田允鴻，曾 星，邱慧芝，史建軍，謝國豐，黃東蘭，王紅梅，鄭榮輝，張偉軍

(廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科一區(qū)，廣州 510515)

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結合黏附分子家族A表達水平與鼻咽癌細胞株放療敏感性的關系研究*

田允鴻，曾 星，邱慧芝，史建軍，謝國豐，黃東蘭，王紅梅，鄭榮輝，張偉軍△

(廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科一區(qū)，廣州 510515)

目的 研究結合黏附分子家族A(JAMA)表達水平與鼻咽癌細胞株放療敏感性的關系。方法 過表達或干擾CNE2和HONE1細胞株中JAMA的表達，然后采用不同劑量X射線進行照射，24 h后檢測細胞克隆形成能力及細胞凋亡變化，了解JAMA在鼻咽癌放療中的作用。通過Western blot檢測JAMA不同表達水平細胞株放療后的相關信號通路蛋白。結果 JAMA低表達細胞株對放療更敏感：JAMA低表達后，D0值在CNE2細胞株中從3.26±0.78下降為1.92±0.23；Dq值從46.51±4.27下降至32.12±3.19。放療誘導的凋亡在JAMA低表達細胞株中顯著增加，JAMA低表達后，細胞凋亡率從6.9%±0.9%上升至13.7%±1.3%；HONE1細胞凋亡率從6.5%±1.1%上升至12.3%±1.7%；JAMA過表達細胞株中顯著減少。結論 JAMA表達水平與鼻咽癌細胞株放療敏感性密切相關，JAMA能增加鼻咽癌細胞株放療抵抗。

結合黏附分子家族A；鼻咽腫瘤；放療敏感性

鼻咽癌是發(fā)生于鼻咽黏膜的惡性腫瘤，其惡性程度較高，轉移能力強，早期易發(fā)生淋巴結和遠處轉移，并具有相當高的病死率。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，80%的鼻咽癌發(fā)生于中國，尤其高發(fā)于廣東地區(qū)[1]。近年來分子生物學的發(fā)展和放療技術的進步使鼻咽癌治療效果得到了較大的提高，但鼻咽癌的治療抵抗以及復發(fā)仍是影響患者生存的重大障礙[2]。因此，了解鼻咽癌治療抵抗及復發(fā)機制，尋找可靠的治療靶標有極其重要的意義。結合黏附分子家族A(Junctional adhesion molecule A，JAMA)是位于細胞間的跨膜緊密連接蛋白，它在細胞的侵襲、血小板聚集和淋巴細胞黏附等方面起重要作用[3]。大量研究顯示，JAMA與乳腺癌患者的不良預后密切相關，并能促進細胞增殖及細胞株上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)[4]。因此，本試驗欲研究JAMA表達水平與鼻咽癌細胞株放療敏感性的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) CNE2和HONE1細胞株由南方醫(yī)科大學腫瘤研究所保存。CNE2和HONE1用含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱貼壁培養(yǎng)處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞，用0.05%胰酶消化傳代，取指數(shù)生長期細胞進行試驗。

1.2 過表達質粒構建 具體構建步驟見文獻[4]，簡單步驟如下：(1)從CNE2細胞株基因組中克隆得到完整的目的基因(JAMA CDS區(qū))；(2)按TIANGEN試劑盒DP103說明完成pWPI質粒提取，并用PacI和PmeI雙酶切JAMA及質粒；(3)酶切后片段及質粒采用T4連接酶體系進行連接；(4)質粒轉化及擴增并進行測序驗證。

1.3 過表達質?；騭iRNA瞬時轉染試驗(24孔板) (1)轉染前1 d，胰酶消化細胞并計數(shù)，細胞鋪板在不含抗生素，含血清的培養(yǎng)基中。使其能在轉染日達到80%～90%；(2)對于每孔細胞，使用50 μL無血清Opti-MEM?培養(yǎng)基稀釋shRNA(shRNA 300～600 ng,shRNA CGU ACG CGG AAU ACU UCG A)[4]，輕輕混勻；(3)使用前將Lipo2000轉染試劑輕輕混勻，每孔細胞用50 μL無血清Opti-MEM?培養(yǎng)基稀釋1 μL LipoTM2000轉染試劑，室溫孵育5 min；(4)混合稀釋的質粒和稀釋的LipoTM2000，此時體積是100 μL，輕輕混勻，室溫放置20 min以使shRNA- LipoTM2000復合物形成；(5)將24孔板中的舊營養(yǎng)液吸出，用無血清培養(yǎng)基清洗2次。加入0.5 mL無血清Opti-MEM?培養(yǎng)基；(6)逐滴加入100 μL 質粒-LipoTM2000復合物到每孔中，邊加邊前后來回搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻；(7)在37 ℃，5%CO2中孵育24～48 h更換培養(yǎng)基。

