張 曼，潘廣林，梁武龍，王 華，李 然，張 瑞，柴 佳，葉 超，張耀相，劉再超

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程學(xué)院，陜西楊凌 712100;2.陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)中心，陜西周至 710402;3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100;4.北京市順義區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，北京 101300)

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秦嶺大熊貓腸道益生菌的分離鑒定

張 曼1，潘廣林2，梁武龍3，王 華3，李 然3，張 瑞3，柴 佳3，葉 超3，張耀相3，劉再超4*

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物工程學(xué)院，陜西楊凌 712100;2.陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)中心，陜西周至 710402;3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100;4.北京市順義區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，北京 101300)

為研究大熊貓腸道益生菌，從陜西省珍稀野生動(dòng)物搶救飼養(yǎng)中心無菌采集健康大熊貓新鮮糞便數(shù)份，通過微生物學(xué)方法分離大熊貓腸道益生菌并進(jìn)行鑒定。結(jié)果從糞便中分離到3株革蘭陽性桿菌和2株革蘭陽性球菌，經(jīng)生物學(xué)特性、生化試驗(yàn)鑒定，3株革蘭陽性桿菌分別為蠟樣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌和凝結(jié)芽胞桿菌，2株革蘭陽性球菌分別為酵母菌和糞鏈球菌。用5株分離菌分別給小鼠腹腔注射0.2mL或灌胃0.5mL，家兔先腹腔注射2mL再灌胃5mL，隔離飼養(yǎng)72h，小鼠和家兔均未發(fā)病，表明分離菌均為益生菌，可用于大熊貓益生菌制劑的后續(xù)研究。

大熊貓；糞便；益生菌；分離鑒定

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)是食肉目大熊貓科的一種哺乳動(dòng)物，為我國(guó)特有的國(guó)家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物，主要生活在我國(guó)四川、陜西和甘肅的山區(qū)。目前野生大熊貓不足1600只，屬于珍稀瀕危動(dòng)物之一。大熊貓最初為肉食性動(dòng)物，經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化與自然選擇，現(xiàn)在雖然其食物主要為竹子，但其牙齒和消化道仍保持著原有的特征，因此仍然劃分在食肉目[1-2]。

腸道是動(dòng)物機(jī)體最主要的消化器官，負(fù)責(zé)食物營(yíng)養(yǎng)素的消化吸收。腸道中的原籍微生物和外籍微生物與腸上皮細(xì)胞、未被消化的食物、食物殘?jiān)跋鞴俜置诘哪懼?、消化酶、黏液、激素等共同組成動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境。哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量占食物殘?jiān)^大部分，以不致病的益生菌為主，主要有大腸桿菌、鏈球菌、蠟樣芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、酵母菌，雙歧桿菌、固氮菌等。這些益生菌可以產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、腐殖酸酶及B族維生素，進(jìn)一步分解動(dòng)物腸道內(nèi)的食物殘?jiān)箘?dòng)物便于吸收利用和排出糞便，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育起一定的促進(jìn)作用[3-4]。與益生菌并存于動(dòng)物腸道的有一定量的條件致病菌，如產(chǎn)氣莢膜梭菌、致病性大腸桿菌、綠膿桿菌等。這些益生菌和條件致病菌共生，將動(dòng)物腸道食物殘?jiān)^續(xù)進(jìn)行分解，腸道內(nèi)細(xì)菌和動(dòng)物相處在一個(gè)和諧共同受益的環(huán)境中，稱共生生物[5-6]。

大熊貓作為我國(guó)特有的一種珍稀野生動(dòng)物，其腸道內(nèi)主要共生著哪些益生菌，使其在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了特有的飲食特征，目前相關(guān)的研究報(bào)道較少。本研究從陜西省秦嶺大熊貓繁育基地隨機(jī)無菌采集健康大熊貓新鮮糞便數(shù)份，采用微生物學(xué)方法從糞便中分離鑒定大熊貓腸道的益生菌，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1 材料

