黃 媛，褚文珂，謝蔚鵬，陳 敏

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州310036)

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杭州西溪濕地沉積物中不同培養(yǎng)基分離的細菌種群多樣性

黃 媛，褚文珂，謝蔚鵬，陳 敏

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州310036)

以西溪濕地沉積物的細菌群落為對象，對4種不同培養(yǎng)基(M1、R2A、NB和DNB)分離細菌的能力及分離物的種群多樣性進行了比較研究.共分離得到191株菌株，經(jīng)16S rRNA基因測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，可歸于13個不同的屬，其中R2A培養(yǎng)基分離的細菌種類最多，共有11個不同的屬，其次是NB培養(yǎng)基，分離得到8個屬，M1和DNB培養(yǎng)基均分離得到7個屬.優(yōu)勢種屬為根瘤菌屬(Rhizobium)，占總數(shù)的39.27%.研究結(jié)果表明，R2A培養(yǎng)基分離的培養(yǎng)物種群多樣性更為豐富.

西溪濕地；沉積物；培養(yǎng)基；細菌多樣性

濕地生態(tài)系統(tǒng)中，沉積物是一個由各種微生物參與的、物質(zhì)發(fā)生頻繁交換的、具有高度生物活性的特殊生境，其中微生物的多樣性對整個水體系統(tǒng)有重要影響.與水體中的懸浮微生物比較，沉積物微生物往往在單位數(shù)量和功能多樣性上更勝一籌，因此，對水體生態(tài)系統(tǒng)平衡的重要性也更大.目前，沉積物微生物正受到越來越多研究者的關(guān)注.

杭州西溪國家濕地公園坐落于杭州市區(qū)的西部，是在自然濕地基礎(chǔ)上經(jīng)一千多年農(nóng)漁耕作用形成的罕見的城中次生濕地，其中河港、池塘、沼澤等水域約占濕地面積的70%.近20多年來，隨著經(jīng)濟和社會的發(fā)展，西溪濕地的面積由60 km2萎縮至不足12 km2，并且人類活動的干擾日趨頻繁，對濕地的生態(tài)系統(tǒng)造成了影響[1-2].本研究以西溪濕地不同生境下的表層沉積物為研究對象，通過設(shè)計不同的培養(yǎng)基，用純培養(yǎng)的方法研究沉積物中細菌的群落特征和多樣性，以期為豐富西溪濕地生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)涵，開發(fā)西溪濕地的微生物資源，進而為西溪濕地的保護和修復(fù)提供理論和實踐依據(jù).

1 材料與方法

1.1 采 樣

選擇了濕地內(nèi)6種典型的水域生境：1)挺水植物區(qū)(蒲葦，白茅等)；2)浮水植物區(qū)(睡蓮，鳳眼蓮等)；3)沉水植物區(qū)(金魚藻，狐尾藻等)；4)濕生植物區(qū)(美人蕉，黃菖蒲等)；5)開闊的河道(岸邊有雜草樹木)；6)野生養(yǎng)殖塘(水草、雜草叢生).采集上述6類生境的表層(0～10 cm)沉積物，每個樣品由采樣點中心及周圍共5個點的土樣混合而成.樣品編為1～6號，采集完成后迅速放入無菌保鮮袋，4 ℃保存,帶回實驗室立即用于菌株分離.

1.2 培養(yǎng)基

M1培養(yǎng)基：蛋白胨0.1 g，可溶性淀粉0.25 g，酵母浸粉0.05 g，甘油磷酸鈉0.01 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L.

R2A培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.25 g，酸水解酪蛋白0.5 g，酵母浸粉0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，K2HPO30.3 g，MgSO40.1 g，葡萄糖0.5 g，丙酮酸鈉0.3 g，蛋白胨0.25 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L.

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(以下簡稱NB)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L.

稀釋100倍牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(以下簡稱DNB)：牛肉膏0.03 g,蛋白胨0.1 g，NaCl 0.05 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L.

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L.