1.4 平板克隆形成試驗 收集貼壁培養(yǎng)細胞制成單細胞懸液，重懸于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，然后計數(shù)，等比稀釋成不同濃度的細胞。細胞按預定數(shù)量接種于6孔板：設0、2、4、6 Gy和8 Gy 5個劑量組，各劑量組設3個復孔。細胞接種后置于培養(yǎng)箱孵育3 h后按不同劑量組照射。靜置培養(yǎng)14 d后，終止培養(yǎng)并以PBS緩沖液洗滌細胞2次，每孔加入1.5 mL甲醇固定細胞10 min；PBS清洗2次，每孔加入1 mL 1%的結晶紫染色后，在顯微鏡下計算細胞大于50個克隆數(shù)。按公式計算：克隆形成率=生成的克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%；存活分數(shù)(survival fraction，SF)=受照射細胞的克隆形成率/對照組細胞克隆形成率×100%。對所得的SF平均數(shù)進行分析,運用GraphPad Prism 5.0軟件進行單擊多靶模型曲線擬合，并根據(jù)單擊多靶模型求出D0、Dq及N值。

1.5 凋亡檢測 Caspase-3活性檢測：胰酶消化貼壁細胞，離心收集細胞，小心吸除上清液，同時確保沒有細胞被吸除，PBS洗滌1次后收集細胞加入裂解液(2×106/100 μL)，冰浴裂解15 min。參照碧云天Caspase-3檢測試劑盒說明進行進一步的檢測。流式細胞儀檢測凋亡：加入適量胰酶細胞消化液消化收集細胞。用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。取5×104重懸的細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入195 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。然后再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。 室溫避光孵育10 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入190 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入10 μL碘化丙啶染色液輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細胞儀檢測。

1.6 細胞照射 采用Varian 2100C直線加速器6 MV X線為放射源，固定源皮距照射，劑量率300 MU/min，SSD=100 cm，PDD=80%，照射野10 cm×10 cm。

1.7 Western blot檢測Akt信號通路 細胞轉染JAMA-shRNA和Scramble后培養(yǎng)24 h，采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白(南京凱基)，Bradford法測定蛋白質濃度。制備好SDS-PAGE膠，每孔上樣30 μg蛋白，進行SDS-PAGE電泳。壓縮膠電壓設定為60 V，30 min；分離膠電壓設定為120 V，1 h。電泳完畢，根據(jù)Marker指示切下目的蛋白所在位置凝膠(60×103)，然后轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉/TBST封閉PVDF膜1 h。封閉完畢，用TBST洗滌3次，每次5 min。p-Akt抗體和Akt一抗分別與靶蛋白結合。二抗與一抗結合：用1%脫脂奶粉/TBST稀釋二抗(1∶1 000)，與PVDF膜孵育1 h，室溫輕搖。TBST洗滌3次，每次5 min。再用TBS洗滌5 min。顯影(ECL法)：ECL A液250 μL+B液250 μL，高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)下成像拍照。用Image J對Western blot檢測結果進行灰度分析。

2 結 果

2.1 平板克隆試驗結果 試驗結果顯示(圖1)，JAMA表達降低后，CNE2細胞株D0值從3.26±0.78下降為1.92±0.23；Dq值從對照組的46.51±4.27下降至JAMA低表達組的32.12±3.19；與CNE2結果相一致的是，HONE1細胞株中JAMA表達降低后，反映細胞對放射損傷敏感度的參數(shù)D0從6.30±1.01下降至2.17±0.19；反映細胞亞損傷修復能力大小的Dq值同樣顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A:CNE2細胞株；B:HONE1細胞株。

