鄭小龍，王 群，鄧明俊，張曉文，孫明君，朱來華

(山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266002)

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西方馬腦炎病毒TaqMan MGB熒光定量RT-PCR檢測方法的建立

鄭小龍，王 群，鄧明俊，張曉文，孫明君，朱來華

(山東出入境檢驗檢疫局，山東青島 266002)

通過RT-PCR從西方馬腦炎病毒(WEEV)中擴增得到1317bp特異的保守序列，將其克隆到pMD-20T載體中，進行體外轉(zhuǎn)錄，制備標準品cRNA。以10倍比稀釋的cRNA為模板，進行TaqMan MGB熒光定量RT-PCR擴增并制作標準曲線，建立了WEEV熒光定量RT-PCR檢測方法。對建立的方法進行了特異性和敏感性試驗。結(jié)果表明，建立的熒光定量RT-PCR方法最低可檢測10拷貝的cRNA；且與馬鼻肺炎病毒(EHV-1)、馬動脈炎病毒(EAV)、馬流感病毒(EIV,H3N8)、西尼羅病毒(WNV)、東方馬腦炎病毒(EEEV)和日本腦炎病毒(JEV)不發(fā)生交叉反應(yīng)。與常規(guī)RT-PCR相比，該方法更加快速，特異性和敏感性更高,靈敏度為常規(guī)RT-PCR方法的100倍。

西方馬腦炎病毒；TaqMan MGB；熒光定量RT-PCR

西方馬腦炎病毒(Wastern equine encephalitis virus,WEEV)屬于披膜病毒科甲病毒屬，是引起西方馬腦炎的病原體。該病毒可經(jīng)呼吸道傳播感染，但主要通過蚊蟲傳播[1]。西方馬腦炎可引起人和馬發(fā)病，病馬常呈亞臨床癥狀，病死率低于30%；WEEV對人的致死率明顯低于東方馬腦炎病毒[2-5]。該病在北美西部呈地方性流行，主要分布于加拿大、美國西部和中部，南美一些國家也有該病發(fā)生，如巴西、阿根廷、智利、秘魯和烏拉圭等國家[6]。

西方馬腦炎在我國也有報道，1990年何海懷等[7]從新疆烏蘇縣采集的按蚊和博樂縣采集的全溝硬蜱中分離出WEEV。呂新軍等[8]在對我國人體血清調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，WEEV抗體的陽性率為2.71%，但在馬屬動物中的流行情況未見相關(guān)報道。隨著我國馬術(shù)運動的發(fā)展，國際馬術(shù)比賽的日益頻繁，我國進出境馬匹的數(shù)量也在不斷增加。為保障我國養(yǎng)馬業(yè)的健康發(fā)展，保證國際賽事的順利進行，建立快速、敏感、特異的WEEV 熒光定量RT-PCR檢測方法十分必要。本試驗針對WEEV E1基因，篩選高度保守的片段，設(shè)計引物和探針，建立WEEVTaqMan MGB 熒光定量RT-PCR，并對其敏感性和特異性進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及核酸 馬鼻肺炎病毒(EHV-1)、馬動脈炎病毒(EAV)、馬流感病毒(H3N8)、西尼羅病毒(WNV)RNA、東方馬腦脊髓炎病毒(EEEV)RNA、西方馬腦炎病毒(WEEV)RNA和日本腦炎病毒(JEV)RNA均由山東檢驗檢疫技術(shù)中心實驗室保存。

1.1.2 臨床樣品 荷蘭進口馬血樣18份，美國進口馬血樣12份，俄羅斯進口馬血樣12份，由山東檢驗檢疫技術(shù)中心實驗室收集并保存。

1.1.3 試劑 DNA/RNA提取試劑盒、連接試劑盒、DH5α、pMD20T和DNA Marker DL 2000均為TaKaRa公司產(chǎn)品；One-step RT-PCR試劑盒、TaqPCR mastermix為Qiagen公司產(chǎn)品；TaqMan RT- PCR試劑盒為ABI公司產(chǎn)品；SP6RiboMax Large Scale RNA Production System為Promega公司產(chǎn)品；其他試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物、探針的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的WEEV基因序列，利用Mega 5.0軟件進行分析，選擇保守區(qū)域，利用Primer Express 5.0軟件設(shè)計引物，用于標準陽性模板的制備。引物序列：T1:5′-TTCGAACATGCGACCACTGTGC-3′；T2:5′-TCTACGTGTGTTTATAAGCAT-3′。根據(jù)熒光定量RT-PCR要求，利用Primer Express 3.0軟件在選取的保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計熒光定量RT-PCR引物和探針。引物和探針序列：P1：5′-GCGGGTCCCTCGAGTGTAA-3′；P2：5′-CAAAAACGCGGCATGTGTAA-3′；Probe：5′-NED-CATCCTCAAAGGCG-MGB-3′。引物和探針均由英駿生物科技有限公司合成。

