曹穩(wěn)根,段紅,翟科峰,徐禮生

?

野生豆腐柴葉總黃酮抗氧化活性研究

曹穩(wěn)根,段紅,翟科峰,徐禮生

豆腐柴葉；總黃酮；抗氧化活性

豆腐柴(PremnamicrophyllaTurcz)為馬鞭草科豆腐柴屬多年生落葉灌木植物，是一種具有營養(yǎng)價值和藥用價值的野生植物資源，多生于山坡、林下或林緣，主要分布于我國華東、華中、中南、西南各省區(qū)，我國野生資源十分豐富。豆腐柴葉蛋白含量高，必需氨基酸組分齊全，且富含維生素C(Vc)、β-胡蘿卜素、微量元素等各種營養(yǎng)物質(zhì)。鮮葉可制成葉豆腐生食或熟吃，其根、莖、葉入藥，具有活血散瘀、強(qiáng)筋健骨、驅(qū)風(fēng)止痛的功效，民間常用來治療腰腿痛、跌打損傷、風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及感冒身痛、淋巴節(jié)炎、肩周炎、肥大性脊椎炎等癥[1-3]。已有的研究表明, 豆腐柴主要含有黃酮類、萜類、酚酸及生物堿等有效成分[4-9]。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

豆腐柴葉于當(dāng)年7月采集于安徽省皖南地區(qū)，經(jīng)清水漂洗，室溫陰干，粉碎過100-120目篩后貯存于棕色試劑瓶中備用；AB-8大孔樹脂購自滄州寶思化工有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品檢定所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH自由基)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS+自由基)由美國Sigma公司提供；抗壞血酸由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

U-3310型紫外分光光度計，日本Hitachi公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海青浦瀘西儀器廠；HK-04A 200g型手提式粉碎機(jī)，廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；CHA-S氣浴恒溫振蕩器，蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.005 g置于小燒杯中，用75%乙醇溶解并定容至100mL容量瓶中即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別準(zhǔn)確移取上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL于7只50 mL容量瓶中，用75%乙醇補(bǔ)充至20.0 mL，加入5%的NaNO2溶液2.0 mL，搖勻，放置6 min 后，加入10%Al(NO3)3溶液2.0 mL，6 min 后再加入4%的NaOH溶液20.0 mL，搖勻后用75%乙醇定容至刻度，放置15 min，備用。在507 nm處測定溶液的吸光度，以蘆丁溶液的濃度x(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值y為縱坐標(biāo)，得回歸方程為 y=9.1964x-0.0013，R2=0.9964，總黃酮在0～0.012 mg/mL濃度范圍內(nèi)與其吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1.3.2 豆腐柴葉總黃酮粗提液的制備

準(zhǔn)確稱取過篩的豆腐柴葉粉末5g置于小燒杯中，用少量75%乙醇溶解后移至圓底燒瓶中。在料液比1∶30 (g/ mL) 、乙醇濃度75%的條件下，加熱回流提取1h，收集濾液。再用同樣方法回流提取1次，合并2次濾液。將收集好的濾液用石油醚萃取至濾液呈亮黃色為止。然后用濃縮定容于250 mL容量瓶中，即得豆腐柴葉總黃酮粗提液，保存于4℃冰箱，備用。

1.3.3 豆腐柴葉總黃酮純化液的制備

1.3.3.1 AB-8大孔樹脂的預(yù)處理見參考文獻(xiàn)[13]。

1.3.3.2 AB-8大孔樹脂分離純化液的制備。精密稱取處理過AB-8大孔樹脂2 g, 濕法裝入樹脂柱中，控制上樣液流速1 mL/min，加入豆腐柴葉總黃酮粗提液25 mL進(jìn)行動態(tài)吸附。待樹脂充分吸附飽和后，控制流速0.5 mL/min，用90%乙醇20 mL進(jìn)行解吸附。收集解吸液即為豆腐柴葉總黃酮純化液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，平行測定3次，根據(jù)回歸方程計算豆腐柴葉總黃酮純化液的質(zhì)量濃度。

1.3.4 豆腐柴葉總黃酮對DPPH·自由基的清除作用。參照文獻(xiàn)[14]修改如下：取5支具塞試管，各加0.1 mmol/L的DPPH溶液3mL，然后再分別加入不同質(zhì)量濃度豆腐柴葉總黃酮粗提液3mL，搖勻，靜置30 min。以無水乙醇調(diào)零，測定在517 nm處的吸光度Ai。同時測定3 mL無水乙醇和3mL不同質(zhì)量濃度豆腐柴葉總黃酮粗提液的混合液在517 nm處的吸光度Aj，以及測定3 mL無水乙醇和3 mL DPPH溶液的混合液在517 nm處的吸光度A0。按下式計算DPPH·清除率。再以相同質(zhì)量濃度豆腐柴葉總黃酮純化液和Vc做對照，計算清除率。