1.3 菌株的分離純化

稱取10 g沉積物樣品放入盛有90 mL滅菌生理鹽水的錐形瓶(含玻璃珠)中振蕩20 min，靜置后取液體進行梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6稀釋液0.1 mL，分別涂布于M1、R2A、NB及DNB培養(yǎng)基平板上，用保鮮膜包好倒置于28 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5～7 d，待平板上長出單菌落后，挑取單菌落反復(fù)劃線分離至獲得純化菌株，試管斜面4 ℃保藏.

1.4 細菌DNA的提取

采用上海生工生物工程公司生產(chǎn)的細菌基因組DNA快速抽提試劑盒進行菌體DNA的抽提，步驟如下：1.5 mL離心管中加入1 mL過夜培養(yǎng)的菌液，室溫8 000 r/min離心1 min，移去上清，收集菌體.取400 μL裂解液加入菌體沉淀中，搖勻后置于泡沫板上在65 ℃水浴鍋中水浴1 h，水浴過程每隔10 min觀察一次直至裂解完全.裂解完成后，加入PB溶液200 μL，將離心管反復(fù)顛倒使液體混勻，離心管置于-20 ℃冰箱.5 min后取出離心管，室溫10 000 r/min離心5 min，將盡可能多的上清液取出置于干凈離心管.加一倍體積的異丙醇后上下顛倒離心管10次，混勻后室溫放置3 min，室溫10 000 r/min離心5 min，棄上清.加入75%乙醇1 mL，漂洗3 min，漂洗過程中要讓沉淀漂浮起來，10 000 r/min離心2 min，棄上清.重復(fù)漂洗2次，室溫晾干至乙醇完全揮發(fā).TE Buffer溶解所得DNA，低溫保存.

1.5 16S rRNA基因擴增

采用細菌通用引物進行PCR擴增，引物序列如下：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR擴增體系為25 μL：ddH2O 15 μL；10×buffer 2.5 μL；dNTP(25 mmol/L)4.0 μL；27F(25 pmol/μL)0.5 μL；1492R(25 pmol/μL) 0.5 μL；Taq DNA polymerase 0.5 μL；DNA template 2.0 μL.PCR擴增條件為：95 ℃ 90 s；95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 5個循環(huán)；95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 5個循環(huán)；95 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 25個循環(huán)；72 ℃ 10 min, 60 ℃ 10 min.擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，穩(wěn)定電壓130 V，20 min后根據(jù)電泳條帶結(jié)果，將合適條帶的擴增產(chǎn)物送往上海英俊生物公司測序.

1.6 系統(tǒng)發(fā)育及多樣性分析

通過PCR擴增及測序后，將得到的基因序列提交到RDP(http://rdp.cme.msu.edu/)，利用Classifier選項進行序列比對，得到各個菌株的分類學(xué)地位.利用Sequence 5.4.1軟件，對獲得的16S rRNA基因序列進行分類(序列完全相同的暫視為同一株)，取代表菌株在GenBank中進行Blastn比對，查找相似度較高的模式菌株.

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離和純化

實驗共設(shè)計了4種不同類型培養(yǎng)基對6個沉積物樣品進行平板分離培養(yǎng)，根據(jù)菌落的顏色、大小、形態(tài)等特征，從各個平板上挑取不同的單菌落，共得到191株細菌菌株(表1).從4種不同培養(yǎng)基的分離效果來看，NB培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)量最多，共61株，其次是R2A培養(yǎng)基53株，M1培養(yǎng)基分離得到的細菌數(shù)量最少，為31株.從6個不同樣品來看，1號樣品分離得到細菌數(shù)量最多，為41株，其次是2號樣品33株，5號樣品分離得到的細菌數(shù)量最少，只有26株.