1.1.1 樣品 健康大熊貓糞便若干份，采自陜西省秦嶺大熊貓繁育基地，低溫下2h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.1.2 主要試劑 普通肉湯、普通瓊脂平板、沙堡弱氏液體培養(yǎng)基、沙堡弱氏瓊脂平板、乳酸菌平板、綿羊血瓊脂平板，各種生化試驗(yàn)用培養(yǎng)基均參考文獻(xiàn)[7]制備。藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)用動(dòng)物 健康小鼠和家兔，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 取適量新鮮大熊貓糞便無菌操作接種普通肉湯，37℃培養(yǎng)24h后高溫處理20min，再劃線接種普通瓊脂平板和綿羊血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18h～24h；另取適量新鮮大熊貓糞便接種含有一定抑菌劑的沙堡弱液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h～36h后，取培養(yǎng)液劃線接種于沙堡弱瓊脂平板，28℃ 培養(yǎng)24h；再另取部分新鮮糞便分別接種普通肉湯和乳酸菌肉湯，37℃培養(yǎng) 24h進(jìn)行增菌，然后取增菌培養(yǎng)液接種于乳酸菌平板及綿羊血瓊脂平板。挑取各瓊脂平板上的疑似菌落接種于相應(yīng)斜面，37℃或28℃培養(yǎng)24h獲得純培養(yǎng)的疑似菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分離菌培養(yǎng)特性鑒定 將相應(yīng)斜面上的純分離菌分別接種到普通瓊脂平板、綿羊血瓊脂平板、沙堡弱瓊脂平板、乳酸菌平板等進(jìn)行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)特征，并挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.2.3 分離菌生理生化試驗(yàn) 分離菌的生理生化試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[7-8]的方法進(jìn)行。

1.2.4 分離菌的動(dòng)物致病性試驗(yàn) 將獲得的分離菌分別接種于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，37℃或28℃培養(yǎng)24h后，用比濁管測(cè)定菌液濃度。將36只小鼠隨機(jī)分為2組，一組為腹腔注射組，另一組為灌服組。腹腔注射組0.2mL/只，灌服組0.5mL/只，每株分離菌注射3只、口服3只，另外3只作為正常對(duì)照隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察 7d。家兔致病性試驗(yàn)腹腔注射分離菌液體培養(yǎng)物 2mL/只，灌服 5mL/只。腹腔注射后隔離飼養(yǎng)，連續(xù)觀察 3d。如未見異常則進(jìn)行灌服試驗(yàn)，繼續(xù)觀察7d。觀察時(shí)注意小鼠和家兔的食欲、精神等是否出現(xiàn)不良反應(yīng)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行分離菌的藥敏試驗(yàn)。根據(jù)抑菌環(huán)直徑大小，判斷細(xì)菌對(duì)相應(yīng)抗菌藥物的敏感程度。試驗(yàn)中用到的藥敏紙片有復(fù)方新諾明、萬古霉素、頭孢曲松、阿米卡星、諾氟沙星、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢吡肟、克拉霉素、大觀霉素、四環(huán)素、麥迪霉素、苯唑西林、哌拉西啉、慶大霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、頭孢呋辛、頭孢噻肟、左氟沙星、米諾霉素、氯霉素、卡那霉素、頭孢噻吩、氨芐西林、青霉素、氧氟沙星、頭孢他啶、氨曲南、頭孢西丁、妥布霉素、克林霉素、呋喃妥因等。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果及分離菌生物學(xué)特性

共分離到3株革蘭陽性桿菌和2株革蘭陽性球菌，3株革蘭陽性桿菌分別用YM-1、YM-2和YM-3；2株革蘭陽性球菌分別用XM-1和YU-1表示，它們的生物學(xué)特性如下：