DPPH·自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.3.5 豆腐柴葉總黃酮對·OH自由基的清除作用。參照文獻(xiàn)[15]的方法。取7支具塞試管，分別加入0.75 mmoL/L的鄰二氮菲溶液1mL、pH7.4 的磷酸緩沖溶液(PBS)3.8 mL，充分混勻后，加入0.75 mmol/L 硫酸亞鐵溶液1.5 mL，每加一管立即混勻，然后向其中5管分別加入不同質(zhì)量濃度豆腐柴葉總黃酮粗提液1mL，混勻。另2支試管分別為損傷管與未損傷管，不加樣液。再分別加入0.01% 過氧化氫1mL，未損傷管不加過氧化氫，以蒸餾水補(bǔ)充體積至10.0 mL，于37 ℃水浴加熱30 min，在536nm處測定吸光值。按下式計算· OH自由基的清除率。再以相同質(zhì)量濃度豆腐柴葉總黃酮純化液和Vc做對照，計算· OH自由基的清除率。

· OH自由基清除率=

[ (A樣液-A損傷)/ (A未損傷-A損傷)]×100%

1.3.7 豆腐柴葉總黃酮對ABTS+自由基的清除作用。參照文獻(xiàn)[14]的方法。取6支具塞試管，其中5支試管分別加入不同質(zhì)量濃度的豆腐柴葉黃酮粗提液1mL、ABTS+工作液2mL，補(bǔ)水至5mL；另1支試管用不加粗提液用1mL蒸餾水替代。室溫避光放置20 min后，于734 nm處測定粗提液吸光度An，未加樣液吸光度A0。按下式計算ABTS+自由基的清除率。再以相同質(zhì)量濃度豆腐柴葉總黃酮純化液和Vc做對照，計算ABTS+自由基的清除率。

ABTS+自由基清除率=[(A0-An)/A0]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 豆腐柴葉總黃酮含量的測定

準(zhǔn)確移取稀釋的豆腐柴葉總黃酮粗提液2 mL于50 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，平行測定3次吸光度。根據(jù)回歸方程求得豆腐柴葉總黃酮粗提液質(zhì)量濃度為1.0175 mg/mL，總黃酮含量為5.088%。

2.2 豆腐柴葉總黃酮對DPPH·自由基的清除作用

DPPH·自由基是一種較穩(wěn)定的自由基，當(dāng)加入樣品后，若含有抗氧化物質(zhì)提供電子與DPPH·自由基配對使其顏色變淺，通過褪色程度就可以衡量清除活性的大小[14]。豆腐柴葉總黃酮粗提液、純化液及Vc對照液對DPPH·自由基的清除能力見圖1。從圖1可以看出，在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著溶液質(zhì)量濃度的不斷增大，豆腐柴葉總黃酮粗提液、純化液和Vc對照液對DPPH·自由基清除能力也逐漸增加，但豆腐柴葉總黃酮粗提液、純化液均強(qiáng)于Vc對照液。其中純化液對DPPH·自由基的清除能力顯著增加，說明純化液含有清除DPPH·自由基更多的成分。

圖1 豆腐柴葉總黃酮對DPPH·自由基的清除作用

2.3 豆腐柴葉總黃酮對·OH自由基的清除作用

· OH自由基是已知的最活潑的活性氧自由基，也是毒性最大的氧自由基。當(dāng)加入樣品后，若含有抗氧化物質(zhì)便會與鄰二氮菲競爭· OH，從而降低有色產(chǎn)物的生成量[15]。從圖2可以看出，豆腐柴葉總黃酮粗提液、純化液及Vc對照液對· OH自由基的清除能力隨其濃度的增大而增大，且豆腐柴葉總黃酮粗提液、純化液強(qiáng)于Vc對照液，純化液尤為顯著。

圖2 豆腐柴葉總黃酮對對· OH自由基的清除作用

圖3 豆腐柴葉總黃酮對·自由基的清除作用

2.5 豆腐柴葉總黃酮對ABTS+自由基的清除作用

ABTS+是一種經(jīng)氧化后形成的綠色自由基，當(dāng)加入樣品后，當(dāng)加入樣品后，若含有抗氧化物質(zhì)提供供氫體使其顏色變淺，其褪色程度與抗氧化劑濃度呈正相關(guān)[14]。不同質(zhì)量濃度豆腐柴葉總黃酮粗提液、純化液及Vc對照液對ABTS+自由基的清除能力見圖4。從圖4可以看出，豆腐柴葉總黃酮粗提液、純化液及Vc對照液對ABTS+自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)；豆腐柴葉總黃酮粗提液、純化液對ABTS+自由基的清除能力大于Vc對照液，而且豆腐柴葉總黃酮純化液尤為顯著。

圖4 豆腐柴葉總黃酮對ABTS+自由基的清除作用

3 結(jié)論

[1] 中國科學(xué)院植物所.中國高等植物圖鑒(第三冊)[M].北京：科學(xué)出版社，1985：589.