表1 細菌分離結(jié)果

2.2 分離物的多樣性分析

本次分離得到的191株細菌分屬于13個屬(表2)，根據(jù)每個種屬所含有的細菌數(shù)量來看，優(yōu)勢菌群為根瘤菌屬(Rhizobium)，占總菌數(shù)的39.27%；其次是假單胞桿菌屬(Pseudomonas)，占總菌數(shù)26.70%；微球菌屬(Micrococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、貪嗜菌屬(Variovorax)、羅氏菌屬(Rothia)及賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)均只分離得到1株細菌.此外，4種不同培養(yǎng)基分離得到的細菌種類以R2A培養(yǎng)基最多，有11個不同的屬，其次是NB培養(yǎng)基8個屬，M1培養(yǎng)基和DNB培養(yǎng)基都是7個屬.

表2 細菌的種屬分布

2.3 分離物的系統(tǒng)發(fā)育分析

分離物的16S rRNA基因序列相似性及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如表3所示.結(jié)果顯示，根瘤菌屬(Rhizobium)共有Rhizobiumpusense和Rhizobiumrosettiformans2個不同的種.其中與R.pusense相似的菌株共71株，同源性為99.4%～99.8%；與R.rosettiformans相似的菌株較少，僅4株，同源性為100%.

假單胞菌屬(Pseudomonas)的細菌種類最豐富，分別屬于Pseudomonasstutzeri、Pseudomonasplecoglossicida、Pseudomonashunanensis、Pseudomonastoyotomiensis、Pseudomonaschengduensis和Pseudomonasalcaligenes6個不同的種.其中與P.stutzeri相似的有20株，同源性為99.8%～100%；與P.plecoglossicida相似的有19株，同源性為99.7%～99.8%；與P.hunanensis相似的有9株，同源性為99.2%～99.9%.與P.toyotomiensis、P.chengduensis及P.alcaligenes相似的各有一株，同源性分別為99.4%、99.5%及99.8%.

芽孢桿菌屬(Bacillus)的細菌屬于4個不同的種，分別是Bacillussiamensis4株，同源性99.8%～99.9%；Bacillussubtilis和Bacillusaryabhattai各1株，同源性分別為99.9%和100%；Bacillusmethylotrophicus有2株，同源性99.8%～100%.

短波單胞菌屬(Brevundimonas)的細菌分屬3個不同的種：Brevundimonasdiminuta2株，同源性99.4%～99.7%；Brevundimonasintermedia和Brevundimonasvesicularis各1株，同源性分別為99.8%及99.3%.

蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)的細菌共有18株，均屬于Ochrobactrumanthropi，同源性為99.9%～100%.氣單胞菌屬(Aeromonas)的細菌有14株，均屬于Aeromonashydrophila，同源性為99.9%～100%.劍菌屬(Ensifer)的細菌有10株，均屬于Ensiferadhaerens，同源性為99.5%～99.8%.腸桿菌屬(Enterobacter)的細菌有6株，均屬于Enterobacteraerogenes，同源性均為99.0%.

不動桿菌屬(Acinetobacter)、貪嗜菌屬(Variovorax)、羅氏菌屬(Rothia)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)及微球菌屬(Micrococcus)的細菌各有1株，分別屬于Acinetobacterjohnsonii、Variovoraxginsengisoli、Rothiaterrae、Lysinibacillusfusiformis及Micrococcusendophyticus，同源性分別為99.1%、98.6%、97.6%、99.7%及99.8%.

表3 分離物的測序比對結(jié)果

續(xù)表3

3 討 論

微生物純培養(yǎng)技術(shù)通過采用成分各異的培養(yǎng)基可以對不同的微生物進行分離培養(yǎng)[3-4].這種方法最大的優(yōu)勢在于可以獲得微生物的純培養(yǎng)物，是研究、開發(fā)和利用微生物資源的前提，也不失為研究微生物種群多樣性的一類方法[5].劉玉娟等[6]通過純培養(yǎng)對中國南海海域20個沉積物樣品進行了細菌多樣性分析，獲得了200株細菌，分屬于47個屬，99個種；戴欣等[7]通過改良基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對太湖沉積物可培養(yǎng)細菌多樣性進行了研究，發(fā)現(xiàn)稀釋培養(yǎng)基上細菌的生長數(shù)量比普通培養(yǎng)基上高3～5倍.田曉燕等[8]通過純培養(yǎng)方法從人工濕地中得到9種菌株，分別為嚴(yán)格好氧菌和兼性厭氧菌，都具有很強的有機物降解能力.

