李紅剛 王紅鴿 聶曉楓 孫 陳衛(wèi)銀 陜西省渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院(渭南714000)

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三個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對大鼠腦缺血再灌注后bc1-2、bax表達(dá)的影響*

目的：通過觀察四川、山東、河南三個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織bc1-2和bax蛋白表達(dá)的影響，探討三產(chǎn)區(qū)丹參對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法：采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓加環(huán)扎法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，再灌注24h后各組bc1-2和bax蛋白的表達(dá)采用免疫組化法檢測。結(jié)果：再灌注24h后，模型組腦內(nèi)損傷區(qū)周圍bcl-2的表達(dá)明顯增加(P<0.05)，三產(chǎn)區(qū)丹參組均能明顯上調(diào)bcl-2的表達(dá)，與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，其中山東丹參組上調(diào)的幅度最大，與河南、四川丹參組比較有顯著差異(P<0.05)，河南、四川丹參組比較無顯著差異(P>0.05)；再灌注24h后，模型組腦內(nèi)損傷區(qū)周圍bax的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，三產(chǎn)區(qū)丹參組均能明顯降低bax的表達(dá)，與模型組比較有顯著差異(P<0.01)，其中四川丹參組降低的幅度最大，山東丹參組次之，河南丹參組降低的幅度最小，三組比較均有顯著差異(P<0.05)。結(jié)論：三個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物均能通過上調(diào)bcl-2表達(dá)，降低bax的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。不同產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對各指標(biāo)表達(dá)影響不同，其原因可能與不同產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶點(diǎn)不一致有關(guān)。

丹參是常用活血化瘀藥，其對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的影響報(bào)道較多，但查閱文獻(xiàn)，未見不同產(chǎn)地丹參對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型影響的報(bào)道。本研究選取四川、河南、山東三個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物，旨在觀察不同產(chǎn)區(qū)丹參對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織bc1-2、bax表達(dá)的影響，從而探討其對神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法 1.1 動(dòng) 物 健康SD大鼠60只(購于四川大學(xué))，合格證號：scxk(川)-10-2006，雌雄各半，體重275.25±24.28g，清潔級，鼠齡7～8周。

1.2 藥品與試劑 采取四川中江古店、山東沂南、河南方城栽培丹參根10kg，樣品采集后快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)加工處理后，干燥成藥材，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提取制成0.4g/ml生藥的供試品溶液。兔抗大鼠bcl-2單克隆抗體、兔抗大鼠bax單克隆抗體 ( 購買自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；生物素化羊抗兔IgG抗體(購買自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 造模及分組 大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型制備方法，采用頸內(nèi)動(dòng)脈線栓加環(huán)扎法。將60只大鼠按數(shù)字隨機(jī)法分為：正常組、假手術(shù)組、模型組、四川丹參組、山東丹參組、河南丹參組，每組10只。正常組：不給予任何干預(yù)措施；假手術(shù)組：先切開右側(cè)頸部皮膚，然后暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈分叉，隨后再縫合皮膚，術(shù)前5d生理鹽水灌胃，1次/d，術(shù)后2h生理鹽水再灌胃1次；模型組：MCAO造模90min后再灌注，造模前5d生理鹽水灌胃，1次/d，再灌注后2h時(shí)生理鹽水再灌胃1次；四川丹參組、山東丹參組、河南丹參組：MCAO造模90min后再灌注，造模前5d分別予四川、山東、河南丹參混合提取物灌胃，1次/d，再灌注后2h再灌胃1次。再灌注24h后處死大鼠。根據(jù)人與動(dòng)物用量體表面積換算法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)中丹參混合提取物的灌胃劑量為6.75ml/kg。

1.4 HE及免疫組織化學(xué)檢測方法 病理組織切片標(biāo)本收集及處理：實(shí)驗(yàn)各組SD大鼠，再灌注后24h灌注取腦并固定，固定72h后做成石蠟切片，每個(gè)標(biāo)本各取1張用于HE染色。應(yīng)用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法進(jìn)行，一抗為兔抗大鼠bcl-2、bax單克隆抗體，二抗為生物素化羊抗兔IgG抗體,封片后再采用光鏡觀察。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:免疫組化染色結(jié)果拍照后進(jìn)行半定量分析，并計(jì)算陽性細(xì)胞的積分光密度值IOD。采用SPSS19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析比較各組間數(shù)據(jù)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以P<0.01為極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果 2.1 各組腦組織光鏡下的HE染色結(jié)果 如圖所示，正常組和假手術(shù)組細(xì)胞與間質(zhì)之間界限清楚，細(xì)胞核完整，核仁清晰；模型組細(xì)胞與間質(zhì)之間界限不清楚，大部分組織細(xì)胞壞死，多數(shù)細(xì)胞溶解呈空泡狀，可見核固縮和核碎裂；三產(chǎn)區(qū)丹參各組腦組織細(xì)胞壞死程度較模型組輕，可見少量細(xì)胞核固縮及溶解，部分胞質(zhì)液化。

2.2 免疫組化染色的結(jié)果 2.2.1 bcl-2蛋白免疫組化染色的結(jié)果:正常組和假手術(shù)組腦內(nèi)bcl-2表達(dá)較少，二者無顯著差異；模型組腦內(nèi)損傷區(qū)周圍bcl-2的表達(dá)增加，與正常組、假手術(shù)組比較P<0.05；三產(chǎn)區(qū)丹參組均能明顯上調(diào)腦內(nèi)損傷區(qū)周圍bcl-2的表達(dá)，與模型組比較P<0.05；山東丹參組上調(diào)腦內(nèi)損傷區(qū)bcl-2的幅度最大，與河南、四川丹參組比較有顯著差異P<0.05，河南、四川丹參組比較無顯著差異P>0.05，見表1。免疫組化染色見圖2。