圖1 克隆形成試驗結果

A、B：Caspase-3活性檢測，細胞轉染JAMA-shRNA 和JAMA-pWPI質粒24 h后行X射線照射，24 h后檢測CNE2(A)和HONE1(B)細胞株中Caspase-3活性；C、D：流式細胞儀檢測細胞株轉染JAMA-shRNA和JAMA-pWPI質粒后，CNE2(C)和HONE1(D)細胞株放療后凋亡情況；*：P<0.05，**：P<0.01。

圖2 凋亡檢測結果

2.2 凋亡檢測結果 如圖2A和2B結果顯示，在JAMA低表達細胞株中Caspase-3活性顯著升高，反之，在JAMA高表達細胞株中活性顯著減低：CNE2細胞株接受2 Gy射線照射后，Caspase-3活性在JAMA低表達組上升了約29%，JAMA高表達組下降了約31%；HONE1接受2 Gy射線照射后，Caspase-3活性在JAMA低表達組上升了約17%,JAMA過表達后Caspase-3活性顯著降低約20%。結果提示射線照射后，JAMA-shRNA組鼻咽癌細胞株凋亡更明顯。進一步采用流式細胞儀分析放療后，JAMA不同表達水平細胞株凋亡情況。如圖2C和2D結果所示，JAMA低表達組中，細胞凋亡顯著增加：CNE2細胞株接受2 Gy照射后，細胞凋亡從對照組的8.9%±1.0%上升至JAMA低表達組的12.7%±1.3%；HONE1接受2 Gy照射后，細胞凋亡從對照組的7.8%±0.9%上升至11.6%±0.6%，過表達JAMA后，HONE1細胞接受2 Gy放療后細胞凋亡下降至5.9%±0.8%?？傊?，JAMA低表達組細胞接受射線照射后凋亡顯著增加，反之，JAMA過表達細胞株接受射線照射后細胞凋亡顯著減少。

2.3 Western blot檢測Akt信號通路 Western blot檢測結果顯示，在JAMA低表達細胞株中，總Akt變化并不明顯，p-Akt蛋白表達量卻顯著減低(圖3A和B)。 然而ERK信號通路在JAMA不同表達水平細胞株中，放療后并沒有顯著差異(圖3C)。

A：Western blot檢測CNE2細胞株轉染JAMA-shRNA并行射線照射后相關信號通路結果；B、C：使用Image J對Western blot檢測結果進行灰度分析。**：P<0.01，與Scramble組比較。

圖3 Western blot檢測相關信號通路

3 討 論

鼻咽癌是我國廣東地區(qū)高發(fā)的惡性腫瘤，其遠處轉移率及病死率均較高。放療是鼻咽癌最重要的治療手段之一，盡管放療手段有了較大的進步，但是放療抵抗仍然是治療失敗的重要原因之一[1,5]。因此，研究鼻咽癌細胞放療抵抗機制顯得尤為重要。既往研究顯示，JAMA能影響乳腺癌及小腸內皮細胞功能，但是JAMA在鼻咽癌放療敏感性方面的研究鮮有報道。筆者研究了JAMA表達水平與鼻咽癌細胞株放療敏感性的關系，發(fā)現(xiàn)JAMA與鼻咽癌細胞株放療敏感性密切相關，JAMA能增加鼻咽癌放療抵抗，這種作用是通過Akt信號通路起作用的。

JAMA與多種腫瘤預后及治療效果密切相關。Mcsherry等[6]采用組織芯片技術發(fā)現(xiàn)JAMA高表達的乳腺癌患者預后相對較差，作者以高表達JAMA的乳腺癌細胞株MCF-7為研究對象，結果顯示JAMA能增加β1整合素表達而增加乳腺癌細胞的侵襲能力[7-8]。進一步研究結果顯示，JAMA與HER2共表達，降低JAMA表達能減少HER2和ER受體表達[9]。另外有研究證實JAMA能影響正常小腸內皮細胞增殖，影響與細胞黏附功能密切相關的E-cadherin等表達[10-11]。更重要的是有研究顯示JAMA能誘導鼻咽癌CNE2和HONE1細胞株EMT的發(fā)生。來自172例鼻咽癌患者的組織標本顯示，高表達JAMA與遠處轉移和不良預后密切相關[4]?？傊?，JAMA高表達與患者不良預后密切相關。本研究結果證實，JAMA能增加鼻咽癌細胞株放療抵抗，這可能是JAMA高表達患者預后不良的另一重要原因。

