PZ in duodenum and SS in sinuses ventriculi were detected by enzyme linked immunoassay and RT-PCR.Results Compared with those of WKY group,the expressions of PZ mRNA in the duodenum and SS mRNA in sinuses ventriculi were significantly decreased(P<0.05).Compared with those of model group,the expressions of PZ mRNA in the duodenum and SS mRNA in sinuses ventriculi were increased significantly in Benazepril and Zhengan xifeng decoction groups (P<0.05)after 8 weeks.Compared with those of Benazepril group,the expressions of PZ mRNA in the duodenum and SS mRNA in sinuses ventriculi in Zhengan xifeng decoction groups were more significantly (P<0.05).Conclusions The regulation disorder of PZ in duodenum and SS in sinuses ventriculi in the balance exists of SHR.The antihypertensive effect of Benazepril and Zhengan xifeng decoction may be realized by regulating the expression of PZ and SS,while the regulation of Zhengan xifeng decoction was more obvious.

PZ；SS；Zhengan xifeng decoction；Benazepril

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160477);甘肅省自然科學(xué)研究基金計(jì)劃( 1107RJZA220);甘肅省高等學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(2010-5)

金 華(1970-)，男，教授，主任醫(yī)師，主要從事心腦血管疾病及其危險(xiǎn)因素的研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)22-5493-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.001