1.2.2 WEEV基因特異性保守片段的擴增 以WEEV RNA為模板，加入適量T1、T2；5×RT-PCR buffer；dNTP和Enzyme mix進行RT-PCR擴增。反應(yīng)條件為： 50℃ 30min；94℃ 15min；94℃ 30s，58℃ 45s，72℃ 45s，35個循環(huán)；72℃ 10min。反應(yīng)完畢，取5μL擴增產(chǎn)物，于10g/L瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳緩沖液中以100V電壓進行電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結(jié)果。

1.2.3 標準陽性模板的制備 用T1和T2引物按照1.2.1的方法進行RT-PCR擴增，將RT-PCR產(chǎn)物按試劑盒說明書進行切膠回收，連接至pMD20-T載體，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單個菌落，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，挑選經(jīng)PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒,送英駿生物科技有限公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒命名為pMD20T-WEE。

選用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ將重組質(zhì)粒pMD20T-WEE進行線性化，并純化回收，用SP6RiboMax Large Scale RNA Production System試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)無RNase的DNase消化后除去其中的DNA，然后用RNeasy Kit 進行純化，制備出所需的cRNA。用核酸蛋白分析儀測定cRNA濃度，計算拷貝數(shù)。

1.2.4 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化 以樣本閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)、產(chǎn)物熒光值、標準曲線斜率和相關(guān)系數(shù)等為標準，分別對熒光RT-PCR反應(yīng)體系中的引物濃度(100、200、400、600、800nmol/L)，探針濃度(50、100、200、300、400nmol/L)和反應(yīng)參數(shù)中循環(huán)數(shù)(35、40、45個循環(huán))、反應(yīng)溫度(58、60、62℃)進行優(yōu)化。

1.2.5 標準曲線的建立 用10倍系列稀釋法處理pMD20T-WEE cRNA標準品。取7個濃度梯度 (108、107、106、105、104、103拷貝和102拷貝) cRNA標準品作為模板，以優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)進行熒光RT-PCR 反應(yīng)。根據(jù)實時熒光RT-PCR 的動力學曲線，檢測儀系統(tǒng)自動生成標準曲線及回歸方程。

1.2.6 熒光定量RT-PCR方法特異性和敏感性試驗 分別提取EHV-1、EAV、H3N8、WNV、JEV、WEEV和EEEV的核酸，用所建立的熒光定量RT-PCR進行檢測，用ddH2O作為陰性對照。收集熒光信號，檢測其特異性。

用ddH2O對標準模板進行10×系列稀釋，取1copies/μL～1.0×108copies/μL用所建立的熒光定量RT-PCR方法對各個稀釋度的樣品進行檢測，同時應(yīng)用常規(guī)RT-PCR進行檢測。

1.2.7 臨床樣品檢測 應(yīng)用建立的熒光RT-PCR方法和常規(guī)RT-PCR對荷蘭進口的馬血樣18份，美國進口馬血樣12份，俄羅斯進口馬血樣12份進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 標準陽性模板的制備

將擴增得到的WEEV基因特異性保守片段克隆至pMD20T載體中，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒制備出所需的cRNA作為陽性模板，對其進行RT-PCR鑒定，得到1317bp的片段(圖1)。經(jīng)序列測定，擴增得到的特異性保守序列與GenBank中登陸序列同源性達到100%。

2.2 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件確立

為確保熒光定量RT-PCR的高效性、特異性及敏感性，對其反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行了優(yōu)化。由試驗結(jié)果可知，反應(yīng)的最佳引物和探針濃度分別為400nmol/L和200nmol/L，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為45個循環(huán)。

2.3 標準曲線的建立

利用試劑盒純化pMD20T-WEE cRNA標準品，測定其OD值，通過公式計算得到其濃度為2.3×1010copies/μL。稀釋cRNA至1.0×1010copies/μL作為母液備用。

標準曲線：把含有1.0×1010copies/μL的cRNA母液10倍比稀釋，分別以1×102～1.0×108

copies/μL稀釋度的cRNA為標準品進行熒光定量RT-PCR，以起始模板的拷貝數(shù)為橫坐標，以Ct值為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果見圖2。由圖2可知，Ct值與拷貝數(shù)濃度在1×102copies/μL～1.0×108copies/μL之間呈線性關(guān)系，標準曲線方程式為y=49.28-3.72logx，R2=0.999。

M.DNA 標準DL 2000；1，2.cRNA RT-PCR產(chǎn)物
M.DNA Marker DL 2000；1，2.RT- PCR products of cRNA