A：正常組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：河南丹參組；E：四川丹參組；F：山東丹參組

A：正常組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：河南丹參組；E：四川丹參組；F：山東丹參組

表1 各組Bcl-2的IOD值

2.2.2 bax蛋白免疫組化染色結(jié)果：正常組、假手術(shù)組腦內(nèi)bax表達(dá)較少，二者無顯著差異；模型組腦內(nèi)損傷區(qū)周圍bax的表達(dá)顯著增加，與正常組、假手術(shù)組比較P<0.01；三產(chǎn)區(qū)丹參組均能明顯降低腦內(nèi)損傷區(qū)周圍bax的表達(dá)，與模型組比較P<0.01；四川丹參組降低腦內(nèi)損傷區(qū)周圍bax的幅度最大、山東丹參組次之，河南丹參組降低的幅度最小，山東、河南丹參組與四川丹參組相比P<0.01，河南丹參組與山東丹參組相比P<0.05，見表2。免疫組化染色見圖3。

表2 各組Bax的IOD值

A：正常組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：四川丹參組；E：山東丹參組；F：河南丹參組

3 討 論 3.1 缺血性腦血管病與活血化瘀 缺血性腦血管病屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，對中風(fēng)病因病機(jī)的認(rèn)識,歷代醫(yī)家一般認(rèn)為不外乎與瘀、虛、火、風(fēng)、痰有關(guān)。其中瘀阻腦絡(luò)是卒中的病理基礎(chǔ)[1]，血蓄于腦是卒中病的病理中心，血瘀證候存在中風(fēng)病各證型和階段之中。所以，活血化瘀是治療中風(fēng)的基本治法。目前，活血化瘀藥多種制劑已廣泛應(yīng)用于臨床治療腦血管病[2]，且療效較為滿意，同時(shí)對活血化瘀藥治療卒中的機(jī)理研究也在不斷深入。

3.2 腦缺血再灌注與細(xì)胞凋亡 腦缺血再灌注(Cerebra ischemia and reperfusion，CIR)是指腦缺血一段時(shí)間后，再恢復(fù)其血液供應(yīng)的過程。多數(shù)研究表明，腦缺血再灌注后腦缺血性的損傷反而會(huì)加重。腦缺血再灌注后細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡并存，缺血中心區(qū)主要是細(xì)胞壞死，是不可逆的；而細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)在缺血灶周圍區(qū)即缺血半暗帶，是可逆的，因此，腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡已成為研究的熱點(diǎn)。

3.3 三個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參活性成分的研究 關(guān)于丹參藥材的道地產(chǎn)區(qū)，郭寶林等考證[3]歷史上河南、山東、湖北和山西等幾個(gè)省都曾被視為丹參的道地產(chǎn)區(qū)。近代以來,川產(chǎn)丹參被視為佳品,其在《中國道地藥材》中被列為道地藥材。總結(jié)以上文獻(xiàn)記載，丹參道地產(chǎn)區(qū)主要有四川、河南、山東、山西及湖北等5個(gè)產(chǎn)地。多數(shù)研究表明，不同產(chǎn)地丹參中丹參酮ⅡA、丹酚酸和丹參素等活性成分的含量差別較大。本研究所選用四川中江古店、山東沂南、河南方城三個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鑄云教授等[4-5]測定丹參酮ⅡA、丹酚酸和丹參素等活性成分的含量差別較大，與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似。

3.4 三個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對bcl-2、bax表達(dá)的影響 Bcl-2、bax是目前研究較多的一對凋亡調(diào)控基因。Bcl-2基因，即B細(xì)胞淋巴瘤-2基因(B cell lymphoma-2，Bcl-2)，該基因最初在血淋巴細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。近年來，多數(shù)研究也發(fā)現(xiàn)，bcl-2基因是抑制細(xì)胞凋亡的重要基因之一，它在腦缺血再灌注損傷中表達(dá)，而且起重要作用[6]。Bax是1993年在人前B細(xì)胞基因文庫發(fā)現(xiàn)的一種基因，其作用與bc1-2相反，可抑制bcl-2的功能。以往的研究也顯示[7-8]，局灶性腦缺血后，bax蛋白表達(dá)明顯增加，其能與bcl-2蛋白形成異源二聚體，從而抑制bcl-2的功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡?？梢?，Bcl-2和bax基因?qū)δX細(xì)胞凋亡起重要作用，Bcl-2和bax表達(dá)水平的高低與細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重性有直接關(guān)系。若bcl-2升高，則抑制細(xì)胞凋亡；而bax升高，則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

河南、山東、四川三個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物均能明顯提高bcl-2表達(dá)，降低bax表達(dá)，表明三產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物通過上調(diào)bcl-2、下調(diào)bax的表達(dá)而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而改善缺血再灌注損傷而發(fā)揮腦保護(hù)作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，三個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對bax和bcl-2表達(dá)的影響不同，對bax的表達(dá)，四川丹參組降低的幅度最大，山東丹參組次之，河南丹參組再次之；對bcl-2的表達(dá)，山東丹參組上調(diào)的幅度大于河南和四川丹參組，河南和四川丹參組無明顯差異。

綜上，三個(gè)道地產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物均能影響bcl-2、bax的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用；不同產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物對各指標(biāo)表達(dá)影響不同，其原因可能與不同產(chǎn)區(qū)丹參混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶點(diǎn)不一致有關(guān)。

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(收稿2016-06-18；修回2016-07-29)

*陜西省渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院課題(WZYY201322)

再灌注 丹參(中藥) 大鼠 腦缺血 細(xì)胞凋亡 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

R743

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.056

△通訊作者：成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(成都610072)