[2] 曹穩(wěn)根，蔡紅，高貴珍，等.野生豆腐柴營養(yǎng)成分分析[J].生物學(xué)雜志，2001，18(4)：23-24.

[3] 高貴珍，曹穩(wěn)根，蔡紅，等.野生豆腐柴葉營養(yǎng)成分分析及評價[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報，2003，12(1)：60-61.

[4] 李欽，沈月毛，李芹.思茅豆腐柴中的化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志，2008，43(6)：417-419.

[5] 張馳，吳永堯，彭振坤，等.豆腐柴中有效成分復(fù)合分離提取研究[J].食品科學(xué)，2005，12(8)：234-238.

[6] HU Zheng-xi，XUE Yong-bo，YAO Guang-min ,et al. Chemical constituents from the leaves ofPremnamicrophyllaTurcz[J]. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2013，22(5)：431-434.

[7] 林穎華，吳曉玲，彭榮珍，等.響應(yīng)面法優(yōu)化豆腐柴中總黃酮提取工藝[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，10(8)：116-118，134.

[8] 曹穩(wěn)根，段紅，翟科峰，等.正交設(shè)計優(yōu)選豆腐柴葉總黃酮的微波提取工藝[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2013，30(5)：2174-2178.

[9] 曹穩(wěn)根，段紅，翟科峰，等.超聲波法提取豆腐柴根總黃酮的工藝[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2014，31(1)：38-42.

[10] 黃巧燕，趙文英，戎晉華，等.加壓提取菊花中黃酮類成分及其抗氧化活性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2013，33(5)：83-87.

[11] 賈學(xué)靜，李樂，丁春邦，等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取成熟葉老鷹茶總黃酮及其抗氧化研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2014，34(3)：85-91.

[12] WANG Dong，TANG Wei，YANG Guang-ming，et al. Anti-inflammatory, Antioxidant and cytotoxic activities of flavonoids fromOxytropisfalcataBunge[J].Chinese Journal of Natural Medicines，2010，8(6)：461-465.

[13] 王海潮，翟科峰，曹穩(wěn)根，等.AB-8大孔樹脂對豆腐柴根提取物中總黃酮的吸附性能[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2012，29(2)：1272-1272.

[14] 李帥，胡繼榮，劉軍軍，等.X-5大孔吸附樹脂分離純化黑柴胡黃酮及抗氧化性研究[J].化學(xué)與生物工程，2013，30(9)：39～43.

[15] 謝曉鳳，童蓮花，童德勝，等.馬齒莧總黃酮的提取及其濃縮汁抗氧化性研究[J].食品工業(yè)，2013，38(2)：192-197.

[16] 侯學(xué)敏，李林霞，張直峰，等.響應(yīng)面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2013，34(6)：124-128.

責(zé)任編輯：劉海濤

Antioxidant Activity of Total Flavonoids fromWildPremnamicrophyllaTurcz Leaves

Cao Wengen, Duan Hong, Zhai Kefeng, Xu Lisheng

The crude and purified product of total flavonoids fromPremnamicrophyllaTurcz Leaves were obtained respectively on the basis of reflu technology and macroporous resin AB-8 dynamic adsorption and desorption technology, the antioxidant activity of total flavonoids fromPremnamicrophyllaTurcz Leaves was evaluated. The results indicated that the scavenging activity of the crude and purified product of total flavonoids fromPremnamicrophyllaTurcz Leaves to DPPH·,· OH,O2-· and ABTS+increased with the increasing of concentrations of total flavonoids fromPremnamicrophyllaTurcz Leaves. Under the same concentration, the scavenging activity of the crude and purified product of total flavonoids fromPremnamicrophyllaTurcz Leaves against the radicals was in the order to DPPH·>ABTS+> O2-·>· OH, and the purified product had better antioxidant activity than the crude product. Total flavonoids from wildPremnamicrophyllaTurcz Leaves had strong antioxidant activities in vitro.

PremnamicrophyllaTurcz Leaves; total flavonoids; antioxidant activity

TQ35;R284.2

A

1673-1794(2016)05-0040-04

曹穩(wěn)根，宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院教授，主要從事生物化學(xué)及天然產(chǎn)物化學(xué)研究；段紅,翟科峰,徐禮生，宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院(安徽 宿州234000)。

安徽省高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項目(KJ2012A264)

2016-03-09