圖1 cRNA的RT-PCR鑒定
Fig.1 RT-PCR identification of cRNA

圖2TaqMan MGB熒光定量RT-PCR檢測WEEV的標準曲線
Fig.2 Standard curve of WEEV detected byTaqMan MGB real-time PCR

2.4 熒光定量RT-PCR方法特異性、敏感性

用建立的TaqMan MGB熒光定量RT-PCR方法對EHV-1、EAV、H3N8、WNV、JEV、WEEV和EEEV陽性樣本進行檢測，只有WEEV樣本呈現(xiàn)擴增曲線(圖3)。將cRNA標準品10倍稀釋，進行擴增，擴增曲線見圖4，由圖4可知，所建立的檢測方法在10copies/μL時，仍有熒光曲線,拷貝數(shù)濃度在1copies/μL時，無擴增。核酸濃度為1.0×103copies/μL時普通RT-PCR后電泳可見到清晰條帶(圖5)，進一步稀釋檢測不到目的條帶，因此所建立方法的靈敏度為常規(guī)RT-PCR方法的100倍。

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果

用建立的方法對42份進口馬血樣進行檢測，結(jié)果顯示，陽性對照出現(xiàn)擴增曲線，陰性對照無擴增曲線，試驗成立，42份馬血樣均未出現(xiàn)擴增曲線，WEEV檢測為陰性。同時用普通RT-PCR方法對其檢測，二者符合率為100%。

圖3 WEEV熒光定量RT-PCR檢測方法特異性分析
Fig.3 Analytical specificity of the real-time RT-PCR for WEEV

圖4 WEEV熒光定量RT-PCR檢測方法敏感性分析
Fig.4 Analytical sensitivity of the real-time RT-PCR for WEEV

M.DNA 標準DL 2000;1～7.1.0×107copies/μL～1.0×101copies/μL cRNA RT-PCR 產(chǎn)物;8.空白對照
M.DNA Marker DL 2000;1-7.1.0×107-1.0×101copies/μL cRNA RT-PCR products;8.Blank

圖5 WEEV RT-PCR檢測敏感性分析
Fig.5 Analytical sensitivity of the RT-PCR for WEEV

3 討論

西方馬腦炎是一種人獸共患病，主要通過蚊蟲傳播給人和馬等動物，主要侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)，病毒感染率較高，病愈后多留有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[9]。由于該病屬于急性病毒性人獸共患傳染病，被國際社會列為生物恐怖的主要病原之一。隨著經(jīng)濟全球化的發(fā)展，國際間馬匹的交流也越來越頻繁，建立快速高效敏感的WEEV檢測方法，對于保障人們的健康和預防疫情的暴發(fā)具有重要意義。

目前，對于WEE的診斷主要是通過病原學和血清學兩個方面。病原學診斷雖然可以確診，但是費時費力，檢出率低，且需要在生物安全三級以上實驗室中進行操作。血清學診斷中ELISA尚無商品化的試劑盒，血凝抑制試驗受主觀因素影響較大，而且血清學方法存在著與其他病毒的交叉反應(yīng)問題[9]。RT-PCR方法是一種快速敏感的檢測方法[10-12]，在一定程度上解決了上述問題，但比熒光熒光定量RT-PCR其檢測特異性、靈敏度及檢測速度均稍遜一籌[13-15]。因此，建立WEEV的熒光定量RT-PCR檢測方法就顯的尤其重要。

本試驗以WEEV E1基因為目標基因，應(yīng)用MEGA5.0軟件對其進行分析，篩選保守片段，制備標準品cRNA，設(shè)計引物及MGB探針，建立了WEEV的TaqMan MGB熒光定量RT-PCR方法。根據(jù)樣本閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)、產(chǎn)物熒光值、標準曲線斜率和相關(guān)系數(shù)等，對熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系進行了優(yōu)化，最終確定循環(huán)數(shù)為45個循環(huán)，反應(yīng)溫度為60℃,引物濃度為400nmol/L，探針濃度為200nmol/L。用建立的熒光定量RT-PCR對EHV-1、EAV、H3N8、WNV、JEV、EEEV和WEEV陽性樣本進行擴增，只有WEEV樣本呈現(xiàn)擴增曲線，說明該方法特異性高，與其他馬屬動物病毒無交叉反應(yīng)。將制備的cRNA標準品10倍稀釋，進行擴增，當每個反應(yīng)加入10拷貝的cRNA時可以穩(wěn)定地檢測到擴增信號，但當加入1拷貝的cRNA時，檢測不到擴增信號。因此該方法的最低檢測限為10拷貝。用普通RT-PCR可檢測到103拷貝的cRNA，因此本試驗建立的熒光定量RT-PCR方法的靈敏度是普通RT-PCR方法的100倍。將所建立的方法應(yīng)用于臨床檢測，其與普通RT-PCR方法的檢測結(jié)果一致。因近期血液樣品保存較少，無法進行大量的臨床應(yīng)用，我們會在后期的日常檢測中進行進一步的應(yīng)用與驗證。