YM-1，革蘭陽性大芽胞桿菌，鏡檢時(shí)單個(gè)或長(zhǎng)鏈狀排列，芽孢位于菌體末端，無菌毛，無莢膜。普通瓊脂平板上37℃培養(yǎng) 24h，形成灰色、表面干燥、扁平、有皺紋、邊緣不整齊的大菌落；在綿羊血瓊脂平板上形成β溶血，形態(tài)特征與普通瓊脂平板上的一致。

YM-2，革蘭陽性短小芽胞桿菌，鏡檢時(shí)散在排列，芽孢位于菌體中心，無菌毛、無莢膜。普通瓊脂平板上37℃培養(yǎng) 24h，形成灰白色、表面光滑濕潤(rùn)、圓形凸起、邊緣整齊的大菌落；在綿羊血瓊脂平板上形成β溶血，形態(tài)特征與普通瓊脂平板上的一致。

YM-3，革蘭陽性小芽胞桿菌，鏡檢時(shí)散在排列，芽胞位于菌體次末端，無菌毛，無莢膜。普通瓊脂平板上37℃培養(yǎng) 24h ，形成灰白色、表面光滑濕潤(rùn)、圓形凸起，邊緣整齊的中等大小菌落；在綿羊血瓊脂平板上形成β溶血，形態(tài)特征與普通瓊脂平板上的一致。

XM-1，革蘭陽性大球菌，鏡檢時(shí)散在排列，有芽生現(xiàn)象，老齡培養(yǎng)菌呈革蘭陰性球菌，無芽胞，無菌毛，無莢膜。在沙堡弱平板37℃培養(yǎng) 24h，大菌落，圓形，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊。

YU-1，革蘭陽性鏈狀球菌，鏡檢時(shí)呈球形鏈狀排列，老齡菌為革蘭陰性，血清肉湯中的培養(yǎng)物鏡檢時(shí)呈長(zhǎng)鏈狀排列。在乳酸菌瓊脂平板上37℃培養(yǎng) 24h，形成圓形、透明、濕潤(rùn)、邊緣整齊的小菌落；在綿羊血瓊脂平板上形成α溶血，傳代次數(shù)多時(shí)無溶血現(xiàn)象。

2.2 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

YM-1、YM-2和YM-3的生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果見表1。結(jié)合表1結(jié)果，參考文獻(xiàn)[9-10]可以得出，YM-1生理生化試驗(yàn)結(jié)果符合蠟樣芽胞桿菌，YM-2生理生化試驗(yàn)結(jié)果符合凝結(jié)芽胞桿菌，YM-3生理生化試驗(yàn)結(jié)果符合枯草芽胞桿菌。

XM-1的生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果見表2。結(jié)合表2結(jié)果，參考文獻(xiàn)[10]，XM-1生理生化試驗(yàn)結(jié)果符合糞鏈球菌特征。

YU-1在好氧條件下培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)緩慢且發(fā)酵葡萄糖有淡淡的醋酸味，其芽殖呈尖狀，初步確定屬于酒香酵母菌屬或德克酵母屬或伊尼拉酵母屬，其生理生化試驗(yàn)結(jié)果見表3。結(jié)合表3結(jié)果，參考文獻(xiàn)[10-11]，YU-1基本符合德克酵母屬的間型酵母菌特征。

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì) YM-1、YM-2、YM-33株分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)藥敏紙片判斷標(biāo)準(zhǔn)，YM-1對(duì)氨曲南、氨芐西林、苯唑西林、頭孢噻肟、多黏菌素、青霉素、復(fù)方新諾、頭孢呋辛、頭孢他啶均有一定的耐藥性；對(duì)慶大霉素、紅霉素、氯霉素、左氟沙星、頭孢曲松、米諾霉素、環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、萬古霉素、阿米卡星等都敏感。YM-2對(duì)頭孢曲松、氨曲南、頭孢噻肟、氨芐西林、頭孢他啶、頭孢吡肟、多黏菌素、青霉素、復(fù)方新諾、頭孢呋辛都呈現(xiàn)較強(qiáng)的耐藥性；對(duì)米諾霉素、頭孢哌酮、紅霉素、四環(huán)素、萬古霉素、氯霉素、克拉霉素、克林霉素、阿米卡星都高度敏感。YM-3對(duì)頭孢噻吩、氨芐西林、氨曲南、多黏菌素、復(fù)方新諾、苯唑西林、頭孢呋辛、頭孢吡肟都具有一定耐藥性；對(duì)紅霉素、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、左氟沙星、頭孢吡酮、氧氟沙星、克拉霉素都有較高的敏感性。

