王 強 劉智斌 牛文民 楊曉航 王 淵 朱先偉 劉思洋 王衛(wèi)剛

陜西中醫(yī)藥大學(咸陽 712046)

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·實驗研究·

電針迎香穴對嗅覺障礙大鼠嗅粘膜Ki-67、IGF-1R及嗅球IGF-1表達的影響*

王 強 劉智斌△牛文民 楊曉航 王 淵 朱先偉 劉思洋▲王衛(wèi)剛■

陜西中醫(yī)藥大學(咸陽 712046)

目的:觀察電針迎香穴干預嗅覺障礙大鼠嗅粘膜Ki-67、IGF-1R及嗅球IGF-1表達的影響。方法: 取SD雄性大鼠40只，隨機分為空白組，嗅覺障礙組，嗅覺障礙+電針迎香穴組，嗅覺障礙+眶下神經切斷+電針迎香穴組，每組10只。除空白組外，其余各組均用灌注TritonX-100的方法建立嗅覺障礙，造模成功后進行電針干預10d，用免疫組織化學法及Westernblot法測定組織中Ki-67、IGF-1和IGF-1R的表達水平。結果: 嗅覺障礙模型中嗅黏膜Ki-67、IGF-1R和嗅球IGF-1表達減少(P<0.05)，電針迎香穴可以顯著增加嗅黏膜Ki-67、IGF-1R和嗅球IGF-1的表達水平 (P<0.05)，而電針迎香穴+眶下神經切斷組則無顯著干預效應。結論 :電針迎香穴干預可以改善TritonX-100誘導的大鼠嗅覺功能障礙，其機制可能與提高嗅覺神經相關細胞因子Ki-67和IGF-1、IGF-1R在嗅黏膜及嗅球的表達有關，且迎香穴的干預效應與三叉神經通路的完整性密切相關。

嗅覺功能減退與多種疾病有密切聯系，譬如神經退行性疾病或鼻黏膜炎癥相關疾病[1]。神經解剖學表明，鼻黏膜神經上皮層是中樞神經系統(tǒng)神經元和環(huán)境直接相連的部位之一，所以通過嗅覺傳導通路異?？赡軙е轮袠猩窠洸∽兊陌l(fā)生,其可以分為嗅覺部分或完全性減退或異常[2]。而嗅感覺神經元(Olfactory receptor neurons,ORNs)的損傷可以導致不同程度的嗅覺障礙[3]。有文獻表明，Ki-67與胰島素樣生長因子-1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)及其受體胰島素樣生長因子-1R(IGF-1R)在嗅感神經元的發(fā)生中有重要作用[4]。本實驗應用免疫組化及蛋白質印跡法，通過觀察嗅球及嗅黏膜中嗅覺相關細胞因子表達的變化，來探討Triton-100經鼻滴入對大鼠嗅覺功能的影響，以及電針迎香穴對于嗅覺功能障礙大鼠的效應機制，之前的實驗我們應用動物行為學證明了電針迎香穴對于嗅覺功能障礙大鼠的改善效果，所以本實驗擬進一步闡明迎香穴對嗅覺障礙的干預效應是基于三叉神經通路完整性而發(fā)揮作用的。

1 材料及方法 1.1 動物及分組 清潔級SD大鼠雄性大鼠40只，隨機分為空白組(Sham)，嗅覺障礙組(Model)，嗅覺障礙+電針迎香穴組(YXX)，嗅覺障礙+眶下神經切斷+電針迎香穴組(KXSJ+YXX)，每組10只。

1.2 試劑與儀器 小鼠胰島素樣生長因子1(IGF-1)、小鼠胰島素樣生長因子1R(IGF-1R)、Ki-67免疫組化試劑盒(Sigma公司)；生物素化山羊抗兔IgG(中山金橋生物有限公司)；BA200Digital數碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；2015型轉輪式切片機；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威醫(yī)療儀器有限公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)。

1.3 嗅覺障礙模型 將大鼠用0.3%戊巴比妥鈉麻醉后，用微量注射器(注射器針頭磨鈍)對雙側鼻孔一次性灌注100μL 0.7% Triton X-100(PBS配制),灌流時間1min[5]。

1.4 眶下神經切斷模型 常規(guī)消毒大鼠兩側眶下皮膚區(qū)域，沿兩側眶下緣做一水平切口，長約0.5cm，鈍性分離皮下脂肪，暴露眶下孔，仔細分離眶下神經及其同名動靜脈，避開血管，切斷眶下神經。

1.5 電針方法 迎香穴定位[6]：大鼠鼻孔外側上端，有毛與無毛交界處。電針方法：迎香穴向內上方斜刺0.3cm，電針參數：1mA,疏密波；正極和負極各接一側迎香穴，刺激時間10min，1次/d。以上電針處理均在造模成功后第1天進行。療程參照嗅神經切斷對ORN的影響的文獻[7]制定，確定5d為1個療程，休息2d，共進行2個療程，未行電針干預組常規(guī)飼養(yǎng)至電針療程結束。