由于微生物生存環(huán)境復(fù)雜，人工培養(yǎng)環(huán)境與原生境的偏差，環(huán)境樣品中可培養(yǎng)微生物的數(shù)量仍然非常有限[9].近年來，在改進和開發(fā)新型培養(yǎng)技術(shù)等方面，國內(nèi)外學(xué)者展開了較廣泛的研究工作.據(jù)報道，提高微生物的可培養(yǎng)性可以從改變培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件[10-12]、添加相關(guān)的信號物質(zhì)[13]、降低培養(yǎng)基營養(yǎng)成分濃度[14-15]、延長培養(yǎng)時間以及采用多種培養(yǎng)基組合[16]等方面進行改進.本研究采用4種不同培養(yǎng)基分離濕地沉積物樣品中的細菌，結(jié)果表明，NB培養(yǎng)基分離得到的細菌數(shù)量最高，且細菌種類也較多，仍是分離培養(yǎng)細菌的最常規(guī)培養(yǎng)基之一.R2A培養(yǎng)基上分離的細菌種類是最多的，甚至分離到了NB培養(yǎng)基上不能生長的3個屬：不動桿菌屬、貪嗜菌屬和羅氏菌屬，可作為沉積物樣品細菌分離的較適用的一種培養(yǎng)基.而DNB及M1培養(yǎng)基無論是分離的細菌數(shù)量還是種類均較低.這些差異的出現(xiàn)主要與培養(yǎng)基中所含不同的營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，例如，與經(jīng)典的NB培養(yǎng)基相比較，R2A培養(yǎng)基中添加了酸水解酪蛋白及丙酮酸鈉.據(jù)報道，丙酮酸鈉經(jīng)三羧酸循環(huán)后產(chǎn)生的NADH和H+可與超氧化物結(jié)合，從而減少超氧化物對細胞的損害[17]；酸水解酪蛋白是天然牛奶蛋白經(jīng)酸水解等過程處理后的產(chǎn)物，含有18種游離氨基酸，可被微生物直接利用[18].此外，R2A是一類低營養(yǎng)濃度的培養(yǎng)基，有利于把那些在菌群之間處于劣勢的微生物以及只能形成微小菌落或生長緩慢的類群分離出來[19].總之，應(yīng)根據(jù)研究目的和樣品的不同來源等選擇合適的培養(yǎng)基，并采取多種培養(yǎng)基結(jié)合使用的方法來提高分離物的多樣性，獲得較全面的數(shù)據(jù).

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Biodiversity of Bacterial Isolates on Four Different Culture Medias from Xixi Wetland

HUANG Yuan, CHU Wenke, XIE Weipeng, CHEN Min

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

A total of 191 bacteria strains were isolated from the sediment samples collected from Xixi wetland by culture-dependent method based on four different medias (M1、R2A、NB and DNB). The phylogenetic analyses data of 16S rRNA gene sequencing revealed 13 genera, of which there were 11 genera related bacteria were isolated from R2A media, 8 genera from NB media, 7 genera from M1 and DNB media respectively. The dominant group was genusRhizobium，which accounted for 39.27% of total sequences. So R2A may be recommended to be used for a non-selective media for isolating more diversified bacteria from sediment samples.

Xixi wetland; sediment; culture media; bacterial diversity

2016-05-20

浙江省自然科學(xué)基金項目(Y307452).

陳 敏(1963—)，女，教授，主要從事環(huán)境微生物研究.E-mail:mchen63@163.com

10.3969/j.issn.1674-232X.2016.06.008

Q938

A

1674-232X(2016)06-0600-06