YM-1、YM-2、YM-33株分離菌對(duì)氨曲南、氨芐西林、多粘菌素、復(fù)方新諾、頭孢呋辛等均不敏感。

表1 分離芽胞菌生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Biochemical test results of isolated Bacillus

表2 XM-1生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Biochemical tests results of XM-1

表3 YU-1生化試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Biochemical tests results of YU-1

2.4 動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果

采用麥?zhǔn)蠞岱y(cè)定各分離菌菌液濃度如表4。

表4 各分離菌菌液濃度Table 4 Concentrations of bacterial solution of all isolated bacteria 個(gè)/mL

正常對(duì)照小鼠隔離飼養(yǎng)期間全部健康存活，蠟樣芽胞桿菌注射組中小鼠3h內(nèi)死亡1只，同組另2只小鼠存活?？诜灅友堪麠U菌的小鼠12h內(nèi)出現(xiàn)呆立、扎堆、精神萎靡、食欲不振等不良現(xiàn)象，48h后恢復(fù)正常?？莶菅堪麠U菌、凝結(jié)芽胞桿菌、酵母菌、糞鏈球菌注射、灌服組小鼠均存活，注射組未出現(xiàn)不良反應(yīng)，灌服組在12h內(nèi)出現(xiàn)了呆立、扎堆、精神萎靡等不良現(xiàn)象，但48h后不良現(xiàn)象均消失，飲食、精神恢復(fù)正常。

所有家兔在注射5株分離菌后均存活，連續(xù)觀察3d，無不良反應(yīng)出現(xiàn)；再接著灌服相應(yīng)分離菌株，12h內(nèi)出現(xiàn)輕微精神萎靡、呆立，但對(duì)飲食影響不明顯，24h后以上不良現(xiàn)象均消失。

3 討論

大熊貓為草食動(dòng)物，其腸道存在著大量益生菌，這些益生菌為動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育提供了很好的條件，它們產(chǎn)生的蛋白酶、淀粉酶、酸性物質(zhì)、B族維生素等分解動(dòng)物腸道食物殘?jiān)阌趧?dòng)物再次吸收利用，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。臨床上，益生菌主要用于動(dòng)物胃腸道菌群失調(diào)和某些腸胃疾病的治療。

用分離到的5株菌進(jìn)行小鼠和家兔致病性試驗(yàn)，注射蠟樣芽胞桿菌的小鼠死亡1只，將小鼠解剖后未見小鼠有異常癥狀，推測(cè)可能是操作不當(dāng)引起的；雖然灌服組的小鼠和家兔在灌服后12h內(nèi)出現(xiàn)了呆立、扎堆、精神萎靡等不良現(xiàn)象，但隨后不良現(xiàn)象均消失，飲食、精神恢復(fù)正常，這種不良現(xiàn)象應(yīng)該是應(yīng)激反應(yīng)造成的。小鼠和家兔致病性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明這些分離菌為大熊貓腸道的益生菌。