1.6 組織取材方法 療程結束后實施組織取材。嗅黏膜采集方法：75%的醫(yī)用酒精消毒大鼠皮膚，2%戊巴比妥鈉完全麻醉后,斷頭處理。用血管鉗將鼻中隔取出,可見嗅區(qū)呈黃色的區(qū)域，將此嗅區(qū)鼻中隔(嗅黏膜和骨質)完整取下，在顯微鏡下將嗅黏膜完整刮下。參考The Rat Brain嗅球采集方法：采用電鉆在前囟前3.2mm 為后界開窗，使左側嗅球暴露，繼而從后界垂直插入取出嗅球[8]。免疫組化和電鏡分別給與不同切片處理。

1.7 嗅黏膜Ki-67、IGF-1R表達檢測方法 按照常規(guī)免疫組化方法處理，包括載玻片防脫片處理、脫蠟、熱修復抗原、山羊血清封閉液；滴加1∶200的一抗后，4℃孵育過夜。次日，PBS洗3次后滴加山羊抗鼠/兔IgG二抗，PBS洗后使用DAB試劑盒顯色；最后至蘇木素復染、脫水、透明及封片。

1.8 圖像采集 圖像采集應用顯微攝像系統(tǒng)，對于采集組織的所有切片，先將其置于100倍鏡下進行觀察，其次參照嗅黏膜和嗅球組織表達情況進行圖像采集，選取1個區(qū)域進行鏡下400倍觀察。

1.9 嗅球IGF-1表達檢測方法 采用蛋白質印跡法進行檢測，應用試劑盒(上海眾生生命科學發(fā)展有限公司提供)進行蛋白抽提，勻漿嗅球組織至完全裂解，將裂解液于4℃離心機中離心(10000×g，15min)。用蛋白質定量試劑盒(BCA法,海門碧云天生物技術研究所)及酶標儀(Synergy2)測量562nm各孔光密度值，定量待測樣品蛋白濃度。得到樣品經電泳，轉膜，封閉后加入兔抗IGF-1一抗(Millipore公司，1∶1000)4℃過夜，Tris-HCL緩沖鹽溶液(TBST)反復漂洗后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(美國sigma公 司，1∶5000)室溫避光孵育1h，TBST漂洗后用ECL法顯影，結果用Bio-RAD Quantity one 圖像分析軟件進行掃描分析。以IGF-1的目的條帶與內參GAPDH條帶的比值代表產物的相對表達量。

測定目標圖像的平均光密度值，應用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，所有數據以均數±標準差表示。

2 結 果 2.1 各組大鼠嗅黏膜中IGF-1R的表達

圖1 各組大鼠嗅黏膜中IGF-1R陽性表達灰度值(免疫組化染色，IHC×400)

表1 各組大鼠IGF-1R蛋白表達

如圖1和表1所示，各組嗅黏膜均可見IGF-1R陽性表達，模型組和空白組比較，嗅黏膜中IGF-1R的陽性表達均顯著低于空白組(P<0.05)，電針迎香穴組顯著提高了IGF-1R在嗅黏膜中的表達(P<0.05)，而電針迎香穴干預眶下神經切斷模型組大鼠與模型組比較沒有明顯的變化。

2.2 各組大鼠嗅黏膜中Ki-67的表達

圖2 各組大鼠嗅黏膜中Ki-67陽性表達灰度值(免疫組化染色，IHC×400)

表2 各組大鼠Ki-67蛋白表達

如圖2和表2所示，模型組和空白組比較，嗅黏膜中Ki-67陽性表達均顯著低于空白組(P<0.05)，電針迎香穴組顯著升高了Ki-67在嗅黏膜中的表達(P<0.05),而電針迎香穴干預眶下神經切斷模型組大鼠與模型組比較沒有明顯的變化。

2.3 各組大鼠嗅球中IGF-1蛋白的表達

圖3 各組大鼠嗅球中IGF-1蛋白的表達

表3 各組大鼠IGF-1蛋白的表達

如圖3和表3所示，模型組和空白組比較，嗅球中IGF-1蛋白的表達均顯著低于空白對照組(P<0.05)，電針迎香穴組顯著提高了IGF-1在嗅球組織中的表達(P<0.05),電針迎香穴干預眶下神經切斷模型組大鼠與模型組比較沒有明顯的變化。