Akt信號通路與許多腫瘤基因及多種信號受體相關，是腫瘤中經(jīng)常被激活的通路，并在腫瘤發(fā)生機制研究及腫瘤治療中扮演了重要角色[12]。大量研究顯示Akt通路的激活在腫瘤細胞侵襲中起了重要作用[13]。既往研究顯示，JAMA蛋白能通過激活細胞中小分子G蛋白Ras超家族成員-1(Ras-proximate-1，Rap1)調節(jié)細胞對外界刺激的反應并影響與細胞黏附功能密切相關的E-cadherin蛋白表達[11]。Kortholt等[13]研究了Rap1與PI3K信號通路的關系，結果證實Rap1能直接結合至PI3K的Ras結合區(qū)域，增加PIP3表達水平[14]。NAVA等[10]證實JAMA能通過抑制Akt/β-catenin信號通路活性影響正常小腸內皮細胞增殖?？傊?，這些研究結果間接證實了JAMA可能通過Akt信號通路起作用。筆者通過試驗發(fā)現(xiàn)，JAMA能通過Akt信號通路增強鼻咽癌細胞的放療抵抗。

綜上所述，本試驗證實了JAMA能增加鼻咽癌細胞株放療抵抗，初步的機制研究結果顯示，這種機制與Akt信號密切相關。盡管需要通過回復Akt以及過表達JAMA等方法，進一步研究其放療增敏機制，但是這樣的結果已經(jīng)給了研究人員一個很重要的提示。這為鼻咽癌放療抵抗機制的研究提供了一點基礎，為鼻咽放療增敏提供了新的可行的方向。

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Study on relation between junctional adhesion molecule family A expression level and radiosensitivity of nasopharyngeal carcinoma cell line*

TianYunhong,ZengXing,QiuHuizhi,ShiJianjun,XieGuofeng,HuangDonglan,WangHongmei,ZhengRonghui,ZhangWeijun△

(FirstWards,DepartmentofRadiotherapy,AffiliatedTumorHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Objective The radiotherapy resistance is one of important causes for nasopharyngeal carcinoma(NPC)treatment failure.Junctional adhesion molecule A(JAMA)is closely correlated with the tumor poor prognosis.Thus this experiment is to investigate the relationship between JAMA expression and the radiosensitivity of NPC.Methods To overexpress or interfere the JAMA expression in CNE2 and HONE1 cell lines.Then different doses of X-ray were adopted to conduct irradiation.The cell clone formation capacity and cellular apoptosis change were detected after 24 h.The role of JAMA in the NPC radiotherapy was understand.The related signal pathway protein in cell lines with different JAMA expression was detected by Western blot.Results The cell lines with low JAMA expression were more sensitive to radiotherapy:After low JAMA expression,the D0 value in the CNE2 cell line was decreased from 3.26±0.78 to 1.92±0.23;the Dq value was decreased from 46.51±4.27 to 32.12±3.19.The radiotherapy induced apoptosis was significantly increased in the cell lines with low JAMA expression,after low JAMA expressing,thcellular apoptosis was elevated from 6.9%±0.9% to 13.7%±1.3%;the HONE1 cellular apoptosis was elevated from 6.5%±1.1% to 12.3%±1.7%;JAMA overexpression cell lines were significantly decreased.The preliminary mechanism research results showed that JAMA played the effect via Akt signal pathway. Conclusion This research results verifiy that JAMA expression level is closely correlated with the radiosensitivity of NPC cell line:JAMA can increase the radiotherapy resistance of NPC cell lines,which provides a new feasible research direction for NPC enhancing radiosensitivity.

junctional adhesion molecule A；nasopharyngeal neoplasms；radiosensitivity

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.003

國家自然科學基金資助項目(81502342)；廣州醫(yī)科大學博士啟動基金(2014C45)。 作者簡介：田允鴻(1984-)，博士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤侵襲和轉移機制、EMT、microRNA方面的研究?！?/p>

R739.6

A

1671-8348(2016)33-4616-03

2016-03-28

2016-05-12)