譚志等[12]指出，大熊貓?jiān)谝跃暳蠟橹魇车娜︷B(yǎng)期間，腸道內(nèi)的腸桿菌和乳酸菌的數(shù)量較多，通過腸桿菌和乳酸菌對(duì)多糖、蛋白質(zhì)的分解,有利于腸道黏膜對(duì)乳糖、乳蛋白等高蛋白性食物的消化吸收和利用。在大熊貓以高纖維性的竹子為主食后，腸道微生態(tài)平衡發(fā)生波動(dòng),細(xì)菌種類和分布發(fā)生變化，腸球菌增多，有利于在厭氧環(huán)境下腸球菌對(duì)纖維性食物的分解和利用。本次研究卻沒有從圈養(yǎng)的大熊貓糞便中分離到乳酸桿菌、雙歧桿菌及其他益生菌。熊焰等[13]研究表明，季節(jié)變化和年齡對(duì)大熊貓腸道內(nèi)細(xì)菌的含量有一定的影響，本研究采樣的月份為3月份，采集樣品的大熊貓主要為成年大熊貓。大熊貓腸道是否有存在乳酸桿菌、雙歧桿菌及其它益生菌？還是季節(jié)和年齡因素造成沒有分離到這些益生菌有待進(jìn)一步研究。

細(xì)菌素是細(xì)菌自身生產(chǎn)的一類殺菌物質(zhì),由基因編碼、核糖體合成,是自然界中細(xì)菌用于調(diào)節(jié)自身菌群結(jié)構(gòu)的一類重要活性物質(zhì)。大量體外試驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)菌素對(duì)食源性(如李斯特菌、空腸彎曲菌、沙門菌、大腸埃希菌等)、植物源性、動(dòng)物源性條件致病菌(沙門菌、大腸埃希菌等)、人源性(抗藥菌、金黃色葡萄球菌、肺炎球菌等)等各種臨床致病菌都具有良好的抑殺作用[14]，體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果也表明，細(xì)菌素能在體表用藥來治療由體表感染所致各種炎癥[15]。一些研究已經(jīng)表明，將產(chǎn)細(xì)菌素的菌株制備成益生素活菌制劑或?qū)⒓?xì)菌素作為飼料添加劑，可明顯提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度和飼料利用率[16]。本試驗(yàn)分離到的益生菌為大熊貓這方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

經(jīng)藥敏試驗(yàn)證實(shí)3株分離的芽胞桿菌對(duì)慶大霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、克林霉素、萬古霉素、阿米卡星等敏感，在今后大熊貓飼喂中應(yīng)盡量避免添加這類抗生素。

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Isolation and Identification of Probiotics from Giant Pandas in Qinling Mountains

ZHANG Man1,PAN Guang-lin2,LIANG Wu-long3,WANG Hua3,LI Ran3,ZHANG Rui3,CHAI Jia3,YE Chao3,ZHANG Yao-xiang3,LIU Zai-chao4

(1.CollegeofAnimalEngineering，YanglingVocational&TechnicalCollege，Yangling,Shaanxi,712100,China；2.ShaanxiWildAnimalRescueandBreedingCenter,Zhouzhi,Shaanxi,712100,China；3.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China;4.BeijingShunyiDistrictAnimalHealthSupervision,Beijing,101300,China)

For the study of giant pandas intestinal probiotics,faeces of healthy panda from Shaanxi Wild Animal Rescue and Breeding Center were obtained sterilely.Three strains which were Gram-positive bacilli were isolated and identified asBacilluscereus，BacillussubtilisandBacilluscoagulansthrough biological characteristics and biochemical tests.Additionally,through the experiments of biological characteristics and biochemistry,two strains which were Gram-positive cocci were identified asSaccharomycesandStreptococcusfaecalis.Experiments of intraperitoneal injection of 0.2mL or gavage of 0.5mL to mice and intraperitoneal injection of 2mL and gavage of 5mL to rabbits showed that the isolates are all probiotics and can be used for the following study of the giant panda probiotic preparations.

giant panda; feces; probiotics; isolation and identification

2015-04-09

西北農(nóng)林科技大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新項(xiàng)目；科技創(chuàng)新與成果轉(zhuǎn)化(Z222021310)

張 曼(1979-)，女，陜西涇陽人，副教授，博士，主要從事臨床獸醫(yī)與獸藥制劑研究。*通訊作者

S865.31

B

1007-5038(2016)01-0125-05