3 討 論 Ki-67通常表達于人增殖細胞的各期，在有絲分裂后Ki-67抗原表達下降，所以，這種抗原被命名為Ki-67抗原，是一類與細胞周期相關的細胞核非組蛋白[9]。在我們的實驗中觀察到，對于嗅覺障礙模型大鼠嗅黏膜中的Ki-67陽性細胞，其數量較正常組顯著降低，而且基底層的這種變化更為明顯。位于嗅黏膜基底層中的基底細胞類似神經干細胞，即可以進行分裂增殖，文獻表明，在正常生理情況下，嗅感神經元在凋亡以后，新的嗅感神經元能夠由基底細胞分化出來，從而維護正常的嗅覺功能，在發(fā)生嗅覺障礙的時候，由于Ki-67的表達減少，會導致嗅感神經元再生能力降低，最終導致感受嗅覺的神經元顯著減少[10]。電針迎香穴組與模型組比較發(fā)現Ki-67的陽性細胞數量顯著恢復，結合之前行為學實驗結果發(fā)現嗅覺障礙同時也得到了明顯改善。

胰島素樣生長因子-1R(IGF-1R)及胰島素樣生長因子-1(IGF-1)主要在肝臟產生，與胰島素同源，同時也具有胰島素樣效應，IGF-1的受體包括IGF-1R。在我們的實驗中發(fā)現，模型組大鼠嗅黏膜IGF-1R和嗅球IGF-1中的表達量相對于空白組明顯降低，提示嗅感神經元數量減少可能是由于IGF-1的作用減弱，進而引發(fā)嗅覺障礙加重。結果表明，電針迎香穴可以抑制IGF-1表達減少，這可能是電針干預對大鼠嗅覺障礙改善的機制之一，而與Ki-67表達一樣，眶下神經切斷后，電針干預組與模型組沒有顯著性差異。我們發(fā)現，嗅覺障礙大鼠的Ki-67和IGF-1及其受體在嗅球以及嗅黏膜上的表達具有正相關，表明二者在促進嗅感覺神經元的再生方面可能具有協(xié)同作用，在切斷眶下神經后，這些因子的表達同樣具有一致性。

嗅覺障礙在中醫(yī)文獻中多以“鼻聾”命名，但由于病因不明，目前沒有明確的西醫(yī)干預手段。我們通過研究證實，由于Ki-67和IGF-1、IGF-1R表達的減少，從而導致了嗅感神經元的再生能力減弱，以至于無法產生足夠的神經元來維持正常的嗅覺，而電針迎香穴干預嗅覺障礙的結果表明，其可以抑制上述因子表達的減少。另外，我們通過切斷眶下神經，從反面印證了我們的推測，即電針迎香穴是基于三叉神經通路的完整性而發(fā)揮對上述因子的良性調控效應的。

[1] 劉巧平,劉建華.針刺內迎香治療嗅覺下降[J].北京中醫(yī)藥大學學報(中醫(yī)臨床版),2011,18(2):21-22.

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[5] 秦照萍,葉樹明，杜繼曾,等.Triton損傷成年大鼠嗅上皮對嗅球鈣結合蛋白-D和小白蛋白表達的影響[J].中國藥理學與毒理學雜志,2005,19(3):226-228.

[6] 郭 義.實驗針灸學[M]. 北京:中國中醫(yī)藥出版社,2008.

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(收稿2016-06-05；修回2016-06-28)

Effects of electroacupuncture of Yingxiang on expression of Ki-67 and IGF-1R of olfactory mucosa and IGF-1 of olfactory bulb in rats with olfactory dysfunction

Shaanxi University of Chinese Medicine (Xianyang 712046)

Wang Qiang Liu Zhibin Niu Wenmin et al

Objective: To observe the effect based on trigeminal nerve pathway of electroacupuncture of “Yingxiang” (LI20) on Ki-67 and IGF-1R of olfactory mucosa and IGF-1 of olfactory bulb of olfactory dysfunction(OD) rats. Methods: 40SD mouses were divided into four groups：control group、model group、OD + LI20group and OD + ONT + LI20group,OD models were established by perfused Triton X-100.10days were taken as one treatment course. We monitored behavioral detection of rats and observed the expression level Ki-67 and IGF-1R of olfactory bulb or olfactory mucosa by immuno histochemistry.Results: According to olfactory dysfunction model,expression of Ki-67 and IGF-1R of olfactory mucosa and IGF-1 of olfactory bulb were significantly decreased by electroacupuncture group(P<0.05),meanwhile,there was no significant difference for electroacupuncture group on ONT of OD rats.Conclusion: Electroacupuncture on LI20had a favorable effect on Triton X-100-induced olfactory disorders,its mechanism might based on increasing the expression of Olfactory nerve related cytokines Ki-67 and IGF-1R of olfactory mucosa and IGF-1 of olfactory bulb,and the intervention effect might be relied on the integrity of trigeminal nerve pathway.

Olfaction disorders/acupuncture-moxibustion Point LI20(Yingxiang) Electroacupuncture Rats Animal experimentation

*國家自然科學基金項目(81273859)

嗅覺障礙/針灸療法 穴,迎香 電針 大鼠 動物實驗

R

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.050

陜西省教育廳專項科學研究項目(11JK0679)

▲西安醫(yī)學院(西安 710021)

■陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

△通訊作者