綜上所述，本試驗建立了靈敏、快速、特異的WEEVTaqMan MGB熒光定量RT-PCR檢測方法，該方法在進出境動物檢驗檢疫、流行病學調(diào)查及病原鑒定中具有重要的應(yīng)用價值。

[1] 王林林，楊 宇，王 旺，等.西方馬腦炎病毒抗體快速檢測試紙條的研制[J].中國媒介生物學及控制雜志,2011,22(5):421-423．

[2] Monath T P． Arthropod-borne encephalitis in the Americas[J].Bull WHO,1979,57:513-533．

[3] 何海懷，呂新軍，楊益良．我國分離的兩株病毒為重組甲病毒[J].中華實驗和臨床病毒學雜志，2001，15(2): 120-124.

[4] 谷 強，吳亞瓊，高志強，等.西部馬腦脊髓炎病毒實時熒光RT-PCR檢測方法建立及標準質(zhì)控品制備[J].中國動物檢疫，2013，30(11):80-84.

[5] Steven D Z,Susan A J,Joseph G,et al.Quadraplex qRT-PCR assay for the simultaneous detection of Eastern equine encephalitis virus and West Nile virus[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2013,77:129-132.

[6] 汪中明，趙彤言.西方馬腦炎的媒介、宿主及影響其傳播的環(huán)境因素[J].中國媒介生物學及控制雜志,2007，18(6):530-533.

[7] 何海懷，呂新軍，楊益良，等．我國分離的2株病毒為重組甲病毒[J]．中華實驗和臨床病毒學雜志，2001，15(2)：120-124．

[8] 呂新軍，付士紅，楊益良，等．我國分離的XJ-290260病毒鑒定為西方馬腦炎病毒[J]．病毒學報，2001，17(4)：307-312．

[9] Calisher C H．Medically important arboviruses of the United States and Canada[J]．Clin Microbiol Rev，1994(7):89-116．

[10] 徐 倩，謝芝勛，謝麗基，等.禽流感病毒H9和N2亞型雙重RT-PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學進展，2015，36(1):11-15.

[11] 吳媛瓊，謝芝勛，胡庭俊，等.H4亞型禽流感病毒套式RT-PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學進展，2015，36(2):11-15.

[12] 王 黎，李 碧，周遠成，等.豬傳染性胃腸炎病毒RT-PCR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學報，2015，35(2):190-194.

[13] 王楠楠，劉 芳，許 漩，等.坦布蘇病熒光定量RT-PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學，2015，45(1):15-19.

[14] 千莎莎，何 彪，涂忠忠，等.委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒一步法熒光定量RT-PCR方法的建立[J].病毒學報，2015，31(2):107-113.

[15] 溫青娜，周其偉，周玲玲.鑒別歐洲型和美洲型PRRSV熒光定量RT-PCR方法的建立[J].動物醫(yī)學進展，2013，34(3):51-57.

Development ofTaqMan MGB Real-time PCR for Detection of Western Equine Encephalitis Virus

ZHENG Xiao-long,WANG Qun,DENG Ming-jun,ZHANG Xiao-wen,SUN Ming-jun,ZHU Lai-hua

(ShandongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Qingdao,Shandong,266002,China)

The 1317bp specific and consensus sequence of Western equine encephalitis virus (WEEV) was amplified by RT-PCR and cloned into plasmid pMD-20T,RNA was transcribedinvitrousing linearised plasmid DNA.Serial dilutions of cRNA were used as standard templates for real-time RT-PCR to quantify the genomic copy number of WEEV．We developed aTaqMan MGB real-time RT-PCR to detect WEEV.Sensitivity analysis showed that the developedTaqMan MGB real-time RT-PCR could detect 10copies/μL．The specificity assay exhibited that negative control and the other equine pathogens could not be detected.The result demonstrated a 100fold sensitivity of the real-time RT-PCR assay was developed compared with gel-based real-time RT-PCR method.

Western equine encephalitis virus;TaqMan MGB;real-time RT-PCR

2015-06-09

國家質(zhì)檢總局科技項目(2014IK240)

鄭小龍(1979-)，男，山東平邑人，高級獸醫(yī)師，碩士，主要從事進出境動物檢疫研究。

S855.3

A

1007-5038(2016)01-0006-05